Summary
Här presenterar vi den cykliska belastningsinducerade intraartikulära brosklesionsmodellen av råttknäet, genererad av 60 cykliska kompressioner över 20 N, vilket resulterar i skador på femoralt kondylarbrosk hos råttor.
Abstract
Patofysiologin för primär artros (OA) är fortfarande oklar. En specifik underklassificering av OA i relativt yngre åldersgrupper är dock sannolikt korrelerad med en historia av ledbroskskador och ligamentavulsion. Kirurgiska djurmodeller av OA i knäet spelar en viktig roll för att förstå uppkomsten och utvecklingen av posttraumatisk OA och hjälpa till att utveckla nya terapier för denna sjukdom. Icke-kirurgiska modeller har dock nyligen övervägts för att undvika traumatisk inflammation som kan påverka utvärderingen av interventionen.
I denna studie utvecklades en intraartikulär broskskada råttmodell inducerad av in vivo cyklisk tryckbelastning, vilket gjorde det möjligt för forskare att (1) bestämma den optimala storleken, hastigheten och varaktigheten av belastningen som kan orsaka fokal broskskada; (2) bedöma posttraumatiska spatiotemporala patologiska förändringar i kondrocytens vitalitet; och (3) utvärdera det histologiska uttrycket av destruktiva eller skyddande molekyler som är involverade i anpassnings- och reparationsmekanismerna mot gemensamma tryckbelastningar. Denna rapport beskriver det experimentella protokollet för denna nya broskskada i en råttmodell.
Introduction
Traditionellt har främre korsband (ACL) transsektion eller destabilisering av den mediala menisken ansetts vara optimal för att undersöka posttraumatisk artros (PTOA) hos små djur. Under de senaste åren har icke-invasiva cykliska kompressionsmodeller använts för att studera PTOA. Denna modell utformades ursprungligen för att undersöka det cancellösa bensvaret på mekanisk belastning1 och modifierades sedan som en icke-kirurgisk djurmodell för PTOA-studier 2,3,4,5,6. Motiveringen är att kollidera ledbrusk genom att applicera en periodisk yttre kraft, vilket utlöser en serie inflammatoriska svar. Denna modell har dock endast tillämpats på möss, och lämplig storlek på belastning på större djur har inte diskuterats.
Ett annat problem med den tidigare modellen är att högvolymprotokollet inkluderade för många cykler, vilket orsakade överdriven förtjockning av det subkondrala benet, en oönskad biverkning, i flera prover7. Därför utvecklades en ny metod för cyklisk kompression med lämplig storlek för stora djur och en lägre belastningsbieffekt8. Det övergripande målet med den aktuella artikeln är att beskriva protokollet för den icke-invasiva cykliska kompressionsmodellen hos råttor och observera de representativa resultaten av broskdegeneration. Det nuvarande protokollet skulle hjälpa läsare som är intresserade av tillämpningen av den icke-invasiva cykliska komprimeringsmodellen på råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet godkändes av djurforskningskommittén vid Kyoto University (godkännandenummer: Med kyo 17616).
1. Utför in vivo cyklisk kompression på råttknäet
- Inducera försöksdjuranestesi
- Inducera anestesi hos en 12 veckor gammal Wistar-råtta (256,8 ± 8,7 g) genom inandning av 5% isofluranlösning i anestesiboxen.
- Injicera intraperitonealt en blandning av tre bedövningsmedel9, inklusive medetomidin, midazolam och butorfanol, vid 2 mg/kg av råttans kroppsvikt, och raka området runt höger knäled. Bekräfta tillräcklig bedövning genom brist på pedalreflex till en tå-nypa.
- Montera den bedövade råttan på fixeringsanordningen.
- Placera den bedövade råttan liggande på magen på bottenplattan (figur 1), med höger knä fäst vid en liten bit harts med ett konkavt spår. Placera höger bakben i höftförlängningen, knäböjningen och fotledsförlängningspositionerna, med knäet böjt vid cirka 140 °. Rymma råttans häl på det kilformade spåret på den rörliga fixturen.
- Flytta fixeringsanordningen till spännings-/dragprovningsinstrumentet (se materialförteckningen). När du har kontrollerat att det inte finns några kontakter med lastcellen öppnar du styrprogramvaran för spännings-/dragprovningsinstrumentet (materialtabell) och klickar på kalibreringsknappen . Efter kalibrering, fäst toppen av ramen försiktigt på lastcellen. För att hålla knäleden nära fäst vid ramen, slå på vridknappen på den rörliga huvudoperationspanelen långsamt tills förspänningen når 5 N.
- Skapa en laddningsmetod och ställ in komprimeringstestet.
- På huvudmenyn klickar du på Skapa en ny metod | Systemetikett . Ställ in Testläge på Cykel och Testtyp på Komprimering. Klicka på sensoretiketten och välj fliken Test för att kontrollera att gränsen ligger inom 60 N. Välj dessutom fliken Linje och kontrollera att gränsen ligger inom 500 mm.
OBS: Ovanstående steg stoppar operationen omedelbart om det finns en stor förskjutning på spänningspunkten. - Under etiketten Testkontroll väljer du Tillväxtens ursprung för att starta huvudprogrammet med 0,3 %/full skala. Av de fyra sektionerna i en laddningscykel ställer du in slaghastigheten i kontrollen i sektionerna 1st och 3rd till 1 mm/s. Ställ in den maximala provningskraften i den 2:a sektionen på 20 N och den minsta provningskraften i den 4:e sektionen på 5 N. Ställ in "hålltiden" på 0,5 s för toppbelastningen och 10 s för minimibelastningen (figur 2).
OBS: Eftersom detta steg definierar varje cykel, se till att ledytorna är i kontakt med varandra och rör sig med en rimlig hastighet och att rörelsen bibehålls. - På fliken Förspänning längst ned på sidan, se till att På är markerat, Hastigheten för avböjningsborttagning är inställd på 100 mm/min och maximal kraft är 5 N. I provetiketten ställer du in materialet som metall.
Dessa detaljerade inställningar kan vara specifika för varje tillverkare. - I huvudmenyn, under avsnittet Välj metod och test, välj den metod som just byggdes och klicka på Start för att starta testet.
OBS: Tabellen längst ner visar de faktiska mätningarna av toppbelastning och förskjutning. - Ställ in antalet cykler till 60.
OBS: Hela laddningssessionen innehåller 60 cykler, som varar cirka 12 minuter. I kontrollgruppen genomgick råttor 5 N förladdning under 12 minuters förbelastning under samma förhållanden.
- På huvudmenyn klickar du på Skapa en ny metod | Systemetikett . Ställ in Testläge på Cykel och Testtyp på Komprimering. Klicka på sensoretiketten och välj fliken Test för att kontrollera att gränsen ligger inom 60 N. Välj dessutom fliken Linje och kontrollera att gränsen ligger inom 500 mm.
- Efter laddning, sätt tillbaka råttan till sin bur och övervaka tills full återhämtning. Håll ett 12-12 h ljusmörkt schema i buret med tillräckligt med utrymme och mat ad libitum. Efter de erforderliga experimentperioderna, offra råttorna med en överdos av blandningen av de tre bedövningsmedel som injiceras intraperitonealt eller koldioxidinandning för analys (1 h-8 veckor).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt resultat av de kortvariga förändringarna (1 h och 12 h) i kondrocytviabilitet i prover som utsattes för 20 N cyklisk belastning erhölls. Som visas i figur 3 ökade antalet döda kondrocyter (röd fluorescens) vid 12 timmar efter trauma. Omvänt fortsatte antalet levande kondrocyter (grön fluorescens) att minska, med vissa prover som inte innehöll några levande kondrocyter i det drabbade området.
Histologi visade att ledbrosket i råttknäna som genomgick 20 N dynamisk belastning skadades och en fokal lesionszon bekräftades i den laterala lårbenskondylen i alla prover (Figur 4). Lesionsstorleken ökade emellertid inte gradvis under den 8-veckors observationsperioden. Gränsen som motsvarade gränssnittet mellan lesionen och det opåverkade brosket kunde observeras i det drabbade området.
Figur 1: Fixeringsanordningen består av en basplatta och en fixeringsapparat. Basplattan (längd: 27,5 cm, bredd: 13 cm) har ett harts konkavt spår (längd: 0,8 cm, bredd: 0,4 cm) på bakre sidan för att rymma råttans böjda knäled. Fixeringsapparaten har ett kilformat spår (spårbredd: 1,5 cm, spårdjup: 1 cm) som rymmer råttans häl, som är kapslad i bottenplattan mellan två metallstänger. Toppen av fixeringsapparaten kommer att vara i direkt kontakt med belastningscellen i spännings-/dragprovningsinstrumentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Lastprofil för en belastningscykel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Spatiotemporal bedömning av kondrocytviabilitet i lesionsområdet. Efter offret dissekerades knäleden och separerades med små pincett och saxar. Lösningar av calcein AM- och EthD-1-fläckar framställdes genom utspädning av det ursprungliga kitet (materialtabell) vid 1:500 respektive 1:4 000 i 5 ml PBS. Proverna inkuberades i 20 minuter vid rumstemperatur. Kontrollprover nedsänktes i PBS under samma förhållanden. Fluorescensbilder erhölls med användning av ett fluorescensmikroskop (materialtabell) med användning av fluoresceinisotiocyanat (495 nm/519 nm) och propidiumjodid (535 nm/617 nm) kanaler. De vitala kondrocyterna visade grön fluorescens, medan döda celler fluorescerade rött. Jämfört med kondrocyterna i kontrollprover (A) ökade antalet döda kondrocyter på det laddade råttknäet vid 1 h (B) och upptog större delen av området i det drabbade området vid 12 h (C). Grön och röd fluorescens representerar regionerna för de levande respektive döda kondrocyterna. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: calcein AM = calcein acetoxymethyl ester; EthD-1 = etidiumhomodimer-1; PBS= fosfatbuffrad saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativ safranin O färgning av lårbenskondylen i det laddade knäet. En bild som visar sagittala sektioner av den laterala lårbenskondylen, som färgades med en safranin O / Fast Green och hematoxylinlösning. Jämfört med kontrollen minskade safranin O-färgningsintensiteten i det drabbade området efter belastning, och en tydlig kant (pil) av det övre / förkalkade brosket observerades. Skalstänger = 100 μm. Förkortning: w = vecka. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För första gången visar det aktuella protokollet hur man etablerar en modell av belastningsinducerad broskskada på den laterala lårbenskondylen hos råttor, liknande den intraartikulära skademodellen hos mindre gnagare som mus2. Belastningsprotokollet hos möss orsakade emellertid allvarlig osteofytbildning och korsbandsskador, vilket inte var idealiskt för att utvärdera effekterna av cyklisk kompression. Det nuvarande protokollet skapade en fokal broskskada hos råttor med en mycket lägre belastningskraft. Korrekta laddningsmetodinställningar är avgörande för protokollet eftersom endast lämplig storlek, hastighet och varaktighet av stress kan förstöra brosket utan att skada benvävnaden.
Att ställa in förskjutningsgränsen (protokollsteg 1.3.1) är också avgörande eftersom det omedelbart stoppar instrumentet vid ligamentbrott eller om råttan vaknar av anestesi under laddningssessionen. Den optimala maximala belastningen och råttans ålder återstår att bestämma. I de preliminära experimenten resulterade dock en belastning på över 50 N i en hög sannolikhet för ACL-bristning i råttans knän. Dessutom är den nuvarande modellen svår att reproducera hos äldre (>36 veckor gamla) råttor, möjligen på grund av broskets styvhet när tillväxten sker.
Även om den destruktiva belastningströskeln för yngre råttor inte bestämdes, tros det att framtida studier bör hålla den maximala belastningen under 20 N för att observera eventuella anabola effekter på brosket. Omfattningen och lokaliseringen av lesionsområdet var relativt enkelt att fastställa, även för de som var nya i fältet, vilket uppskattades av den kondrocytdegenerativa volymen i varje prov, som potentiellt fokuserade på den efterföljande utvärderingen av interventionen till ett relativt smalt broskområde.
Histologisk färgning visade att lesionsområdets omfattning var relativt stabil under den 8-veckors observationsperioden. Mankins poäng försämrades dock kontinuerligt medan matrisfärgningen och cellfördelningspoängen ökade i det drabbade området. Dessutom fanns det en uppenbar färgavvikelse mellan mellanskiktet och det förkalkade brosket, vilket illustrerade att endast brosket ovanför tidvattenmärket påverkades av den interartikulära kompressionen.
Tvärtom, bortsett från lindrigt fibrillering i sällsynta prover, förblev broskets integritet i stort sett intakt under hela observationsperioden, vilket skiljer sig från progressiva OA-skademodeller10. Därför kan en icke-kirurgisk modell vara bättre för bedömning av broskgränssnittskollisionsinducerade fokala lesioner, som är vanligare vid idrottsskador. I framtiden kommer den nuvarande modellen att användas för att bedöma effekterna av medicinering eller sjukgymnastik, såsom hypertermibehandling och aerob ledträning, på traumatisk broskskada. Dessutom kan kondrocytanabolism och katabolism som svar på cyklisk mekanisk stimulering också valideras in vivo hos djur med hjälp av denna modell.
Det nuvarande protokollet hade flera begränsningar. Först undersöktes endast broskskador på den laterala lårbenskondylen. Lesionen på lateral tibia bör också utvärderas i framtida studier. För det andra var den skadade delen av ledbrosket som studerades i det aktuella protokollet inte den huvudsakliga bärande regionen under gång. På grund av broskets heterogenitet kan styvheten hos det intraartikulära brosket skilja sig från den del som undersökts i den aktuella studien. Således kan dessa resultat endast användas som referens. Slutligen visade modellen ingen signifikant progression av broskdegeneration, vilket är ett viktigt inslag i OA-utvecklingen. Ytterligare studier kan kombinera invasiv kirurgi med förinstallerade lesioner för att observera spatiotemporala förändringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av ett JSPS KAKENHI-bidrag (nummer JP18H03129 och JP18K19739).
Denna forskning fick också finansiering från Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), som stöds av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) och National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) från National Institutes of Health under prisnummer P2CHD086843. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
- De Souza, R. L., et al. Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element. Bone. 37 (6), 810-818 (2005).
- Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model. Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).
- Wu, P., et al. Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets. Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).
- Poulet, B., et al. Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).
- Ko, F. C., et al. Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading. Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).
- Adebayo, O. O., et al. Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).
- Ko, F. C., et al. In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae. Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).
- Ji, X., et al. Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).
- Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).
- Iijima, H., et al. Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model. Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).
