Summary
Dit is een methode om baarmoederlymfecellen te isoleren van zowel zwangere als niet-zwangere muizen. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen zoals FACS-fenotypering, celsortering, functionele assays, RNA-seq en proteomics. Het protocol hier laat zien hoe groep 1 uteriene aangeboren lymfoïde cellen kunnen worden gefenotypeerd door flowcytometrie.
Abstract
Hier beschreven is een eenvoudige methode om muisgroep 1 uteriene geïnnate lymfoïde cellen (g1 uILCs) van individuele zwangere baarmoeder te isoleren en te fenotyperen door middel van flowcytometrie. Het protocol beschrijft hoe tijdparing kan worden ingesteld om meerdere synchrone dammen te verkrijgen, de mechanische en enzymatische spijsvertering van de zwangere baarmoeder, de kleuring van eencellige suspensies en een FACS-strategie om g1 uILCs te fenotyperen en te discrimineren. Hoewel deze methode onvermijdelijk de ruimtelijke informatie van cellulaire distributie in het weefsel verliest, is het protocol met succes toegepast om uILC-heterogeniteit, hun reactie op maternale en foetale factoren die de zwangerschap beïnvloeden, hun genexpressieprofiel en hun functies te bepalen.
Introduction
Hier beschreven is een eenvoudige methode om een hoge opbrengst van aangeboren baarmoederlymfocyten te verkrijgen van individuele zwangere baarmoeder. Deze methode behoudt de expressie van het eiwitoppervlak en de functionaliteit van aangeboren lymfocyten van de baarmoeder en is geschikt voor latere toepassingen zoals FACS-fenotypering, RNAseq, proteomics of functionele assays. Hier ligt de focus op de fenotypering van groep 1 uILCs door flowcytometrie.
De baarmoeder bestaat uit drie lagen: het endometrium, myometrium en perimetrium (figuur 1). Het endometrium is het slijmvlies, dat het lumen van de baarmoeder bekleedt. Progesteron, geproduceerd door het corpus luteum, zet het endometrium om in decidua. Het myometrium bestaat uit twee lagen gladde spieren die de baarmoederwand vormen. Het perimetrium is de serosa die de baarmoeder omwikkelt en verbindt met het peritoneum via het brede ligament mesometrium. In een dwarsdoorsnede van de baarmoeder wordt het deel tegenovergesteld aan het lumen de mesometriale kant genoemd, terwijl het deel dicht bij het lumen de anti-mesometriale kant wordt genoemd. Een verscheidenheid aan maternale leukocyten bevolken het endometrium en de decidua, waaronder verschillende soorten cellen, waarbij de aangeboren immuuncellen de overgrote meerderheid van de cellen vertegenwoordigen. Aangeboren lymfoïde cellen (ILCs), macrofagen, dendritische cellen (DC), evenals CD4 + en CD8 + T-lymfocyten, regulerende T-cellen (Tregs) en zeldzame B-cellen, kunnen allemaal een belangrijke rol spelen bij de regulatie van de baarmoederomgeving tijdens de zwangerschap1,2. ILCs in de baarmoeder worden niet alleen gevonden in het slijmvlies, maar ook in het myometrium bij muizen. Inclusief alle drie de groepen ILC's is de baarmoeder inderdaad het orgaan dat het dichtstbevolkt is door groep 1 ILCs. Met de structurele transformatie van baarmoederweefsels gedurende de zwangerschap veranderen ook het aantal en het aandeel baarmoederleukocyten (zie figuur 2A voor een voorbeeld van variaties in het percentage van groep 1 uILC-subgroepen)3,4.
Wanneer muizen in dit artikel worden genoemd, wordt de C57BL / 6-stam van inteelt laboratoriummuizen bedoeld. Gefokte muizen (bijv. NMRI-muizen) worden vaak gebruikt in reproductief onderzoek vanwege hun hoge reproductiesnelheid. Het gebruik van inteeltstammen is echter noodzakelijk om consistente resultaten te genereren, en de favoriete genetische achtergrond van de immunoloog is C57BL / 6, ook bekend als B6.
Ongeveer 30% van de baarmoederleukocyten in B6-moederdieren halverwege de dracht zijn g1 uILCs, die door flowcytometrie worden gedefinieerd als levensvatbare CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ cellen (figuur 2B): pro-angiogene weefselbewonende NK (trNK), IFN-g producerende conventionele NK (cNK) en uILC14,5. Het percentage uNK-cellen is nog hoger bij mensen en bereikt ongeveer 70% in het eerste trimester6. Er zijn meer overeenkomsten dan verschillen tussen mens en muis uNK en uILC7,8. Hoewel het belangrijk is om de verschillen in gedachten te houden, is het nuttig om de beschikbare informatie over de twee soorten te integreren. Wanneer men informatie combineert die is verkregen uit onderzoek naar uILC bij mensen en laboratoriumknaagdieren, is het duidelijk dat NK-cellen helpen bij homeostatische veranderingen die essentieel zijn voor de biologie van de baarmoeder, inclusief behoud van arteriële integriteit9 en spiraalvormige slagaderremodellering10, evenals trofoblastinvasie11,12. Ze spelen ook een specifieke rol in de verdediging tegen ziekteverwekkers13,14. Bij muizen en ratten hopen NK-cellen zich, naast het vullen van de decidua rond de implantatieplaats, op tussen de twee spierlagen van het myometrium van dammen in een voorbijgaande structuur die bekend staat als het Mesometriale lymfoïde aggregaat van de zwangerschap (MLAp)15 (figuur 1B), in het verleden ook bekend als de metriale klier, waarvan de functie nog moet worden ontdekt.
Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven van de methode die in het laboratorium wordt gebruikt om lymfocyten uit de baarmoeder van zwangere muizen te isoleren met behulp van een combinatie van mechanische desaggregatie en enzymatische spijsvertering. Omdat de hele baarmoeder in de methode wordt gebruikt, zijn lymfocyten die tijdens de zwangerschap uit de baarmoeder worden geïsoleerd een mengsel van decidale en myometriale cellen. Verdere dissectie van de decidua uit de baarmoederwand en zijn MLAp is mogelijk en is eerder beschreven16. De hier beschreven methode is ontwikkeld om baarmoederlymfocyten te verkrijgen met behoud van eiwitoppervlakexpressie, cellulaire functionaliteit en levensvatbaarheid. Het resultaat is een eencellige suspensie met minimaal resterend cellulair puin en een opbrengst die meestal varieert van 1-5 miljoen cellen halverwege de zwangerschap (10,5 dagen) voor een zwangere baarmoeder. De toepassingen van deze methode omvatten fenotypering door flowcytometrie, celsortering voor daaropvolgende transcriptomische of proteomische studies, functionele studies zoals intracellulaire cytokineproductie, degranulatie, ELISPOT of cytotoxische assays. Het hier gepresenteerde protocol richt zich op het identificeren van groep 1 ILCs, maar kan worden aangepast voor andere celtypen zoals andere ILCs, T-cellen, B-cellen, DC of macrofagen met kleine wijzigingen van het antilichaampaneel dat wordt gebruikt voor FACS-analyse. Het protocol kan ook worden gebruikt om cellen uit andere weefsels te isoleren en voor gepoolde niet-zwangere uteri.
Protocol
Alle dierproeven die in dit artikel worden beschreven, zijn uitgevoerd volgens de Animals (Scientific Procedures) Act 1986 onder PP2363781, uitgegeven door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken. Het onderstaande protocol bestaat uit verschillende secties die beginnen met muizenhouderij en eindigen met kleuring voor FACS-analyse. Figuur 3 geeft de belangrijkste stappen van het protocol weer. De materialen die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de materialentabel.
1. Algemene muizenhouderij, paring en dissectie
- Houd 7-14 weken oude vrouwelijke muizen onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden en groepshuisvesting (meestal 4-6 vrouwtjes volgens kooigrootte en diergewicht), gedurende 10-14 dagen om het Lee-Boot-effect te activeren, wat resulteert in oestrussynchronisatie17.
- Houd de dekreuen in SPF-omstandigheden, eenhuisvestig en uitgerust gedurende ten minste 48 uur tussen elke paring (tijd voor spermaregeneratie). Het verdient de voorkeur om ervaren bewezen 3-4 maanden oude dekhengsten te gebruiken, omdat ze meestal meer presteren dan de jongen.
- Om de kans te vergroten dat vrouwtjes zwanger worden, introduceert u vuil strooisel uit de kooi van een mannetje in de vrouwelijke kooi 3 dagen voorafgaand aan de paring. Dit veroorzaakt het Whitten-effect18 door blootstelling aan mannelijke urineferomonen en resulteert in gesynchroniseerde oestrus en verbeterde ontvankelijkheid voor paring.
- Stel op dag 0 (D0) de muizen in voor paring met één dekhengst per twee vrouwtjes; overweeg een plug rate van ongeveer 20%-25%.
OPMERKING: Paring zal waarschijnlijk 's nachts plaatsvinden, omdat muizen nachtdieren zijn. - Controleer 's ochtends na de paring (D0,5) op de aanwezigheid van een vaginale plug, wat een indicator is van copulatie (figuur 4). De vaginale plug is een aggregaat van het mannelijke ejaculaat en blijft meestal tot 8-24 uur na de paring bestaan. Controleer de stekkers vroeg in de ochtend.
- Consolideer de aangesloten vrouwtjes in een nieuwe kooi en oormerk ze. Breng de mannetjes terug naar hun kooien om te rusten.
- Bereid bij D9,5 of 10,5-na de paring 5 ml buisjes met 1 ml steriel HBSS 1x (met Mg2+ en Ca2+) voor weefselverzameling en plaats ze op ijs.
- Ga verder met dierlijke euthanasie door cervicale dislocatie, gevolgd door exsanguinatie om de dood te bevestigen.
- Werk in een steriele omgeving als de downstream-toepassing dit vereist. Veeg direct na euthanasie het muizenlichaam af met 70% ethanol en ga verder met dissectie onder een laminaire fluxkast met steriele instrumenten.
- Ontleed de zwangere baarmoeder vrij van mesometriaal vet (figuur 5) en plaats de hele baarmoeder in een voorbereide en op de juiste manier gelabelde buis van 5 ml. Houd de buizen op ijs.
2. Mechanische en enzymatische vertering van de baarmoeder
- Om de enzymatische verteringsoplossing te bereiden, mengt u 3 ml per baarmoeder steriel HBSS 1x met 30 μg / ml DNAse en 0,1 Wünsch-eenheid (WU) / ml Liberase DH of 0, 52 WU / ml Liberase TM. Doe de oplossing in een waterbad bij 37 °C.
OPMERKING: Zowel Liberase TM als Liberase DH kunnen worden gebruikt. De keuze van de ene boven de andere moet worden geleid door hun potentiële effect op epitopen die worden herkend door antilichamen die worden gebruikt voor daaropvolgende flowcytometrie-analyse.
LET OP: Als u gelyofiliseerde enzymen gebruikt, werk dan onder de motorkap. - Bereid 20 ml 5 mM EDTA in PBS (geen Ca2+/Mg2+). Leg de helft van de oplossing bij 37 °C in een waterbad en de andere helft op ijs.
- Verwijder onder een laminaire fluxkast voorzichtig het vet rond de zwangere baarmoeder met steriele instrumenten in een steriele petrischaal. Laat het weefsel niet drogen.
- Ontleed elke implantatieplaats met steriele instrumenten om de foetussen te verwijderen (zeepaardvormige doorschijnende structuur, ongeveer 1 mm lang) (figuur 6A). Gooi de foetussen weg.
- Breng de baarmoeder terug naar hun oorspronkelijke verzameling 5 ml buis en hak het weefsel met behulp van een schaar direct in de 5 ml buis en het verzamelmedium. Houd de buizen de hele tijd op ijs tussen de procedures door.
- Plaats de buisjes van 5 ml met het gehakte weefsel in een waterbad bij 37 °C.
- Voeg 3 ml warm enzymatisch spijsverteringsmengsel toe aan elk monster, zodat het totale volume vloeistof in de buis 4 ml is (1 ml opvangmedium met de gehakte baarmoeder en 3 ml enzymatische spijsverteringsoplossing). Incubeer de buizen van 5 ml gedurende 30 minuten bij 37 °C met agitatie om de enzymatische verteringsactiviteit te verbeteren.
- Vortex de 5 ml buizen en plaats ze op ijs om de werking van enzymen te remmen. Breng vervolgens de inhoud over in de correct gelabelde centrifugebuizen van 15 ml.
- Spoel alles uit de 5 ml buizen in de 15 ml centrifugebuizen met behulp van 10 ml ijskoude 5 ml EDTA PBS-oplossing.
- Centrifugeer de centrifugebuizen van 15 ml die de verteerde weefsels bevatten gedurende 10 minuten bij 400 x g.
- Gooi het supernatant weg, veeg voorzichtig met de pellet en suspendeer het vervolgens in 10 ml warme (37 °C) 5 mM EDTA PBS-oplossing.
- Incubeer de monsters in de centrifugebuizen van 15 ml bij 37 °C met roeren gedurende 15 minuten om het overgebleven verteringsmedium te verwijderen en de celklontering te verminderen.
- Vortex de monsters hoog gedurende 10 s om weefseldissociatie verder te vergemakkelijken.
3. Verwerking van de baarmoeder tot een eencellige suspensie
- Gebruik de zuiger van een steriele spuit van 1 ml en druk het verteerde weefsel door een zeef van 70 μm op een correct gelabelde en steriele centrifugebuis van 50 ml om de celklonten en het niet-geositocieerde weefsel te verwijderen.
- Was de zeef meerdere keren met in totaal 10 ml koude PBS om alle cellen te verzamelen.
- Draai de centrifugebuis van 50 ml gedurende 10 minuten op 400 x g.
OPMERKING: Voer de verdere stappen uit met optie A of optie B. Optie A maakt een betere verrijking van de lymfocyten mogelijk met minder vuil en stromale celbesmetting dan optie B. Optie B geeft echter een hogere immuuncelopbrengst door minder celverlies en minder variabiliteit van celopbrengst tussen monsters. Optie B is ook technisch eenvoudiger uit te voeren. Ga daarom, afhankelijk van uw voorkeur, verder met optie A of optie B.- De stappen voor optie A zijn als volgt.
- Label één steriele centrifugebuis van 15 ml per monster met 5 ml 80% (v/v) isotone percoll verdund in PBS.
- Gooi na de spin het supernatant weg uit de centrifugebuis van 50 ml. Gebruik een pipet boy om elke pellet te resuspenderen in 8 ml van 40% (v/v) isotone Percoll in PBS.
- Gebruik een pipetjongen op lage snelheid om de pellet die in de 40% Percoll-oplossing is geresuspendeerd voorzichtig op 80% Percoll-oplossing te leggen. Pipetteer langzaam en continu; houd de buis van 15 ml onder een hoek van 45° (figuur 6B).
- Zonder de overlay te verstoren, centrifugeer de centrifugebuizen van 15 ml gedurende 20 minuten bij 850 x g, bij kamertemperatuur (gemiddelde versnelling en minimale pauze).
- Verwijder de buizen voorzichtig uit de centrifuge zonder de Percoll-lagen te verstoren (figuur 6C).
- Zonder de ring van leukocyten op het grensvlak van de twee Percoll-oplossingen te verstoren, gebruikt u een steriele Pasteur pipet om alles weg te gooien, behalve ongeveer 0,5-1 ml van de bovenste Percoll-laag.
- Terwijl u probeert een minimale hoeveelheid Percoll-oplossing te zuigen (tot 4-5 ml totaal), verzamelt u zorgvuldig de ring van leukocyten en brengt u de cellen over in een nieuwe gelabelde centrifugebuis van 15 ml.
- Vul elk monster aan met 10 ml steriel RMPI-1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 500 x g bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en ga verder met RBC-lysis.
- De stappen voor optie B zijn als volgt.
- Label één steriele centrifugebuis van 15 ml per monster.
- Gooi na de spin het supernatant weg uit de centrifugebuis van 50 ml. Gebruik een pipet boy om elke pellet te resuspenderen met 8 ml van 35% (v/v) isotone percoll in RPMI-1640 medium.
- Breng de monsters over in centrifugebuizen van 15 ml.
- Centrifugeer de monsters bij 940 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met gemiddelde versnelling en minimale pauze.
- Aspirateer het bovennatuurlijk voorzichtig met behulp van een aspirator of pipetjongen (niet door de buis om te keren).
- Resuspend de pellet in 14 ml RPMI-1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS en centrifugeer het monster vervolgens bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg door aspiratie en ga verder met RBC-lysis.
- De stappen voor optie A zijn als volgt.
4.RBC lysis
- Om de RBC's te lyseren, resuspendeert u de monsters in 3 ml 1x RBC-ligoplossing en incubeert u gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 ml PBS toe aan de monsters om de reactie te stoppen.
- Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 400 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 10 ml PBS toe en herhaal stap 4.3.
- Resuspend elke pellet in 1 ml RPMI-1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerde FBS.
- Voer de monsters door steriele 70 μm cel strainers.
- Voer het celgetal uit met trypan blue en een Neubauer-kamer volgens de instructies van de fabrikant.
- Pas de concentratie van de celsuspensie aan tot 1-2 miljoen cellen in 100 μL PBS of medium.
5. Ontwerpstrategie en -controles van het paneel
OPMERKING: Het paneel dat in dit artikel wordt beschreven, is geschikt voor de discriminatie van uILC1-, trNK- en cNK-cellen en is ontworpen voor gebruik op een 5-laser BD LSRFortessa. Kleine wijzigingen kunnen worden aangebracht om verschillende celpopulaties te bestuderen en alternatieve fluorchromen te gebruiken. Het wordt aanbevolen om de configuratie van het instrument te controleren, getitreerde antilichamen te gebruiken voor optimale scheiding, de helderheidsindex van de fabrikant te raadplegen en de helderste kleurstoffen te gebruiken voor laagexpressie-antigenen zoals NKp46, en de algemene richtlijnen te volgen19. Het wordt aanbevolen om een Fluorescentie Minus One (FMO) controle op te nemen voor NKp46.
6. Aangeboren lymfoïde celkleuring voor FACS-fenotypering
- Breng 1-2 miljoen cellen per put over in een ronde plaat met 96 putten.
- Draai de plaat gedurende 3 minuten op 400 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg door het in een gootsteen te vegen.
- Resuspend de celkorrels in 100 μL PBS (eiwit- en azidevrij) met behulp van een meerkanaalspipet.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de PBS geen natriumazide, geen Tris of eiwitten bevat voor de volgende stap. - Herhaal stap 6.2.
- Resuspend cellen in 50 μL fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof verdund in PBS (eiwit- en azidevrij) (1:1.000). Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de PBS geen natriumazide, geen Tris of eiwitten zoals FBS of BSA bevat, omdat dit kan leiden tot een verminderde kleurintensiteit van dode cellen en / of verhoogde achtergrondkleuring voor de levende cellen.
LET OP: Als levensvatbaarheidskleurstof in poedervorm is, gebruik dan onder de motorkap. - Voeg 150 μL PBS toe, resuspend de cellen met een meerkanaalspipet en herhaal stap 6.2.
- Resuspend de cellen in 25 μL FACS Buffer (PBS aangevuld met 1% BSA of 2% FBS) met Fc receptor blokkerend reagens. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Voeg 25 μL van een oppervlakte antilichaamcocktail toe.
OPMERKING: Titreer antilichamen altijd en optimaliseer het antilichaampanel voorafgaand aan het experiment. - Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten in het donker.
- Voeg 150 μL FACS-buffer toe aan elke put, meng grondig en herhaal stap 6.2.
- Herhaal stap 6.10.
OPMERKING: Voer verdere stappen uit met optie A of optie B. Gebruik optie A om de cellen te bevlekken met oppervlaktemarkeringen. Gebruik optie B om de intracellulaire markers te bestuderen door middel van flowcytometrie.- De stappen voor optie A zijn als volgt.
- Resuspend de monsters in 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) per put en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
LET OP: Gebruik PFA onder de motorkap. Raadpleeg het veiligheidsblad voor het veilig weggooien van PFA-afval/voorwerpen die in contact zijn gekomen met PFA (bijv. pipetten). - Herhaal stap 6.2 twee keer.
LET OP: Gooi het niet weg door hier in de gootsteen te vegen, omdat deze PFA bevat. Aspirateer met een pipet en gooi het afval weg volgens het veiligheidsblad. - Resuspend de monsters in 200 μL PBS.
- Breng de monsters over in gelabelde FACS-buizen en vul bij met 100 μL PBS. Bewaar de tubes op ijs of in een koelkast tot de verwerking met FACS-analyse. Verkrijg de monsters op een flowcytometer binnen 24 uur.
- Resuspend de monsters in 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) per put en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- De stappen voor optie B zijn als volgt.
- Resuspend de monsters in 100 μL fixatie-/permeabilisatieoplossing per put (met paraformaldehyde) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
LET OP: Gebruik PFA onder de motorkap. Raadpleeg het veiligheidsblad voor het veilig weggooien van PFA-afval/voorwerpen die in contact zijn gekomen met PFA (bijv. pipetten). - Herhaal stap 6.2.
LET OP: Gooi het niet weg door hier in de gootsteen te vegen, omdat deze PFA bevat. Aspirateer met een pipet en gooi het afval weg volgens het veiligheidsblad. - Voeg 200 μL 1x permeabilisatie/wasbuffer toe, meng goed en herhaal stap 6.2.
- Herhaal stap 6.11.2.3.
- Resuspend de vaste en gepermeabiliseerde cellen in 50 μL 1x permeabilisatie/wasbuffer bevattende antilichamen mix voor intracellulaire kleuring.
- Incubeer de monsters bij 4 °C gedurende 30 minuten in het donker.
- Voeg 200 μL 1x permeabilisatie/ wasoplossing toe, meng goed en herhaal stap 6.2.
- Herhaal stap 6.11.2.7.
- Resuspend de monsters in 200 μL PBS.
- Breng de monsters over in gelabelde FACS-buizen en vul bij met 100 μL PBS. Bewaar de tubes op ijs of in een koelkast tot de verwerking met FACS-analyse. Verkrijg de monsters op een flowcytometer binnen 24 uur.
OPMERKING: Na het uitvoeren van dit protocol is de deciduele celsuspensie klaar voor FACS-analyse. Het wordt aanbevolen om zoveel mogelijk gebeurtenissen per monster vast te leggen; ten minste 1.000-3.000 gebeurtenissen van een ouderlijke populatie moeten worden verkregen om betrouwbare resultaten te bereiken.
- Resuspend de monsters in 100 μL fixatie-/permeabilisatieoplossing per put (met paraformaldehyde) en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- De stappen voor optie A zijn als volgt.
Representative Results
De belangrijkste stappen van de methode die worden beschreven om een eencellige suspensie van baarmoederleukocyten te verkrijgen, zijn samengevat in figuur 3. Gedemonstreerd in figuur 2B zijn de basis FACS gating strategie gebruikt voor de identificatie van drie subsets van g1 ILCs in B6 muizen: uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+), en cNK (CD49a-Eomes+) cellen. Verdere analyse van deze populaties kan worden uitgevoerd om verschillende oppervlakte- en intracellulaire markers van g1 ILCs te bestuderen. Als voorbeeld kan de co-expressie van IFN-ɣ- en zelf-MHC-receptoren worden beoordeeld in uILC1-, trNK- en cNK-cellen na stimulatie met anti-NK1.1-antilichaam (figuur 7).
Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen zowel het protocol (figuur 3) als het antilichaampaneel worden aangepast. Belangrijk is dat het wordt aanbevolen om zowel anti-NK1.1- als anti-NKp46-antilichamen in één FACS-paneel te gebruiken voor g1 ILC-gating (figuur 2B en tabel 1). Opgemerkt moet worden dat g1 ILCs verkregen uit bloed, milt of lever een hogere expressie van NKp46 op hun oppervlak hebben dan de baarmoeder tegenhanger (figuur 8). Oppervlaktekleuring voor NK1.1 geeft een betere scheiding en maakt het mogelijk om baarmoeder g1 ILC's gemakkelijk te gaten (figuur 8). Terwijl NKp46 wordt uitgedrukt door alle muizenstammen, wordt het NKR-P1C-antigeen erkend door het anti-NK1.1-antilichaam PK136 alleen uitgedrukt door sommige muizenstammen, waaronder C57BL / 6 (d.w.z. B6), FVB / N en NZB, maar niet in AKR, BALB / c, CBA / J, C3H, DBA / 1, DBA / 2, NOD, SJL of 129. Bovendien, als de onderzoeker van plan is om cruciale NK-celreceptoren zoals de MHC-receptoren Ly49 te bestuderen, is het belangrijk om op de hoogte te zijn van allelische variaties in laboratoriummuisstammen, die de hoge variabiliteit van menselijke killer-cel immunoglobuline-achtige receptoren (KIR) samenvatten. Bovendien, als de cellen moeten worden gestimuleerd met NK1.1 voor een functionele assay, zoals beschreven in Kim, S. et al.20, kan het wenselijk zijn om de cellen te kleuren met anti-NKp46 in plaats van anti-NK1.1, omdat het NKR-P1C-antigeen kan worden bezet door de crosslinking anti-NK1.1 of een receptor downregulatie kan de stimulatie volgen. Receptorbezetting of downregulatie kan kleuring met hetzelfde antilichaam dat wordt gebruikt om te stimuleren, belemmeren.
Een veel voorkomend probleem met enzymatische weefseldissociatie is de verandering van oppervlakte-epitopen op cellen door enzymen die worden gebruikt voor een spijsverteringsmedium. De kleuring voor de MHC CD94:NKG2A-receptor is bijvoorbeeld slecht als Liberase TM wordt gebruikt. Vertering met Liberase DH behoudt echter de NKG2A-herkenning door 16A11-antilichaamkloon (figuur 9). Het wordt aanbevolen om de invloed van enzymen op alle epitopen in het FACS-paneel te controleren. Gebruik hiervoor de suspensie van muizensplenocyten verkregen door mechanische dissociatie (waarbij de hele milt door een zeef van 70 μm gaat). Het monster wordt vervolgens in twee of meer delen verdeeld, gevolgd door incubatie met een medium met of zonder enzym(en).
Zoals eerder vermeld, zijn bloed-afgeleide cellen aanwezig in weefsel gedissocieerde monsters. Indien nodig kunnen bloedverontreinigingen worden uitgesloten met behulp van een intravasculaire kleuringsmethode zoals ontwikkeld in het Laboratorium van Masopust21. Figuur 10 toont aan dat ongeveer 6,5% van de g1 ILCs die aanwezig zijn in baarmoederweefselmonsters op zwangerschapsdag 8,5 bloedafgenomen zijn. Anti-CD45-antilichamen die worden gebruikt voor intravasculaire kleuring kunnen worden geconjugeerd met een fluorochroom dat wordt gebruikt voor een dump-kanaal; dit sluit bloedverontreinigingen uit zonder een extra fluorescentiekanaal te gebruiken. De meest voorkomende problemen en hun oplossingen zijn weergegeven in tabel 2.
Figuur 1: Doorsnede van een muizen baarmoeder. (A) Dwarsdoorsnede van de baarmoeder van de muis (niet-zwanger) wat wijst op een verscheidenheid aan maternale leukocyten die de baarmoeder bevolken. (B) Dwarsdoorsnede van de baarmoeder van de muis (drachtdag 8.5). (C) Dwarsdoorsnede van de baarmoeder van de muis (drachtdag 13.5). (D) Vergelijking van de vorming van de placenta tussen muizen en de mens vanaf het blastocyststadium. Afbeeldingen gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Subpopulaties van baarmoeder g1 ILC1. (A) Percentages van baarmoeder cNK, ILC1 en trNK bij muizen tijdens het vroege leven en de zwangerschap. W - weken, gd - dag van de dracht. Aangepaste grafiek van Filipovic, I. et al.4. (B) Gating-strategie om baarmoedergroep 1 ILC-subsets te analyseren door middel van flowcytometrie. Lymfocyten werden geïsoleerd uit de baarmoederweefsels op dag 10,5 van de zwangerschap. Weefselvertering werd uitgevoerd met behulp van een spijsverteringsmedium dat Liberase TM bevatte. Cellen werden omheind op basis van hun vermogen om licht te verstrooien. Doubletten werden uitgesloten met behulp van een FSC-A versus FSC-H plot, en alleen CD45+CD3-CD19-levensvatbare cellen werden verder geanalyseerd. Binnen CD45+CD3-CD19- levensvatbare cellen werd de groep 1 ILC gate geïdentificeerd als NK1.1+ NKp46+ cellen. Binnen groep 1 ILCs kunnen drie subsets worden geïdentificeerd: CD49a-Eomes+ conventionele NK-cellen (cNK), CD49a+Eomes+ tissue-resident NK-cellen (trNK) en CD49a+Eomes- uILC1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een visuele gids voor de belangrijkste stappen van het protocol. (1) Ontleed de zwangere baarmoeder vrij van mesometriaal vet. (2) Verwijder de foetussen; breng de baarmoeder terug naar de buis van 5 ml en hak het weefsel fijn. Ga verder met de stap voor de enzymvertering: voeg 3 ml warme enzymatische verteringsmix toe aan elk monster. Incubeer de buizen van 5 ml gedurende 30 minuten bij 37 °C met roeren. (3) (i) Spoel na de vertering alles uit buizen van 5 ml in buizen van 15 ml met behulp van 10 ml ijskoude 5 mM EDTA PBS-oplossing. ii) Centrifugeer buizen van 15 ml met verteerd weefsel gedurende 10 minuten bij 400 x g. (iii) het supernatant weggooien; veeg voorzichtig met de pellet en resuspend deze in 10 ml warme (37 °C) 5 mM EDTA PBS-oplossing. iv) Incubeer monsters in de buizen van 15 ml bij 37 °C met roeren, gedurende 15 minuten. (4) Gebruik de zuiger van een steriele spuit van 1 ml, druk het verteerde weefsel door een zeef van 70 μm op een correct gelabelde en steriele buis van 50 ml en draai gedurende 10 minuten bij 400 x g. (5) Ga na de spin verder met optie A (hier weergegeven in diagrammen) of B. Optie A: gooi het supernatant uit de buis van 50 ml en voer met behulp van een pipet elke pellet opnieuw op in 8 ml van 40% (v/v) isotone percoll in PBS. (6) i) Optie A wordt voortgezet: Leg met een pipet op lage snelheid de in 40% Percoll-oplossing geresuspendeerde pellet voorzichtig over de 5 ml 80% Percoll-oplossing. Pipetteer langzaam en continu; houd de buis van 15 ml onder een hoek van 45°. ii) Zonder de overlay te verstoren, centrifugeer de buizen van 15 ml bij 850 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, met gemiddelde versnelling en langzame breuk. (7) Na de spin, terwijl u probeert een minimale hoeveelheid Percoll-oplossing te zuigen (tot 4-5 ml totaal), verzamelt u zorgvuldig de ring van leukocyten. (8) Voer lysisstappen voor rode bloedcellen uit. (9) Tel cel met behulp van trypan blauw en een Neubauer Kamer. (10) Breng 1-2 miljoen cellen per put over in een ronde plaat met 96 putten. (11) Ga verder met levensvatbaarheidskleurstof en antilichaamkleuring. (12) Breng ten slotte de monsters over in gelabelde FACS-buizen. Bewaar de tubes op ijs of in een koelkast totdat ze binnen 24 uur met FACS-analyse zijn verwerkt. Afbeeldingen gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vaginale plug (A) en afwezigheid ervan (B) bij C57BL/6 vrouwtjes op 0,5 dag na de paring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Dissectie om de baarmoeder van een zwangere muis te extraheren. (A) De moeder wordt vastgepind met naalden op een zacht bord om het lichaam af te vegen met 70% ethanol. Er worden twee verticale incisies gemaakt, zoals aangegeven door de blauwe stippellijnen. (B) De huid wordt gelift om inwendige organen bloot te leggen. De darmlussen worden voorzichtig omhoog bewogen om de baarmoeder te visualiseren. (C) De baarmoeder wordt bemonsterd door op drie punten te snijden: naast de eierstokken en bij de baarmoederhals, zoals aangegeven door respectievelijk de twee blauwe stippellijnen en de blauwe pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Bereiding van eencellige suspensie. (A) Mechanische verwijdering van embryo's van hun implantatieplaats. B) Percoll gradiëntoverlay; de bovenste laag bevat de eencellige suspensie in 40% van Percoll en de onderste laag 80% van Percoll. (C) Vorming van lymfocytenring na centrifugering van de percollgradiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatieve FACS-analyse van functionele assay met groep 1 ILCs. Intracellulaire IFN-ɣ- en oppervlakte-CD107a-detectie in groep 1 ILC's die NK-receptoren tot expressie brengen voor zelf-MHC (Ly49C, Ly49I en NKG2A) in vergelijking met degenen die dat niet doen, na het crosslinken van NK1.1 met plaatgebonden antilichamen. De cellen werden geïsoleerd uit baarmoederweefsels op dag 9,5 van de zwangerschap. Weefselvertering werd uitgevoerd met behulp van een spijsverteringsmedium dat Liberase DH bevatte. Getoond worden de ruwe waarden van alle vier de kwadranten (hoeken) en het relatieve percentage responders onder cellen die receptoren voor zichzelf tot expressie brengen en responders die geen zelfreceptoren hebben (vetgedrukte getallen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Kleuring van milt- en baarmoederlymfocyten met anti-NKp46- en anti-NK1.1-antilichamen. (A) Celsuspensies verkregen uit de milt van de muis en (B) baarmoeder op drachtdag 10.5 werden in tweeën gescheiden; het ene deel was bevlekt met NKp46-APC (rood) en het andere met NK1.1-APC (blauw). Merk op dat de NKp46-kleuring van baarmoederlymfocyten NKp46+ en NKp46-cellen niet zo netjes scheidt als miltlymfocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Afname van NKG2A MFI (antilichaamkloon: 16A11) door incubatie met verteringsmedium. Celsuspensie van C56BL/6 muissplenocyten was verdeeld in drie delen. Eén deel werd geïncubeerd in Liberase DH-verteringsmedium (HBSS met 0,13 WU/ml Liberase DH en 30 μg/ml DNAse) en een ander deel werd geïncubeerd met Liberase TM-verteringsmedium (HBSS met 0,52 WU/ml Liberase TM en 30 μg/ml DNAse). Het derde deel werd behandeld met nette HBSS gedurende 30 min bij 37 °C. Expressie van NKG2A-marker op g1 ILCs werd beoordeeld door flowcytometrie. Grafiek overgenomen van Shreeve N. De rol van baarmoeder NK-cel remming tijdens de zwangerschap (Thesis); Promotor: Colucci F, 2020. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Intravitale kleuring met anti-CD45-antilichamen voor uitsluiting van van bloed afgeleide g1 ILO's. Een C57BL/6 moedermuis op drachtdag 8,5 werd 3 minuten na intraveneuze injectie met 3 μg CD45-AF647 geruimd. De baarmoeder, volbloed en thymus werden geoogst en verwerkt voor FACS-analyse. De X-as toont het signaal van intraveneuze kleuring met CD45-AF647 en de Y-as demonstreert het signaal van in vitro gekleurde CD45-BUV395. De percentages van de subpopulaties worden weergegeven in kwadranten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam / Kleurstof | Kloon | Fluorochroom | Laser | |
| 1 (Dump kanaal) | Zombie Violet Fixable Levensvatbaarheid kleurstof | Violet | ||
| cd19 | 1D3 | Bv421 | ||
| cd3 | 145-2c11 | Bv421 | ||
| 2 | cd45 | 30-F11 | Fitc | Blauw |
| 3 | NK1.1 | Pk136 | Bv605 | Violet |
| 4 | NKp46 | 29A1,4 | APC | Rood |
| 5 | CD49a | Ha31/8 | Buv395 | Ultraviolet |
| 6 | EOMES | Dan11mag | PE | Groen |
Tabel 1: Een voorbeeld van een FACS-paneel voor conventionele 5-lasers cytometer.
| Probleem | Mogelijke oorzaak | Suggestie |
| De celring is niet zichtbaar op het grensvlak van twee percoll-oplossingen | Slechte gelaagdheid van percoll-oplossing of het mengen van twee lagen tijdens monsterverwerking | Zorg er extra voor dat het 80% percoll kussen niet breekt tijdens het overlayen. Let op tijdens het verwerken van monsters: verstoor de percoll-interface niet |
| Lage aantallen leukocyten (bijvoorbeeld bij gebruik van een niet-zwangere baarmoeder) | De interface is zelfs te zien wanneer het celnummer op de interface erg laag is. Zelfs als de ring niet zichtbaar is, verzamel vloeistof tussen 40% en 80% percoll-oplossingen, omdat er mogelijk nog steeds voldoende cellen zijn voor verdere verwerking | |
| Onvolledige RBC-lysis | Cellen werden niet goed geresuspendeerd in de ligbuffer | Pipetteercellen op en neer om de klonten te breken en cellen in de ligbuffer volledig te resuspenderen |
| Lysing oplossing is koud | Breng de ligoplossing voor gebruik op kamertemperatuur | |
| Verleng de incubatietijd met de ligoplossing tot 15min | ||
| RBC-lysisstap kan worden herhaald | ||
| Lage celopbrengst | Slechte enzymatische spijsvertering | Controleer of enzymen niet verouderd zijn en zijn opgeslagen volgens hun handleidingen |
| Celverlies tijdens wasstappen | Inspecteer de celkorrel na elke wasstap: de ondoorzichtige pellet op de bodem van de put na het spinnen. Het gebruik van V-bodem in plaats van U-bodemplaten, zwenkartorcentrifuge, langere centrifugatietijd kan celverlies verminderen | |
| Weefselmonster bevat lage aantallen lymfocyten (bijvoorbeeld bij gebruik van een niet-zwangere baarmoeder) | Pool verschillende baarmoeders om voldoende gebeurtenissen voor analyse te verkrijgen. Overweeg optie B van het protocol voor celisolatie te gebruiken | |
| Hoge variabiliteit van absolute leukocytenaantallen verkregen van muizen van dezelfde groep | Inconsistente verzameling van cellen op het grensvlak van 40% en 80% percoll-oplossingen | Zorg ervoor dat u hele celfractie verzamelt op de percoll-interface. Overweeg optie B van het protocol voor celisolatie te gebruiken |
| Niet in staat om verwachte lymfocytensubpopulaties /markers of ongewoon lage MFI voor sommige celoppervlakmarkers te detecteren | Enzymatische spijsvertering beïnvloedt de oppervlakte-expressie van sommige epitopen of hun afbraak | Optimaliseer de enzymatische spijsvertering door te veranderen: enzym (bijv. naar ander type liberase of collagenase) en/of incubatieduur en/of enzymconcentratie |
| Hoog achtergrondgeluid in de flowcytometer | Hoog aandeel celresten of RBC-verontreiniging | Pas de FSC-drempelparameter aan. Overweeg optie A van het protocol voor celisolatie te gebruiken |
Tabel 2: Handleiding voor probleemoplossing.
Discussion
De methode bevat een aantal kritische stappen die hierna worden besproken. De eerste kritieke stap is het verkrijgen van meerdere synchrone zwangerschappen als de relatieve frequentie van leukocytenpopulaties verandert tijdens de zwangerschap. Het hebben van meerdere dammen op dezelfde zwangerschapsdag maakt biologische herhalingen in dezelfde experimenten mogelijk of het poolen van lymfocyten van individuele dammen om grotere aantallen te verkrijgen die nodig zijn voor downstream-toepassingen. Getimede paring stelt de onderzoeker in staat om de conceptie binnen een periode van 24 uur te lokaliseren. Hoewel muizen ongeveer 2,5 jaar oud zijn, zullen ze de reproductieve leeftijd hebben van 4-7 weken tot 6-8 maanden oud. Omdat jongere muizen meestal kleinere pups produceren, worden vrouwelijke muizen over het algemeen niet gedekt totdat ze tussen de 6-8 weken zijn en mannelijke muizen totdat ze tussen de 8-10 weken zijn. Aangezien oestrus ongeveer 15 uur duurt bij muizen en elke 4-5 dagen voorkomt, is de typische paringssnelheid (onthuld door een vaginale plug, zie figuur 4) ongeveer 25%. Het is daarom belangrijk om muizen in oestrus te gebruiken en voldoende aantallen te plannen om het vereiste aantal dammen voor een bepaald experiment te verkrijgen. De oestruscyclusfase kan worden bepaald door vaginale uitstrijkcytologie22. De plugsnelheid kan worden verbeterd door mannetjes 48 uur voor de paring te laten rusten en door gebruik te maken van het Whitten-effect18. Als alternatief kan men zwanger merrieserum toedienen, dat het effect van het endogene follikelstimulerend hormoon nabootst, oöcytrijping induceert en, 42-50 uur later, humaan choriongonadotrofine, dat het effect van het endogene luteïniserend hormoon nabootst en de ovulatie induceert. Deze hormonale behandeling omzeilt de behoefte aan oestrus en maakt vrijwel alle behandelde vrouwtjes ontvankelijk.
Een tweede kritische stap is het waarborgen van de kwaliteit van de FACS-beits. Antilichamen die in flowcytometrie worden gebruikt, moeten altijd worden getitreerd en in de optimale concentratie worden gebruikt, en het is noodzakelijk om te controleren of de enzymatische spijsvertering cruciale antigene epitopen niet splijt. Om te beoordelen of een enzym een epitoop zal splijten, kan men twee fracties van hetzelfde monster parallel kleuren, de ene ondergaat enzymatische en de andere mechanische spijsvertering. Evenzo is het gebruik van geschikte controles en enkele vlekken cruciaal om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Voor zeldzame voorvallen kunnen kralen worden gebruikt om afzonderlijke vlekmonsters te genereren. Het wordt aanbevolen om geen kralen te gebruiken voor het instellen van spanningen, maar eerder een populatie cellen die lymfocyten en andere leukocyten bevatten, zoals splenocyten. Als kralen worden gebruikt, is het noodzakelijk om antilichamen voor kraalkleuring te titreren, zodat de fluorescentie-intensiteit van gekleurde kralen vergelijkbaar is met de fluorescentie-intensiteit van cellen. In geval van problemen met het scheiden van positieve van negatieve cellen voor een bepaalde marker, kan een FMO-controle ook worden gebruikt om de gating voor een specifieke marker te vergemakkelijken. In het geval van intracellulaire markers moet een isotypecontrole worden gebruikt omdat intracellulaire kleuring kan resulteren in resterende ongebonden antilichamen, die na de wasstappen nog steeds in cellen aanwezig kunnen zijn en daarom het achtergrondsignaal verhogen. Het wordt aanbevolen om de monsters binnen 24 uur na het fixeren van de cellen uit te voeren om de beste resultaten bij fenotypering door FACS-analyse te verkrijgen, omdat autofluorescentie in de loop van de tijd aanzienlijk toeneemt en de fluorescentie-intensiteit van sommige antilichamen in de loop van de tijd kan afnemen.
Een andere cruciale factor om te overwegen is de downstream-toepassing van de eencellige suspensie die met het protocol wordt verkregen. Voor functionele assays is het essentieel om in steriele omstandigheden te werken. Evenzo is het voor latere omics-studies belangrijk om te werken in steriel en RNase-, DNase- en proteasevrij.
Het hier gepresenteerde protocol richt zich op fenotypering van groep 1 ILCs, maar kan worden aangepast voor fenotypering van andere celtypen door het antilichaampaneel te wijzigen. Het wordt aanbevolen dat alle antilichamen worden getest tegen verteerde en niet-verteerde celsuspensie om het verlies / de verandering van oppervlakte-epitopen door de enzymatische behandeling te detecteren. Evenzo kunnen verschillende enzymen worden gebruikt om het weefsel te verteren en de celopbrengst te verhogen, maar het effect ervan op cruciale antigene epitopen moet zorgvuldig worden bestudeerd. Hoewel NKp46 een goede marker is voor milt NK-cellen en werkt in alle stammen van laboratoriummuizen, is de expressie van NKp46 op uNK-cellen in C57BL / 6-muizen aanzienlijk lager dan op MILT NK-cellen. Het is het beste om voor zowel NK1.1 als NKp46 tegelijkertijd te vlekken. Als meerdere organen direct moeten worden vergeleken, wordt aanbevolen om alle monsters gelijk te behandelen, zelfs als de enzymatische spijsvertering niet nodig is voor weefsels zoals de milt of het beenmerg. Hoewel de hier gepresenteerde methode van toepassing is op de niet-zwangere baarmoeder, zal de lymfocytenringisolatie door een tweefasige Percoll-gradiënt een uitdaging zijn en de opbrengst van geïsoleerde cellen kan te laag zijn voor betrouwbare FACS-analyse en daarom zal het nodig zijn om cellen te bundelen die zijn geïsoleerd uit de baarmoeder van individuele, niet-zwangere muizen23.
Er zijn beperkingen aan het protocol om rekening mee te houden voor de interpretatie van de gegevens. Zoals het geval is voor alle weefsels, zullen circulerende lymfocyten afkomstig uit het bloed worden geïsoleerd naast weefselbewonende cellen. Als de uitsluiting van circulerende lymfocyten essentieel is voor de interpretatie van gegevens, kan intravitale kleuring worden uitgevoerd om circulerende cellen te labelen. Verder is een tweede beperking van het protocol dat sommige cellen verloren gaan omdat niet alle cellen uit het weefsel kunnen worden geëxtraheerd. De meest voorkomende problemen en de probleemoplossing daarvan worden weergegeven in tabel 2.
Historisch gezien is de studie van cellen in weefsels gebaseerd op histologisch onderzoek van weefselsecties. Sandra Peel's uitstekende recensie24 vat het werk samen dat gedurende meer dan 100 jaar tot eind jaren '80 is gedaan. Beschrijvingen van cellen die later bekend staan als uNK-cellen verschijnen inderdaad in manuscripten die meer dan een halve eeuw voordat lymfocyten zelfs werden ontdekt, werden gepubliceerd. Dus, vóór de ontdekking van NK-cellen in 1975, en de uNK-cellen zijn geïndiceerd als maternale glycogeencellen of gegranuleerde metriale kliercellen. Anne Croy heeft grote bijdragen geleverd in het veld25 en was zo vriendelijk om het team de dissectie te leren die ze had geoptimaliseerd3, en dat wordt momenteel gebruikt. Hoewel het instrumenteel is bij het beschrijven van de morfologie en weefsellocatie van uNK-cellen, is klassiek histologisch onderzoek beperkt tot de detectie van slechts enkele markers op de cellen van belang. In 2008 werd een op flowcytometrie gebaseerde methode beschreven om tegelijkertijd meerdere markers op baarmoederlymfocyten te detecteren26. Dit is in wezen de methode die in dit artikel is beschreven. Meer recente technologieën zoals ruimtelijke transcriptomica en beeldvorming door massacytometrie combineren de kracht van histologie en flowcytometrie, waardoor zowel de gelijktijdige detectie van respectievelijk meerdere genen of eiwitten als het behoud van de normale weefselarchitectuur mogelijk is.
De toepassingen van de hier beschreven methode zijn meervoudig en omvatten FACS-fenotypering, functionele assay (zoals ELISPOT, degranulatie of cytotoxische assays), celsortering en daaropvolgende transcriptomics of proteomics. Verdere toepassingen die op basis van deze methode kunnen worden ontwikkeld, zijn onder meer de kweek en uitbreiding van decidual NK-cellen na celsortering of verrijking door negatieve depletie. Momenteel is er geen protocol om uNK-cellen van muizen te kweken en uit te breiden en hun levensvatbaarheid en functionaliteit voor een langere periode te behouden, op dezelfde manier als menselijke NK-cellen die gedurende 7-14 dagen kunnen worden gekweekt en uitgebreid door toevoeging van IL-2 of een combinatie IL-12 en IL-15. De optimalisatie van een dergelijke methode voor muis-uNK-cellen zou meer flexibiliteit bieden bij het uitvoeren van functionele assays en het mogelijk maken om meerdere omstandigheden te testen met een hoger celnummer. Aan de andere kant is bekend dat kweekomstandigheden het unieke fenotype van lymfocyten en mogelijk ook hun functie wijzigen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We bedanken de vorige en de huidige teamleden die hebben geholpen bij het ontwikkelen van deze methode, waaronder Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic en Anita Qualls. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Wellcome trust [Grant number 200841/Z/16/Z ] en de Medical Research Council (MR/P001092/1). Met het oog op open access heeft de auteur een CC BY-licentie voor openbaar auteursrecht toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortvloeit uit deze inzending.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
| BSA | Sigma | A9647-100G | |
| CD19 antibody | BD | 562701 | |
| CD3 antibody | BD | 562600 | |
| CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
| CD49a antibody | BD | 740262 | |
| DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
| EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
| Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
| Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
| Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
| Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
| NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
| NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
| Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
| PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
| PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
| Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
| RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
| Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |
References
- Colucci, F.
- Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. The unique immunological and microbial aspects of pregnancy. Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).
- Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , Elsevier, Academic Press. (2014).
- Filipovic, I., et al. Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus. Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).
- Chen, Z., et al. DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression. Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).
- Moffett, A., Colucci, F. Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).
- Gaynor, L. M., Colucci, F. Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice. Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).
- Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M.
- Wilkens, J., et al. Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil. The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).
- Crespo, ÂC., et al. Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts. Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).
- Shmeleva, E. V., Colucci, F. Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity. Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).
- Kather, A., et al. Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus. Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).
- Croy, B. A., et al. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).
- Vander lee, S., Boot, L. M.
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Kim, S., et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Caligioni, C. S.
- Doisne, J. -M., et al. Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells. Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).
- Peel, S. Fate of GMG Cells. Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, Springer. Berlin. (1989).
- Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones. Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).
- Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells. Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).
