Summary
Здесь мы представляем циклическую модель внутрисуставного хрящевого поражения колена крысы, вызванную циклической нагрузкой, вызванной 60 циклическими компрессиями более 20 Н, что приводит к повреждению бедренного кондилерного хряща у крыс.
Abstract
Патофизиология первичного остеоартрита (ОА) остается неясной. Однако специфическая подклассификация ОА в относительно более молодых возрастных группах, вероятно, коррелирует с историей повреждения суставного хряща и авульсии связок. Хирургические животные модели ОА колена играют важную роль в понимании начала и прогрессирования посттравматического ОА и помогают в разработке новых методов лечения этого заболевания. Тем не менее, недавно были рассмотрены нехирургические модели, чтобы избежать травматического воспаления, которое может повлиять на оценку вмешательства.
В этом исследовании была разработана модель внутрисуставного поражения хряща крыс, индуцированная циклической сжимающей нагрузкой in vivo , которая позволила исследователям (1) определить оптимальную величину, скорость и продолжительность нагрузки, которые могут вызвать очаговое повреждение хряща; (2) оценить посттравматические пространственно-временные патологические изменения жизнеспособности хондроцитов; и (3) оценить гистологическую экспрессию деструктивных или защитных молекул, которые участвуют в механизмах адаптации и восстановления против суставных сжимающих нагрузок. В этом отчете описывается экспериментальный протокол для этого нового поражения хряща на модели крысы.
Introduction
Традиционно трансекция передней крестообразной связки (ACL) или дестабилизация медиального мениска считается оптимальной для исследования посттравматического остеоартрита (ПТОА) у мелких животных. В последние годы для изучения ПТОА использовались неинвазивные циклические компрессионные модели. Эта модель была первоначально разработана для исследования реакции костной ткани на механическую нагрузку1, а затем была модифицирована как нехирургическая модель на животных для исследований PTOA 2,3,4,5,6. Обоснование состоит в том, чтобы столкнуть суставной хрящ путем применения периодической внешней силы, которая вызывает серию воспалительных реакций. Однако эта модель была применена только к мышам, и соответствующая величина нагрузки на более крупных животных не обсуждалась.
Другая проблема с предыдущей моделью заключается в том, что протокол большого объема включал слишком много циклов, что вызывало чрезмерное утолщение субхондральной кости, нежелательный побочный эффект, в нескольких образцах7. Поэтому был разработан новый метод циклического сжатия с соответствующей величиной для крупных животных и более низким побочным эффектом нагрузки8. Общей целью данной статьи является описание протокола неинвазивной циклической компрессионной модели у крыс и наблюдение за репрезентативными результатами дегенерации хряща. Текущий протокол поможет читателям, заинтересованным в применении неинвазивной модели циклического сжатия на крысах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был одобрен Комитетом по исследованиям животных Киотского университета (номер одобрения: Med kyo 17616).
1. Выполните циклическое сжатие in vivo на колене крысы
- Индуцировать экспериментальную анестезию животных
- Индуцировать анестезию у 12-недельной крысы Вистар (256,8 ± 8,7 г) путем вдыхания 5% раствора изофлурана в анестезиологическом боксе.
- Внутрибрюшинно вводят смесь трех анестетиков9, включая медетомидин, мидазолам и буторфанол, при 2 мг/кг массы тела крысы и сбривают область вокруг правого коленного сустава. Подтвердите достаточную анестезию отсутствием педального рефлекса к защемлению пальца ноги.
- Установите анестезированную крысу на фиксирующее устройство.
- Поместите обезболенную крысу, лежащую на животе на опорной пластине (рисунок 1), с правым коленом, прикрепленным к небольшому кусочку смолы с вогнутой канавкой. Поместите правую заднюю конечность в положение разгибания бедра, сгибания колена и разгибания лодыжки, при этом колено согнуто примерно на 140°. Разместите пятку крысы на клиновидной канавке на подвижном приспособлении.
- Переместите фиксирующее устройство к прибору для испытания на напряжение/растяжение (см. Таблицу материалов). Убедившись, что контакты с тензодатчиком отсутствуют, откройте программное обеспечение для управления прибором для испытания на напряжение/растяжение (Таблица материалов) и нажмите кнопку Калибровка . После калибровки аккуратно прикрепите верхнюю часть рамы к тензодатчику. Чтобы коленный сустав был плотно прикреплен к раме, медленно включайте поворотную ручку на подвижной основной операционной панели, пока предварительная нагрузка не достигнет 5 Н.
- Создайте метод загрузки и настройте тест сжатия.
- В Главном меню выберите команду Создать новый метод | Системная метка. Установите для параметра Тестовый режим значение Цикл, а для параметра Тип теста — значение Сжатие. Нажмите на метку Датчик и выберите вкладку Тест , чтобы убедиться, что предел находится в пределах 60 Н. Кроме того, выберите вкладку «Обводка» и убедитесь, что ограничение находится в пределах 500 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанный шаг немедленно остановит операцию, если есть большое смещение на точке напряжения. - Под контрольной меткой Тестирование выберите Происхождение роста , чтобы запустить основную программу с 0,3% / полная шкала. Из четырех секций в цикле загрузки установите скорость хода в управлении в1-й и3-й секциях на 1 мм/с. Установите максимальное испытательное усилие во2-й секции на 20 Н, а минимальное испытательное усилие в4-м участке на 5 Н. Установите "Длительность удержания" на 0,5 с для пиковой нагрузки и 10 с для минимальной нагрузки (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку этот этап определяет каждый цикл, убедитесь, что суставные поверхности находятся в контакте друг с другом и движутся с разумной скоростью и что движение поддерживается. - На вкладке Предварительная загрузка в нижней части страницы убедитесь, что установлен флажок Вкл ., скорость удаления отклонения установлена на 100 мм/мин, а максимальное усилие равно 5 Н. В метке Образец установите Материал как Металл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти подробные настройки могут быть специфичными для каждого производителя. - В главном меню в разделе Выбор метода и теста выберите только что созданный метод и нажмите кнопку Пуск , чтобы начать тест.
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице внизу показаны фактические измерения пиковой нагрузки и смещения. - Установите число циклов равным 60.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь сеанс загрузки включает в себя 60 циклов, которые длятся примерно 12 минут. В контрольной группе крысы подвергались предварительной загрузке 5 Н в течение 12 мин предварительной нагрузки в тех же условиях.
- В Главном меню выберите команду Создать новый метод | Системная метка. Установите для параметра Тестовый режим значение Цикл, а для параметра Тип теста — значение Сжатие. Нажмите на метку Датчик и выберите вкладку Тест , чтобы убедиться, что предел находится в пределах 60 Н. Кроме того, выберите вкладку «Обводка» и убедитесь, что ограничение находится в пределах 500 мм.
- После загрузки верните крысу в клетку и следите за полным выздоровлением. Поддерживайте 12-12 ч светло-темный график в клетке с достаточным пространством и пищей ad libitum. После необходимых экспериментальных периодов приносят в жертву крысам при передозировке смесь трех анестетиков, вводимых внутрибрюшинно или ингаляцией углекислого газа для анализа (1 ч-8 недель).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Получен репрезентативный результат кратковременных изменений (1 ч и 12 ч) жизнеспособности хондроцитов в образцах, подвергшихся циклической нагрузке 20 Н. Как показано на рисунке 3, количество мертвых хондроцитов (красная флуоресценция) увеличилось через 12 ч после травмы. И наоборот, количество живых хондроцитов (зеленая флуоресценция) продолжало уменьшаться, причем некоторые образцы не содержали живых хондроцитов в пораженной области.
Гистология показала, что суставной хрящ коленей крысы, подвергшийся динамической нагрузке 20 Н, был поврежден, и во всех образцах была подтверждена одна очаговая зона поражения в латеральном мыщелке бедренной кости (рисунок 4). Тем не менее, размер поражения не постепенно увеличивался в течение 8-недельного периода наблюдения. Граница, которая соответствовала границе раздела поражения и непораженного хряща, могла наблюдаться в пораженной области.
Рисунок 1: Фиксирующее устройство состоит из опорной плиты и фиксирующего устройства. Опорная плита (длина: 27,5 см, ширина: 13 см) имеет смоляную вогнутую канавку (длина: 0,8 см, ширина: 0,4 см) на задней стороне для размещения согнутого коленного сустава крысы. Фиксирующий аппарат имеет клиновидную канавку (ширина канавки: 1,5 см, глубина канавки: 1 см), которая вмещает пятку крысы, которая вложена в опорную пластину между двумя металлическими стержнями. Верхняя часть фиксирующего устройства будет находиться в непосредственном контакте с тензодатчиком прибора для испытания на напряжение/растяжение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Профиль нагрузки для одного цикла загрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пространственно-временная оценка жизнеспособности хондроцитов в области поражения. После жертвоприношения коленный сустав рассекали и отделили с помощью небольших щипцов и ножниц. Растворы пятен кальциина AM и EthD-1 получали путем разбавления оригинального набора (Таблица материалов) на 1:500 и 1:4000 в 5 мл PBS соответственно. Образцы инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Контрольные образцы погружались в PBS в тех же условиях. Флуоресцентные изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа (Таблица материалов) с использованием флуоресцеина изотиоцианата (495 нм/519 нм) и йодида пропидия (535 нм/617 нм) каналов. Жизненно важные хондроциты демонстрировали зеленую флуоресценцию, тогда как мертвые клетки флуоресцировали красным. По сравнению с хондроцитами в контрольных образцах (А), количество мертвых хондроцитов на нагруженном колене крысы увеличивалось через 1 ч (В) и занимало большую часть площади в пораженной области через 12 ч (С). Зеленая и красная флуоресценция представляют области живых и мертвых хондроцитов соответственно. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: кальцеин АМ = кальциин ацетоксиметиловый эфир; EthD-1 = гомодимер этидия-1; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный сафранин O окрашивание мыщелка бедренной кости в нагруженном колене. Слайд, показывающий сагиттальные участки латерального мыщелка бедренной кости, которые были окрашены сафранином O/Fast Green и раствором гематоксилина. По сравнению с контролем интенсивность окрашивания сафранином О в пораженном участке снижалась после загрузки, и наблюдалась четкая граница (стрелка) верхнего/кальцинированного хряща. Шкала стержней = 100 мкм. Аббревиатура: w = неделя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Впервые текущий протокол показывает, как установить модель вызванного нагрузкой поражения хряща на боковом мыщелке бедренной кости у крыс, аналогичную модели внутрисуставного повреждения у более мелких грызунов, таких как мышь2. Однако протокол загрузки у мышей вызывал тяжелое образование остеофита и поражения крестообразных связок, что не было идеальным для оценки эффектов циклического сжатия. Текущий протокол создал очаговое поражение хряща у крыс с гораздо меньшей нагрузочной силой. Правильные настройки метода загрузки имеют решающее значение для протокола, потому что только соответствующая величина, скорость и продолжительность стресса могут разрушить хрящ, не повреждая костную ткань.
Установка предела смещения (этап протокола 1.3.1) также имеет решающее значение, поскольку он немедленно останавливает инструмент в случае разрыва связок или если крыса просыпается от анестезии во время сеанса нагрузки. Оптимальную максимальную нагрузку и возраст крысы еще предстоит определить. Однако в предварительных экспериментах нагрузка более 50 Н приводила к высокой вероятности разрыва ПКС в коленях крысы. Кроме того, текущую модель трудно воспроизвести у более старых (>36 недель) крыс, возможно, из-за жесткости хряща по мере роста.
Хотя порог разрушительной нагрузки для молодых крыс не был определен, считается, что будущие исследования должны поддерживать максимальную нагрузку ниже 20 Н для наблюдения за любым анаболическим воздействием на хрящ. Объем и локализацию области поражения было относительно легко установить, даже для новичков в этой области, что оценивалось по хондроцитарно-дегенеративному объему в каждом образце, который потенциально был сосредоточен на последующей оценке вмешательства в относительно узкой области хряща.
Гистологическое окрашивание показало, что объем области поражения был относительно устойчивым в течение 8-недельного периода наблюдения. Тем не менее, оценки Манкина постоянно ухудшались, в то время как оценки окрашивания матрицы и распределения клеток увеличивались в пораженной области. Более того, наблюдалось явное цветовое отклонение между средним слоем и кальцинированным хрящом, которое показало, что межсуставное сжатие затронуло только хрящ над приливным пятном.
Напротив, за исключением легкой фибрилляции в редких образцах, целостность хряща оставалась в значительной степени нетронутой на протяжении всего периода наблюдения, что отличается от моделей прогрессирующего повреждения ОА10. Поэтому нехирургическая модель может быть лучше для оценки очаговых поражений, вызванных столкновением хряща, которые чаще встречаются при спортивных травмах. В будущем текущая модель будет использоваться для оценки воздействия лекарств или физической терапии, таких как терапия гипертермии и аэробные упражнения для суставов, на травматическое повреждение хряща. Кроме того, анаболизм хондроцитов и катаболизм в ответ на циклическую механическую стимуляцию также могут быть подтверждены in vivo у животных с использованием этой модели.
Нынешний протокол имеет ряд ограничений. Сначала исследовались только поражения хряща на латеральном мыщелке бедренной кости. Поражение на боковой большеберцовой кости также должно быть оценено в будущих исследованиях. Во-вторых, пораженная часть суставного хряща, изученная в текущем протоколе, не была основной несущей областью при ходьбе. Из-за неоднородности хряща жесткость внутрисуставного хряща может отличаться от части, исследованной в текущем исследовании. Таким образом, эти выводы могут быть использованы только в качестве ссылки. Наконец, модель не показала какого-либо значительного прогрессирования дегенерации хряща, что является важной особенностью развития ОА. Дальнейшие исследования могут сочетать инвазивную хирургию с предварительно загруженными поражениями для наблюдения пространственно-временных изменений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантом JSPS KAKENHI (номера JP18H03129 и JP18K19739).
Это исследование также получило финансирование от Альянса по исследованиям и обучению регенеративной реабилитации (AR3T), который поддерживается Национальным институтом детского здоровья и развития человека имени Юнис Кеннеди Шрайвер (NICHD), Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) и Национальным институтом биомедицинской визуализации и биоинженерии (NIBIB) Национальных институтов здравоохранения под номером награды P2CHD086843. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
- De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
- Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
- Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
- Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
- Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
- Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
- Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
- Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).
