Summary
Hier präsentieren wir das zyklisch belastungsinduzierte intraartikuläre Knorpelläsionsmodell des Rattenknies, das durch 60 zyklische Kompressionen über 20 N erzeugt wird, was bei Ratten zu einer Schädigung des femoralen Kondylenknorpels führt.
Abstract
Die Pathophysiologie der primären Arthrose (OA) bleibt unklar. Eine spezifische Subklassifizierung von OA in relativ jüngeren Altersgruppen korreliert jedoch wahrscheinlich mit einer Vorgeschichte von Gelenkknorpelschäden und Bänderavulsion. Chirurgische Tiermodelle von OA des Knies spielen eine wichtige Rolle beim Verständnis des Beginns und des Fortschreitens von posttraumatischer OA und helfen bei der Entwicklung neuartiger Therapien für diese Krankheit. In jüngster Zeit wurden jedoch nicht-chirurgische Modelle in Betracht gezogen, um traumatische Entzündungen zu vermeiden, die die Bewertung des Eingriffs beeinträchtigen könnten.
In dieser Studie wurde ein intraartikuläres Knorpelläsionsmodell entwickelt, das durch zyklische In-vivo-Druckbelastung induziert wurde, das es den Forschern ermöglichte, (1) die optimale Größe, Geschwindigkeit und Dauer der Belastung zu bestimmen, die fokale Knorpelschäden verursachen könnte; (2) Beurteilung posttraumatischer raumzeitpathologischer Veränderungen der Chondrozytenvitalität; und (3) die histologische Expression von destruktiven oder schützenden Molekülen zu bewerten, die an den Anpassungs- und Reparaturmechanismen gegen gemeinsame Druckbelastungen beteiligt sind. Dieser Bericht beschreibt das experimentelle Protokoll für diese neuartige Knorpelläsion in einem Rattenmodell.
Introduction
Traditionell wurde die Durchtrennung des vorderen Kreuzbandes (ACL) oder die Destabilisierung des medialen Meniskus als optimal für die Untersuchung der posttraumatischen Osteoarthritis (PTOA) bei Kleintieren angesehen. In den letzten Jahren wurden nicht-invasive zyklische Kompressionsmodelle verwendet, um PTOA zu untersuchen. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um die spongiöse Knochenreaktion auf mechanische Belastung1 zu untersuchen und wurde dann als nicht-chirurgisches Tiermodell für die PTOA-Studien 2,3,4,5,6 modifiziert. Die Begründung besteht darin, den Gelenkknorpel durch Anwendung einer periodischen äußeren Kraft zu kollidieren, die eine Reihe von Entzündungsreaktionen auslöst. Dieses Modell wurde jedoch nur auf Mäuse angewendet, und das angemessene Ausmaß der Belastung größerer Tiere wurde nicht diskutiert.
Ein weiteres Problem des Vorgängermodells besteht darin, dass das Protokoll mit hohem Volumen zu viele Zyklen enthielt, was in mehreren Proben zu einer übermäßigen Verdickung des subchondralen Knochens führte, einer unerwünschten Nebenwirkung7. Daher wurde eine neuartige Methode der zyklischen Kompression mit der entsprechenden Größenordnung für große Tiere und einem geringeren Belastungsnebeneffekt entwickelt8. Das übergeordnete Ziel des vorliegenden Artikels ist es, das Protokoll des nicht-invasiven zyklischen Kompressionsmodells bei Ratten zu beschreiben und die repräsentativen Ergebnisse der Knorpeldegeneration zu beobachten. Das aktuelle Protokoll würde Lesern helfen, die an der Anwendung des nicht-invasiven zyklischen Kompressionsmodells bei Ratten interessiert sind.
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Protocol
Das Protokoll wurde vom Tierforschungskomitee der Universität Kyoto genehmigt (Zulassungsnummer: Med kyo 17616).
1. Führen Sie eine zyklische In-vivo-Kompression am Rattenknie durch.
- Experimentelle Tieranästhesie induzieren
- Induktion einer Anästhesie bei einer 12 Wochen alten Wistar-Ratte (256,8 ± 8,7 g) durch Einatmen von 5% iger Isofluranlösung in der Anästhesiebox.
- Intraperitoneal injizieren Sie eine Mischung aus drei Anästhetika9, einschließlich Medetomidin, Midazolam und Butorphanol, bei 2 mg/kg des Körpergewichts der Ratte und rasieren Sie den Bereich um das rechte Kniegelenk. Bestätigen Sie eine ausreichende Betäubung durch fehlenden Pedalreflex zu einem Zehenklemmen.
- Montieren Sie die betäubte Ratte auf der Fixiervorrichtung.
- Legen Sie die betäubte Ratte auf dem Bauch liegend auf die Grundplatte (Abbildung 1), wobei das rechte Knie an einem kleinen Stück Harz mit einer konkaven Rille befestigt ist. Platzieren Sie die rechte Hinterbeine in der Hüftstreckung, Kniebeugung und Knöchelstreckposition, wobei das Knie um ca. 140° gebeugt ist. Bringen Sie die Ferse der Ratte an der keilförmigen Nut der beweglichen Halterung unter.
- Bewegen Sie die Fixiervorrichtung zum Spannungs-/Zugprüfgerät (siehe Werkstofftabelle). Nachdem Sie sichergestellt haben, dass keine Kontakte mit der Wägezelle vorhanden sind, öffnen Sie die Steuerungssoftware für Spannungs-/Zugprüfgeräte (Materialtabelle) und klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrierung . Befestigen Sie nach der Kalibrierung die Oberseite des Rahmens vorsichtig an der Wägezelle. Um das Kniegelenk eng mit dem Rahmen zu verbinden, drehen Sie den Drehknopf am beweglichen Hauptbedienfeld langsam ein, bis die Vorspannung 5 N erreicht.
- Erstellen Sie eine Lademethode und richten Sie den Drucktest ein.
- Klicken Sie im Hauptmenü auf Neue Methode erstellen | Systembezeichnung . Legen Sie Testmodus auf Zyklus und Testtyp auf Komprimierung fest. Klicken Sie auf das Sensoretikett und wählen Sie die Registerkarte Test , um zu überprüfen, ob der Grenzwert innerhalb von 60 N liegt. Wählen Sie außerdem die Registerkarte Strich und überprüfen Sie, ob die Grenze innerhalb von 500 mm liegt.
HINWEIS: Der obige Schritt stoppt den Vorgang sofort, wenn es eine große Verschiebung am Spannungspunkt gibt. - Wählen Sie unter der Bezeichnungsbezeichnung Teststeuerelement die Option Ursprung des Wachstums aus, um das Hauptprogramm mit 0,3 %/Skalenendwert zu starten. Stellen Sie von den vier Abschnitten in einem Ladezyklus die Hubgeschwindigkeit im 1. und 3. Abschnitt auf 1 mm/s ein. Stellen Sie die maximale Prüfkraft im 2. Abschnitt auf 20 N und die minimale Prüfkraft im 4. Abschnitt auf 5 N ein. Stellen Sie "die Haltedauer" auf 0,5 s für die Spitzenlast und 10 s für die Mindestlast ein (Abbildung 2).
HINWEIS: Da dieser Schritt jeden Zyklus definiert, stellen Sie sicher, dass die Gelenkflächen miteinander in Kontakt stehen und sich mit einer angemessenen Geschwindigkeit bewegen und dass die Bewegung beibehalten wird. - Stellen Sie auf der Registerkarte Vorspannung unten auf der Seite sicher, dass Ein aktiviert ist, die Geschwindigkeit der Umlenkungsentfernung auf 100 mm/min eingestellt ist und die maximale Kraft 5 N beträgt. Legen Sie in der Probenbeschriftung das Material auf Metall fest.
HINWEIS: Diese detaillierten Einstellungen können für jeden Hersteller spezifisch sein. - Wählen Sie im Hauptmenü im Abschnitt Methode und Test auswählen die soeben erstellte Methode aus und klicken Sie auf Start , um den Test zu starten.
HINWEIS: Die Tabelle unten zeigt die tatsächlichen Messungen der Spitzenlast und -verschiebung. - Stellen Sie die Anzahl der Zyklen auf 60 ein.
HINWEIS: Die gesamte Ladesitzung umfasst 60 Zyklen, die ca. 12 Minuten dauern. In der Kontrollgruppe wurden die Ratten unter den gleichen Bedingungen einer 5-N-Vorladung für 12 Minuten Vorladung unterzogen.
- Klicken Sie im Hauptmenü auf Neue Methode erstellen | Systembezeichnung . Legen Sie Testmodus auf Zyklus und Testtyp auf Komprimierung fest. Klicken Sie auf das Sensoretikett und wählen Sie die Registerkarte Test , um zu überprüfen, ob der Grenzwert innerhalb von 60 N liegt. Wählen Sie außerdem die Registerkarte Strich und überprüfen Sie, ob die Grenze innerhalb von 500 mm liegt.
- Nach dem Laden die Ratte in ihren Käfig zurückbringen und bis zur vollständigen Genesung überwachen. Halten Sie einen 12-12 h Hell-Dunkel-Zeitplan im Käfig mit ausreichend Platz und Futter ad libitum ein. Nach den erforderlichen Versuchszeiten opfern Sie die Ratten mit einer Überdosis der Mischung der drei Anästhetika, die intraperitoneal injiziert wurden, oder Kohlendioxidinhalation zur Analyse (1 h-8 Wochen).
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Representative Results
Ein repräsentatives Ergebnis der kurzfristigen Veränderungen (1 h und 12 h) der Chondrozytenlebensfähigkeit in Proben, die einer zyklischen Belastung von 20 N ausgesetzt waren, wurde erhalten. Wie in Abbildung 3 gezeigt, stieg die Anzahl der toten Chondrozyten (rote Fluoreszenz) 12 h nach dem Trauma an. Umgekehrt nahm die Anzahl lebender Chondrozyten (grüne Fluoreszenz) weiter ab, wobei einige Proben keine lebenden Chondrozyten im betroffenen Bereich enthielten.
Die Histologie zeigte, dass der Gelenkknorpel der Rattenknie, die einer dynamischen Belastung von 20 N ausgesetzt waren, beschädigt war, und eine fokale Läsionszone wurde in allen Proben im lateralen Femurkondylen bestätigt (Abbildung 4). Die Läsionsgröße nahm jedoch während des 8-wöchigen Beobachtungszeitraums nicht progressiv zu. Die Grenze, die der Grenzfläche der Läsion und des nicht betroffenen Knorpels entsprach, konnte im betroffenen Bereich beobachtet werden.
Abbildung 1: Die Fixiervorrichtung besteht aus einer Grundplatte und einer Fixiervorrichtung. Die Grundplatte (Länge: 27,5 cm, Breite: 13 cm) hat eine harzkonkave Rille (Länge: 0,8 cm, Breite: 0,4 cm) auf der hinteren Seite, um das gebeugte Kniegelenk der Ratte aufzunehmen. Die Fixiervorrichtung hat eine keilförmige Nut (Rillenbreite: 1,5 cm, Rillentiefe: 1 cm), die die Ferse der Ratte aufnimmt, die in der Grundplatte zwischen zwei Metallstangen eingebettet ist. Die Oberseite der Fixiervorrichtung steht in direktem Kontakt mit der Wägezelle des Spannungs-/Zugprüfgeräts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Lastprofil für einen Ladezyklus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Raumzeitliche Beurteilung der Chondrozytenlebensfähigkeit im Läsionsbereich. Nach dem Opfer wurde das Kniegelenk mit einer kleinen Pinzette und einer Schere seziert und getrennt. Lösungen von Calcein-AM- und EthD-1-Färbungen wurden hergestellt, indem das Originalkit (Table of Materials) bei 1:500 bzw. 1:4.000 in 5 ml PBS verdünnt wurde. Die Proben wurden für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Kontrollproben wurden unter den gleichen Bedingungen in PBS eingetaucht. Fluoreszenzbilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Table of Materials) unter Verwendung von Fluoresceinisothiocyanat (495 nm/519 nm) und Propidiumiodid (535 nm/617 nm) Kanälen aufgenommen. Die vitalen Chondrozyten zeigten eine grüne Fluoreszenz, während tote Zellen rot fluoreszierten. Im Vergleich zu den Chondrozyten in Kontrollproben (A) war die Anzahl der toten Chondrozyten auf dem belasteten Rattenknie nach 1 h (B) erhöht und besetzte den größten Teil der Fläche in der betroffenen Region nach 12 h (C). Grüne und rote Fluoreszenz repräsentieren die Regionen der lebenden bzw. toten Chondrozyten. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzungen: Calcein AM = Calcein-Acetoxymethylester; EthD-1 = Ethidiumhomodimer-1; PBS= phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Safranin-O-Färbung des Oberschenkelkondylus im belasteten Knie. Ein Dia mit den sagittalen Abschnitten des lateralen Femurkondylus, die mit einer Safranin O/Fast Green und Hämatoxylinlösung gefärbt wurden. Im Vergleich zur Kontrolle war die Safranin-O-Färbeintensität im betroffenen Bereich nach der Belastung vermindert und eine klare Grenze (Pfeil) des oberen/verkalkten Knorpels wurde beobachtet. Maßstabsbalken = 100 μm. Abkürzung: w = Woche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Zum ersten Mal zeigt das aktuelle Protokoll, wie ein Modell der belastungsinduzierten Knorpelläsion auf dem lateralen Femurkondylen bei Ratten etabliert werden kann, ähnlich dem intraartikulären Schadensmodell bei kleineren Nagetieren wie der Maus2. Das Belastungsprotokoll bei Mäusen verursachte jedoch eine schwere Osteophytenbildung und Kreuzbandläsionen, was für die Bewertung der Auswirkungen einer zyklischen Kompression nicht ideal war. Das aktuelle Protokoll erzeugte eine fokale Knorpelläsion bei Ratten mit einer viel geringeren Belastungskraft. Die richtigen Einstellungen der Belastungsmethode sind für das Protokoll von entscheidender Bedeutung, da nur die entsprechende Größe, Geschwindigkeit und Dauer der Belastung den Knorpel zerstören kann, ohne das Knochengewebe zu schädigen.
Die Einstellung der Verdrängungsgrenze (Protokollschritt 1.3.1) ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da sie das Instrument im Falle eines Bandrisses oder wenn die Ratte während der Belastungssitzung aus der Narkose aufwacht, sofort stoppt. Die optimale Maximalbelastung und das Alter der Ratte müssen noch bestimmt werden. In den Vorexperimenten führte jedoch eine Belastung von über 50 N zu einer hohen Wahrscheinlichkeit eines ACL-Bruchs in den Knien der Ratte. Darüber hinaus ist das aktuelle Modell bei älteren (>36 Wochen alten) Ratten schwer zu reproduzieren, möglicherweise aufgrund der Steifigkeit des Knorpels während des Wachstums.
Obwohl die destruktive Belastungsschwelle für jüngere Ratten nicht bestimmt wurde, wird angenommen, dass zukünftige Studien die maximale Belastung unter 20 N halten sollten, um anabole Auswirkungen auf den Knorpel zu beobachten. Der Umfang und die Lokalisation des Läsionsbereichs waren selbst für Neulinge relativ einfach zu bestimmen, wie anhand des chondrozytendegenerativen Volumens in jeder Probe geschätzt, das sich möglicherweise auf die anschließende Bewertung der Intervention in einem relativ engen Knorpelbereich konzentrierte.
Die histologische Färbung zeigte, dass der Umfang des Läsionsbereichs während des 8-wöchigen Beobachtungszeitraums relativ stabil war. Mankins Werte verschlechterten sich jedoch kontinuierlich, während die Matrixfärbung und die Zellverteilungswerte im betroffenen Bereich zunahmen. Darüber hinaus gab es eine offensichtliche Farbabweichung zwischen der mittleren Schicht und dem verkalkten Knorpel, was zeigte, dass nur der Knorpel oberhalb der Gezeitenmarke von der interartikulären Kompression betroffen war.
Im Gegenteil, abgesehen von leichtem Flimmern in seltenen Proben blieb die Integrität des Knorpels während des gesamten Beobachtungszeitraums weitgehend intakt, was sich von den Modellen für progressive OA-Verletzungen unterscheidet10. Daher kann ein nicht-chirurgisches Modell besser für die Beurteilung von kollisionsinduzierten fokalen Läsionen der Knorpelschnittstelle geeignet sein, die bei Sportverletzungen häufiger auftreten. Mit dem aktuellen Modell sollen künftig die Auswirkungen von Medikamenten oder physikalischen Therapien wie Hyperthermietherapie und aerobem Gelenktraining auf traumatische Knorpelschäden abgeschätzt werden. Darüber hinaus konnten Chondrozytenanabolismus und Katabolismus als Reaktion auf zyklische mechanische Stimulation auch in vivo an Tieren mit diesem Modell validiert werden.
Das aktuelle Protokoll hatte mehrere Einschränkungen. Zunächst wurden nur Knorpelläsionen am lateralen Femurkondylen untersucht. Die Läsion an der lateralen Tibia sollte auch in zukünftigen Studien untersucht werden. Zweitens war der läsionierte Teil des Gelenkknorpels, der im aktuellen Protokoll untersucht wurde, nicht die Hauptbelastungsregion während des Gehens. Aufgrund der Heterogenität des Knorpels kann die Steifigkeit des intraartikulären Knorpels von dem in der aktuellen Studie untersuchten Teil abweichen. Daher können diese Erkenntnisse nur als Referenz verwendet werden. Schließlich zeigte das Modell kein signifikantes Fortschreiten der Knorpeldegeneration, die ein wichtiges Merkmal der OA-Entwicklung ist. Weitere Studien könnten invasive Operationen mit vorbelasteten Läsionen kombinieren, um raumzeitliche Veränderungen zu beobachten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde teilweise durch einen JSPS KAKENHI-Zuschuss unterstützt (Nummern JP18H03129 und JP18K19739).
Diese Forschung wurde auch von der Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T) finanziert, die vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) der National Institutes of Health unter der Award-Nummer P2CHD086843 unterstützt wird. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
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