Summary
Dette er en metode til at isolere livmoder lymfoide celler fra både gravide og ikke-gravide mus. Denne metode kan bruges til flere downstream applikationer såsom FACS phenotyping, celle sortering, funktionelle assays, RNA-seq, og proteomics. Protokollen her viser, hvordan man fænotype gruppe 1 livmoder medfødte lymfoidceller ved flow cytometri.
Abstract
Beskrevet her er en simpel metode til at isolere og fænotype mus gruppe 1 livmoder medfødt lymfoide celler (g1 uILCs) fra individuelle gravide livmoder ved flow cytometri. Protokollen beskriver, hvordan man kan oprette tid parring for at opnå flere synkrone dæmninger, den mekaniske og enzymatiske fordøjelse af den gravide livmoder, farvning af encellede suspensioner, og en FACS strategi til fænotype og diskriminere g1 uILCs. Selv om denne metode uundgåeligt mister den rumlige information om cellulær fordeling i vævet, protokollen er blevet anvendt med succes til at bestemme uILC heterogenitet, deres reaktion på moderens og fosterfaktorer, der påvirker graviditet, deres genekspression profil, og deres funktioner.
Introduction
Beskrevet her er en simpel metode til at opnå et højt udbytte af livmoder medfødte lymfocytter fra individuelle gravide livmoder. Denne metode bevarer protein overflade udtryk og funktionalitet af livmoder medfødte lymfocytter, og det er velegnet til efterfølgende anvendelser såsom FACS phenotyping, RNAseq, proteomics eller funktionelle assays. Her er der fokus på fænotyping af gruppe 1 uILCs af flow cytometri.
Livmoderen består af tre lag: endometrium, myometrium og perimetrium (figur 1). Endometriet er slimhinden, foring lumen af livmoderen. Progesteron, produceret af corpus luteum, omdanner endometrium til decidua. Myometriet består af to lag af glat muskel, der udgør livmodervæggen. Perimetrium er serosa, der ombrydes livmoderen og forbinder det til bughinden gennem det brede ledbånd kaldet mesometrium. I et tværsnit af livmoderen kaldes den del, der er modsat lumen, mesometriesiden, mens den del tæt på lumen kaldes anti-mesometriesiden. En række moderle leukocytter befolker endometriet og decidua, herunder flere typer celler, hvor de medfødte immunceller repræsenterer langt de fleste celler. Medfødte lymfoidceller (ILCs), makrofager, dendritiske celler (DC), samt CD4 + og CD8 + T lymfocytter, regulatoriske T-celler (Tregs), og sjældne B-celler, kan alle spille vigtige roller i reguleringen af livmodermiljøet i hele graviditeten1,2. ILCs i livmoderen findes ikke kun i slimhinden, men også i myometrium i mus. Herunder alle tre grupper af ICS, livmoderen er faktisk det organ tættest befolket af gruppe 1 ICS. Med den strukturelle omdannelse af livmodervæv i hele drægtighedsperioden ændres antallet og andelen af livmoderleukocytter også (se figur 2A for et eksempel på variationer i procentdelen af gruppe 1 uILC-delmængder)3,4.
Når mus henvises til i dette papir, menes C57BL/6-stammen af indavlede laboratoriemus. Udavlede mus (f.eks. NMRI-mus) bruges ofte i reproduktiv forskning på grund af deres høje reproduktionshastighed. Men brugen af indavlede stammer er nødvendig for at generere ensartede resultater, og immunologens foretrukne genetiske baggrund er C57BL/6, også kendt som B6.
Ca. 30% af livmoder leukocytter i B6 dæmninger i midten af drægtighedsperioden er g1 uILCs, som er defineret ved flow cytometri som levedygtige CD45 +CD3-CD19-NK1.1+NKp46 + celler (Figur 2B): pro-angiogenic væv-resident NK (trNK), IFN-g producerer konventionelle NK (cNK), og uILC14,5. Procentdelen af uNK-celler er endnu højere hos mennesker og når omkring 70% i første trimester6. Der er flere ligheder end forskelle mellem menneske og mus uNK og uILC7,8. Selv om det er vigtigt at holde forskellene i tankerne, er det nyttigt at integrere de tilgængelige oplysninger om de to arter. Når man kombinerer oplysninger fra undersøgelse af uILC hos mennesker og laboratorie gnavere, er det klart, at NK-celler hjælper med homøostatiske ændringer, der er afgørende for livmoderens biologi, herunder vedligeholdelse af arteriel integritet9 og spiralarterie ombygning10 samt trofoblastinvasion11,12. De spiller også specifikke roller i forsvaret mod patogener13,14. Hos mus og rotter akkumuleres NK-celler ud over at fylde deciduaen omkring implantationsstedet mellem de to muskellag i myometriumet af dæmninger i en forbigående struktur kendt som mesometrielymfoidaggregatet af graviditet (MLAp)15 (Figur 1B), også tidligere kendt som den metriske kirtel, hvis funktion endnu ikke er opdaget.
Beskrevet her er en detaljeret protokol over den metode, der anvendes i laboratoriet til at isolere lymfocytter fra livmoderen af gravide mus ved hjælp af en kombination af mekanisk opdeling og enzymatisk fordøjelse. Da hele livmoderen anvendes i metoden, er lymfocytter isoleret fra livmoderen under svangerskabet en blanding af decidual- og myometrieceller. Yderligere dissektion af decidua fra livmodervæggen og dens MLAp er mulig, og det er blevet beskrevet før16. Den metode, der er beskrevet her, blev udviklet til at opnå livmoderlymfocytter og samtidig bevare proteinoverfladeudtryk, cellulær funktionalitet og levedygtighed. Resultatet er en enkelt celle suspension med minimal resterende cellulære vragrester og et udbytte typisk spænder fra 1-5 millioner celler i midten af svangerskabet (10,5 dage) for en gravid livmoder. Anvendelsen af denne metode omfatter phenotyping ved flowcytometri, cellesortering til efterfølgende transskriptomiske eller proteomiske undersøgelser, funktionelle undersøgelser såsom intracellulær cytokinproduktion, degranulation, ELISPOT- eller cytotoksiske analyser. Den protokol, der præsenteres her fokuserer på at identificere gruppe 1 ICS, men kan tilpasses til andre celletyper såsom andre ILCs, T-celler, B-celler, DC, eller makrofager med mindre ændringer af antistof panel, der anvendes til FACS analyse. Protokollen kan også bruges til at isolere celler fra andre væv og til pooled ikke-gravide uteri.
Protocol
Alle dyreforsøg, der er beskrevet i dette dokument, blev udført i henhold til Animals (Scientific Procedures) Act 1986 i henhold til PP2363781 udstedt af det britiske indenrigsministerium. Protokollen nedenfor består af flere sektioner, der starter fra mushold og efterbehandling med farvning til FACS-analyse. Figur 3 afspejler protokollens hovedtrin. De materialer, der anvendes i protokollen, er angivet i materialetabellen.
1. Almindelige mus opdræt, parring og dissektion
- Hold 7-14 uger gamle hunmus under specifikke patogenfri (SPF) betingelser og gruppe-opstaldede (typisk 4-6 hunner i henhold til burstørrelse og dyrs vægt) i 10-14 dage for at udløse Lee-Boot-effekten, hvilket resulterer i østrussynkronisering17.
- Hold stud hanner i SPF betingelser, enkelt-husede, og hvilede i mindst 48 timer mellem hver parring (tid til sæd regenerering). Det er at foretrække at bruge erfarne bevist 3-4 måneder gamle stud mænd, da de typisk er mere performant end de unge.
- For at øge sandsynligheden for, at kvinder bliver gravide, indføres snavset sengetøj fra en mands bur i kvindeburet 3 dage før parring. Dette udløser Whitten effekt18 ved udsættelse for mandlige urin feromoner, og resulterer i synkroniseret østrus samt øget modtagelighed for parring.
- På dag 0 (D0) skal musene sættes op til parring ved hjælp af en studhan pr. to hunner; overveje en plug-rate på ca. 20%-25%.
BEMÆRK: Parring vil sandsynligvis forekomme om natten, da mus er natlige dyr. - Om morgenen efter parring (D0.5) skal du kontrollere, om der er et vaginalt stik, som er en indikator for kopulation (figur 4). Vaginal stikket er en samling af den mandlige ejakulere og typisk fortsætter i op til 8-24 timer efter parring. Tjek stikkene tidligt om morgenen.
- Konsolider de tilsluttede hunner i et nyt bur og øremærke dem. Returner hannerne til deres bure til hvile.
- Ved D9.5 eller 10,5-efter parring skal du forberede 5 ML-rør med 1 mL steril HBSS 1x (med Mg2+ og Ca2+) til vævsindsamling og placere dem på is.
- Fortsæt til dyr aktiv dødshjælp ved cervikal dislokation, efterfulgt af exsanguination at bekræfte døden.
- Arbejd i et sterilt miljø, hvis downstream-applikationen kræver det. Umiddelbart efter aktiv dødshjælp tørres musekroppen med 70% ethanol og fortsætter med dissektion under et laminar flux kabinet med sterile instrumenter.
- Dissekere den gravide livmoder fri for mesometriefedt (figur 5) og placere hele livmoderen i et forberedt og passende mærket 5 mL rør. Hold rørene på is.
2. Mekanisk og enzymatisk fordøjelse af livmoderen
- For at forberede den enzymatiske fordøjelsesopløsning blandes 3 mL pr. livmoder af steril HBSS 1x med 30 μg/mL DNAse og 0,1 Wünsch-enhed (WU)/mL Liberase DH eller 0,52 WU/mL Liberase TM. Sæt opløsningen i et vandbad ved 37 °C.
BEMÆRK: Både Liberase TM og Liberase DH kan bruges. Valget af den ene frem for den anden skal styres af deres potentielle virkning på epitoper, der genkendes af antistoffer, der anvendes til efterfølgende flowcytometrianalyse.
FORSIGTIG: Hvis du bruger lyfile enzymer, skal du arbejde under kølerhjelmen. - Klargør 20 mL 5 mM EDTA i PBS (ingen Ca2+/Mg2+). Halvdelen af opløsningen placeres ved 37 °C i et vandbad og den anden halvdel på is.
- Under et laminar flux kabinet fjernes forsigtigt fedtet omkring den gravide livmoder med sterile instrumenter i en steril petriskål. Lad ikke vævet tørre.
- Disseker hvert implantationssted med sterile instrumenter for at fjerne fostrene (søhestformet translucidstruktur, ca. 1 mm i længden) (figur 6A). Kassér fostrene.
- Returner livmoderen til deres oprindelige samling 5 mL rør og hakkevævet ved hjælp af en saks direkte i 5 mL rør og indsamling medium. Hold rørene på is hele tiden mellem procedurerne.
- De 5 ML-rør, der indeholder hakket væv, i et vandbad ved 37 °C.
- Tilsæt 3 mL varm enzymatisk fordøjelsesblanding til hver prøve, så den samlede mængde væske i røret er 4 mL (1 mL opsamlingsmedium med hakket livmoder og 3 mL enzymatisk fordøjelsesopløsning). Inkuberes 5 ML-rørene i 30 min ved 37 °C med agitation for at forbedre enzymatisk fordøjelsesaktivitet.
- Vortex de 5 ML rør og placere dem på is for at hæmme virkningen af enzymer. Derefter overføres indholdet til korrekt mærket 15 mL centrifugerør.
- Skyl alt ud af de 5 ML rør i 15 mL centrifuge rør ved hjælp af 10 mL iskold 5 mM EDTA PBS løsning.
- Centrifugere de 15 mL centrifugerør, der indeholder det fordøjede væv i 10 min ved 400 x g.
- Kassér supernatanten, svirp forsigtigt pelleten, og brug den derefter i 10 mL varm (37 °C) 5 mM EDTA PBS-opløsning.
- Inkuberes prøverne i de 15 mL centrifugerør ved 37 °C med omrøring i 15 minutter for at fjerne det venstre fordøjelsesmedium og reducere celleklumpningen.
- Vortex prøverne på høj i 10 s for yderligere at lette væv dissociation.
3. Behandling af livmoderen i en enkelt celle suspension
- Brug stemplet af en steril 1 mL sprøjte, tvinge fordøjet væv gennem en 70 μm si på en korrekt mærket og steril 50 mL centrifuge rør til at fjerne cellen klumper og undissociated væv.
- Vask si flere gange med i alt 10 mL kold PBS til at indsamle alle cellerne.
- Drej 50 mL centrifugerøret i 10 min ved 400 x g.
BEMÆRK: Udfør de yderligere trin ved hjælp af mulighed A eller mulighed B. Mulighed A giver bedre berigelse af lymfocytterne med mindre snavs og stromal celleforurening end mulighed B. Men, Option B giver en højere immuncelle udbytte på grund af mindre celletab og mindre variation af celle udbytte mellem prøverne. Mulighed B er også nemmere at udføre teknisk. Afhængigt af præferencen skal du derfor fortsætte med mulighed A eller mulighed B.- Trinnene til alternativ A er som følger.
- Mærk et sterilt 15 mL centrifugerør pr. prøve, der indeholder 5 mL på 80% (v/v) isotonisk Percoll fortyndet i PBS.
- Efter spin skal supernatanten kasseres fra 50 mL centrifugerøret. Brug en pipet dreng til at genbruge hver pille i 8 mL af 40% (v / v) isotonisk Percoll i PBS.
- Brug en pipet dreng på langsom hastighed til omhyggeligt at overlejre pellet re suspenderet i 40% Percoll opløsning på 80% Percoll løsning. Pipette langsomt og kontinuerligt; 15 mL-røret i en vinkel på 45° (figur 6B).
- Uden at forstyrre overlejringen centrifugere 15 mL centrifugerørene i 20 min ved 850 x g ved stuetemperatur (medium acceleration og minimal pause).
- Fjern forsigtigt rørene fra centrifugen uden at forstyrre Percoll-lagene (figur 6C).
- Uden at forstyrre ringen af leukocytter på grænsefladen af de to Percoll-opløsninger skal du bruge en steril Pasteur Pipette til at kassere alle undtagen ca. 0,5-1 mL af det øverste Percoll-lag.
- Mens du forsøger at suge en minimum mængde Percoll opløsning (op til 4-5 mL i alt), omhyggeligt indsamle ringen af leukocytter og overføre cellerne i en ny mærket 15 mL centrifuge rør.
- Fyld hver prøve op med 10 mL steril RMPI-1640 medium suppleret med 10% af varmeinaktiveret FBS.
- Centrifuge i 5 min ved 500 x g ved 4 °C.
- Kassér supernatanten og fortsæt til RBC lysis.
- Trinnene for løsningsmodel B er som følger.
- Mærk et sterilt 15 mL centrifugerør pr. prøve.
- Efter spin skal supernatanten kasseres fra 50 mL centrifugerøret. Brug en pipet dreng til at genbruge hver pille med 8 mL af 35% (v / v) isotonisk Percoll i RPMI-1640 medium.
- Prøverne overføres til 15 mL centrifugerør.
- Centrifuge prøverne ved 940 x g i 10 min ved stuetemperatur med medium acceleration og minimal pause.
- Aspirere supernatant omhyggeligt ved hjælp af en aspirator eller pipette dreng (ikke ved at invertere røret).
- Pjehælen i 14 mL RPMI-1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og centrifugere derefter prøven ved 500 x g i 5 min ved 4 °C.
- Kassér supernatanten ved aspiration og fortsæt til RBC lysis.
- Trinnene til alternativ A er som følger.
4.RBC lysis
- For at lyse RBC'erne skal prøverne genbruges i 3 mL 1x RBC-lysopløsning og inkuberes i 3 min ved stuetemperatur.
- Tilsæt 10 mL PBS i prøverne for at stoppe reaktionen.
- Centrifugere rørene ved 400 x g i 5 min og kassér supernatanten.
- Tilføj 10 mL PBS, og gentag trin 4.3.
- Resuspend hver pille i 1 mL RPMI-1640 medium suppleret med 10% af varmeinaktiverede FBS.
- Pass prøverne gennem sterile 70 μm cellesnæt.
- Udfør celletallet ved hjælp af trypanblå og et Neubauer-kammer i henhold til producentens anvisninger.
- Koncentrationen af celleaffjedringen justeres til 1-2 millioner celler i 100 μL PBS eller medium.
5. Panel design strategi og kontrol
BEMÆRK: Panelet beskrevet i dette papir er egnet til forskelsbehandling af uILC1, trNK, og cNK celler og var designet til at blive brugt på en 5-laser BD LSRFortessa. Mindre ændringer kan foretages for at studere forskellige cellepopulationer og bruge alternative fluorochromes. Det anbefales at kontrollere instrumentets konfiguration ved hjælp af titrerede antistoffer for optimal adskillelse, konsultere producentens lysstyrkeindeks og bruge de lyseste farvestoffer til lav udtrykkende antigener som NKp46 og efter generelle retningslinjer19. Det anbefales at inkludere en fluorescens Minus One (FMO) kontrol for NKp46.
6. Medfødt lymfoid celle farvning til FACS phenotyping
- Overfør 1-2 millioner celler pr. brønd til en rundbundet 96-brønds plade.
- Drej pladen ved 400 x g i 3 min ved 4 °C, og kassér supernatanten ved at svirpe den i en vask.
- Brug cellepillerne i 100 μL PBS (protein og ledfri) ved hjælp af en multikanalpipette.
BEMÆRK: Sørg for, at PBS ikke indeholder natrium-azid, ingen Tris eller proteiner til det efterfølgende trin. - Gentag trin 6.2.
- Resuspendceller i 50 μL fixable levedygtighed farvestof fortyndet i PBS (protein og azid-fri) (1:1,000). Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 30 minutter i mørket.
BEMÆRK: Sørg for, at PBS ikke indeholder natrium-azid, ingen Tris eller proteiner som FBS eller BSA, da dette kan resultere i nedsat farvningsintensitet af døde celler og/eller øget baggrundsfarvning for de levende celler.
FORSIGTIG: Hvis levedygtighed farvestof er pulveriseret, brug under emhætten. - Der tilsættes 150 μL PBS, cellerne genbruges med en flerkanalspipette, og trin 6.2 gentages derefter.
- Brug cellerne igen i 25 μL FACS Buffer (PBS suppleret med 1% BSA eller 2% FBS), der indeholder Fc receptorblokerende reagens. Inkuberes cellerne i 5 min ved 4 °C.
- Der tilsættes 25 μL af en overfladeantistofcocktail.
BEMÆRK: Tjnér altid antistoffer og optimer antistofpanelet før forsøget. - Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 20 min i mørke.
- Der tilsættes 150 μL FACS Buffer til hver brønd, blandes grundigt, og gentag derefter trin 6.2.
- Gentag trin 6.10.
BEMÆRK: Udfør yderligere trin ved hjælp af alternativ A eller indstilling B. Brug mulighed A til at plette cellerne med overflademærker. Brug mulighed B til at studere de intracellulære markører efter flowcytometri.- Trinnene til alternativ A er som følger.
- Resuspend prøverne i 100 μL på 4% paraformaldehyd (PFA) pr. brønd og inkuberes i 20 min ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: Brug PFA under kølerhjelmen. Der henvises til sikkerhedsarket for at kassere PFA-affald/genstande, der er kommet i kontakt med PFA (f.eks. pipetter) sikkert. - Gentag trin 6.2, to gange.
FORSIGTIG: Kassér ikke ved at svirpe ind i vasken her, da den indeholder PFA. Aspirere med en pipette og kassér affaldet i henhold til sikkerhedsarket. - Prøverne genbruges i 200 μL PBS.
- Prøverne overføres til mærkede FACS-rør og fyldes op med 100 μL PBS. Opbevar rørene på is eller i køleskab, indtil de behandles med FACS-analyse. Prøverne erhverves på et flowcytometer inden for 24 timer.
- Resuspend prøverne i 100 μL på 4% paraformaldehyd (PFA) pr. brønd og inkuberes i 20 min ved stuetemperatur.
- Trinnene for løsningsmodel B er som følger.
- Prøverne anvendes igen i 100 μL af fikserings- og permeabiliseringsopløsning pr. brønd (indeholdende paraformaldehyd) og inkuberes i 20 min ved 4 °C.
FORSIGTIG: Brug PFA under kølerhjelmen. Der henvises til sikkerhedsarket for at kassere PFA-affald/genstande, der er kommet i kontakt med PFA (f.eks. pipetter) sikkert. - Gentag trin 6.2.
FORSIGTIG: Kassér ikke ved at svirpe ind i vasken her, da den indeholder PFA. Aspirere med en pipette og kassér affaldet i henhold til sikkerhedsarket. - Tilsæt 200 μL af 1x permeabilisering / vaskebuffer, bland godt, og gentag derefter trin 6.2.
- Gentag trin 6.11.2.3.
- Brug de faste og permeabiliserede celler i 50 μL af 1x permeabiliserings-/vaskebuffer, der indeholder antistofblandinger, til intracellulær farvning.
- Prøverne inkuberes ved 4 °C i 30 min i mørke.
- Tilsæt 200 μL 1x permeabilisering / vaskeopløsning, bland godt, og gentag derefter trin 6.2.
- Gentag trin 6.11.2.7.
- Prøverne genbruges i 200 μL PBS.
- Prøverne overføres til mærkede FACS-rør og fyldes op med 100 μL PBS. Opbevar rørene på is eller i køleskab, indtil de behandles med FACS-analyse. Prøverne erhverves på et flowcytometer inden for 24 timer.
BEMÆRK: Når du har udført denne protokol, er den cidualcelleaffjedring klar til FACS-analyse. Det anbefales at registrere så mange hændelser som muligt pr. prøve. der skal opnås mindst 1.000-3.000 hændelser i en forældrepopulation for at opnå pålidelige resultater.
- Prøverne anvendes igen i 100 μL af fikserings- og permeabiliseringsopløsning pr. brønd (indeholdende paraformaldehyd) og inkuberes i 20 min ved 4 °C.
- Trinnene til alternativ A er som følger.
Representative Results
De vigtigste trin i den metode, der er beskrevet for at opnå en enkelt celle suspension af livmoder leukocytter er sammenfattet i figur 3. Den grundlæggende FACS-gatingstrategi, der anvendes til identifikation af tre delmængder af g1 ICS i B6-mus: uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) og cNK-celler (CD49a-Eomes+). Yderligere analyse af disse populationer kan udføres for at studere forskellige overflade- og intracellulære markører for g1 ICS. Som et eksempel kan co-ekspressionen af IFN-ɣ- og selv-MHC-receptorer vurderes i uILC1-, trNK- og cNK-celler efter stimulering med anti-NK1.1-antistof (figur 7).
Afhængigt af forskningsspørgsmålet kan både protokollen (figur 3) og antistofpanelet tilpasses. Det er vigtigt, at det anbefales at anvende både anti-NK1.1- og anti-NKp46-antistoffer i ét FACS-panel til g1 ILC-gating (figur 2B og tabel 1). Det skal bemærkes, at g1 ILCs fremstillet af blod, milt, eller lever har et højere udtryk for NKp46 på deres overflade end livmoder modstykke (Figur 8). Overfladefarvning til NK1.1 giver en bedre adskillelse og gør det nemt at gatere livmoderg1-ICS (figur 8). Mens NKp46 udtrykkes af alle musestammer, udtrykkes NKR-P1C antigen, der er anerkendt af anti-NK1.1 antistoffet PK136, kun af nogle musestammer, herunder C57BL/6 (dvs. B6), FVB/N og NZB, men ikke i AKR, BALB/c, CBA/J, C3H, DBA/1, DBA/2, NOD, SJL eller 129. Hertil kommer, at hvis investigator har til hensigt at studere afgørende NK celle receptorer såsom MHC receptorer Ly49, Det er vigtigt at være opmærksom på allelic variationer i laboratoriet mus stammer, som opsummerer den høje variation af human killer-celle immunoglobulin-lignende receptorer (KIR). Desuden, hvis cellerne skal stimuleres med NK1.1 til en funktionel analyse, som beskrevet i Kim, S. et al.20, kan det være ønskeligt at plette cellerne med anti-NKp46 snarere end anti-NK1.1, da NKR-P1C antigen kan være besat af crosslinking anti-NK1.1 eller en receptor downregulation kan følge stimulation. Enten receptor belægning eller downregulation kan hindre farvning med det samme antistof, der anvendes til at stimulere.
Et fælles problem med enzymatisk vævs dissociation er ændringen af overflade epitoper på celler af enzymer, der anvendes til en fordøjelse medium. For eksempel er farvning til MHC CD94:NKG2A-receptoren dårlig, hvis Liberase TM anvendes. Fordøjelsen med Liberase DH bevarer dog NKG2A-genkendelse med 16A11 antistofklon (figur 9). Det anbefales at kontrollere enzymernes indflydelse på alle epitoper i ens FACS-panel. Til dette formål skal du bruge suspensionen af musesplenocytter opnået ved mekanisk dissociation (passerer hele milten gennem en 70 μm si). Prøven opdeles derefter i to eller flere dele efterfulgt af inkubation med et medium med eller uden enzymer.
Som tidligere nævnt, blod-afledte celler er til stede i væv dissocierede prøver. Hvis det er nødvendigt, kan blodforurenende stoffer udelukkes ved hjælp af en intravaskulær farvningsmetode som udviklet i Masopust laboratorium21. Figur 10 viser, at omkring 6,5% af g1 ICS til stede i livmodervæv prøver på svangerskabet dag 8,5 er blod-afledt. Anti-CD45 antistoffer, der anvendes til intravaskulær farvning kan konjugeres med et fluorokrom, der anvendes til en dump-kanal; dette vil udelukke blodforurenende stoffer uden at bruge en ekstra fluorescenskanal. De mest almindelige problemer og deres løsninger findes i tabel 2.
Figur 1: Tværsnit af en mus uterus. (A) Mus livmoderen tværsnit (ikke-gravid) angiver en række moderlige leukocytter, som befolker livmoderen. (B) Mus livmoderen tværsnit (drægtighedsdag 8,5). (C) Mus livmoderen tværsnit (drægtighedsdag 13,5). (D) Sammenligning af mus versus menneskelig moderkage dannelse fra blastocyst fase og fremefter. Billeder, der er oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Delpopulationer af livmoderg1 ILC1. (A) Procenter af livmoder cNK, ILC1 og trNK hos mus i det tidlige liv og graviditet. W - uger, gd - drægtighedsdag. Modificeret graf fra Filipovic, I. et al.4. (B) Gating strategi til analyse af livmodergruppe 1 ILC delmængder efter flowcytometri. Lymfocytter blev isoleret fra livmodervævet på drægtighedsdag 10.5. Væv fordøjelse blev udført ved hjælp af en fordøjelse medium, der indeholder Liberase TM. Celler blev gated baseret på deres evne til at sprede lys. Doublets blev udelukket ved hjælp af et FSC-A versus FSC-H-plot, og kun CD45+CD3-CD19- levedygtige celler blev analyseret yderligere. Inden for CD45+CD3-CD19- levedygtige celler blev gruppe 1 ILC-porten identificeret som NK1.1+ NKp46+ celler. Inden for gruppe 1 ICS kan der identificeres tre delsæt: CD49a-Eomes+ konventionelle NK-celler (cNK), CD49a+Eomes+ vævs residente NK-celler (trNK) og CD49a+Eomes- uILC1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: En visuel vejledning til protokollens hovedtrin. (1) Dissekere den gravide livmoder fri for mesometriefedt. (2) Fjern fostrene; livmoderen tilbage til 5 ML-røret og hakke vævet tilbage. Fortsæt med enzym fordøjelse trin: tilsæt 3 mL varm enzymatisk fordøjelse mix til hver prøve. Inkuberes 5 ML-rørene i 30 min ved 37 °C med omrøring. (3) (i) Efter fordøjelsen skylles alt ud af 5 mL-rør i 15 mL rør med 10 mL iskold 5 mM EDTA PBS-opløsning. ii) Centrifuge 15 mL rør indeholdende fordøjet væv i 10 min ved 400 x g. iii) Kassér supernatanten svirp forsigtigt pelleten og genbrug den i 10 mL varm (37 °C) 5 mM EDTA PBS-opløsning. iv) Inkuberes prøver i de 15 ML-rør ved 37 °C med omrøring i 15 min. (4) Brug stemplet af en steril 1 mL-sprøjte, tvinge det fordøjede væv gennem en 70 μm si på et korrekt mærket og sterilt 50 mL rør og spin i 10 min ved 400 x g. (5) Efter spin skal du fortsætte med enten mulighed A (repræsenteret her i diagrammer) eller B. Mulighed A: Kassér supernatanten fra 50 mL-røret, og brug en pipet dreng til at genbruge hver pille i 8 mL på 40% (v/v) isotonisk Percoll i PBS. (6) (i) Mulighed A fortsatte: Ved hjælp af en pipet dreng på langsom hastighed, forsigtigt overlejre pellet re suspenderet i 40% Percoll opløsning på 5 mL af 80% Percoll opløsning. Pipette langsomt og kontinuerligt; 15 mL-røret i en vinkel på 45°. Ii) Uden at forstyrre overlejringen centrifugeres de 15 ML-rør ved 850 x g i 20 min ved stuetemperatur med medium acceleration og langsom brud. (7) Efter spin, mens du forsøger at sutte en minimum mængde Percoll opløsning (op til 4-5 mL i alt), omhyggeligt indsamle ringen af leukocytter. (8) Udfør røde blodlegemer lysis trin. (9) Tæl celle ved hjælp af trypan blå og en Neubauer Afdeling. (10) Overfør 1-2 millioner celler pr. brønd til en rundbundet 96-brøndsplade. (11) Fortsæt med levedygtighed farvestof og antistoffer farvning. (12) Endelig overføres prøverne til mærkede FACS-rør. Opbevar rørene på is eller i køleskab, indtil de behandles med FACS-analyse inden for 24 timer. Billeder, der er oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Vaginal stik (A) og fravær af det (B) i C57BL/6 kvinder på 0,5 dages post parring. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dissektion for at udtrække livmoderen fra en gravid mus. (A) Dæmningen er fastgjort med nåle på et blødt bord for at tørre kroppen med 70% ethanol. To lodrette snit er lavet, som angivet af de blå stiplede linjer. (B) Huden løftes for at eksponere indre organer. Tarmløkkerne flyttes forsigtigt op for at visualisere livmoderen. (C) Livmoderen udtages ved at skære på tre punkter: ved siden af æggestokkene og ved livmoderhalsen, som angivet af henholdsvis de to blå stiplede linjer og den blå pil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Forberedelse af encellet suspension. (A) Mekanisk fjernelse af embryoner fra deres implantationssted. B) Overlejring af Percoll-gradient det øverste lag indeholder enkeltcellet affjedring i 40% af Percoll og det nederste lag 80% af Percoll. (C) Lymfocytringsformation efter centrifugering af percollgradienten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentativ FACS-analyse af funktionel analyse med gruppe 1 ICS. Intracellulær IFN-ɣ og overflade CD107a detektion i gruppe 1 ICS udtrykker NK receptorer for self-MHC (Ly49C, Ly49I, og NKG2A) sammenlignet med dem, der ikke, efter crosslinking NK1.1 med pladebundne antistoffer. Cellerne blev isoleret fra livmodervæv på drægtighedsdag 9,5. Væv fordøjelse blev udført ved hjælp af en fordøjelse medium, der indeholder Liberase DH. Vist er de rå værdier af alle fire kvadranter (hjørner) samt den relative procentdel af responders blandt celler, der udtrykker receptorer for sig selv og responders, der ikke har selvreceptorer (dristige tal). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Farvning af milt- og livmoderlymfocytter med antistoffer mod NKp46 og anti-NK1.1. A) Celleophæng fra muse milt og (B) livmoder ved svangerskabsdagen 10.5 blev adskilt i to; den ene del var plettet med NKp46-APC (rød) og den anden med NK1.1-APC (blå). Bemærk, at NKp46 farvning af livmoder lymfocytter ikke adskiller NKp46 + og NKp46- celler så pænt som milt lymfocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Fald i NKG2A MFI (antistofklon: 16A11) ved inkubation med fordøjelsesmedium. Celleaffjedring af C56BL/6 musesplenocytter blev opdelt i tre dele. En del blev inkuberet i Liberase DH-fordøjelsesmedium (HBSS indeholdende 0,13 WU/mL Liberase DH og 30 μg/mL DNAse), og en anden del blev inkuberet med Liberase TM-fordøjelsesmedium (HBSS indeholdende 0,52 WU/mL Liberase TM og 30 μg/mL DNAse). Den tredje del blev behandlet med pæn HBSS i 30 min ved 37 °C. Udtrykket af NKG2A-markør på g1 ICS blev vurderet ved flowcytometri. Graf taget fra Shreeve N. Den rolle, livmoder NK-celle hæmning i graviditeten (Afhandling); Vejleder: Colucci F, 2020. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Intravital farvning med anti-CD45 antistoffer mod udelukkelse af blodafledte g1 ICS. En C57BL/6 dammus ved drægtighedsdag 8.5 blev aflivet 3 min efter intravenøs injektion med 3 μg CD45-AF647. Livmoderen, fuldblod, og thymus blev høstet og behandlet til FACS analyse. X-aksen viser signalet fra intravenøs farvning med CD45-AF647, og Y-akse demonstrerer signal fra in vitro-farvet CD45-BUV395. Procentdelen af delpopulationer er vist i kvadranter. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistof / Farvestof | Klon | Fluorochrome | Laser | |
| 1 (Dump kanal) | Zombie Violet Fixable levedygtighed farvestof | Violet | ||
| CD19 | 1D3 | BV421 | ||
| CD3 | 145-2C11 | BV421 | ||
| 2 | CD45 | 30-F11 | FITC | Blå |
| 3 | NK1.1 | PK136 | BV605 | Violet |
| 4 | NKp46 | 29A1.4 | APC | Rød |
| 5 | CD49a | Ha31/8 | BUV395 | Ultraviolet |
| 6 | EOMES | Dan11mag | PE | Grøn |
Tabel 1: Et eksempel på FACS-panel til konventionelle 5-lasere cytometer.
| Problem | Mulig årsag | Forslag |
| Celleringen er ikke synlig ved grænsefladen af to percollopløsninger | Dårlig lagdeling af percollopløsning eller blanding af to lag under prøvehåndtering | Vær ekstra forsigtig med ikke at bryde 80% percoll puden under overlejring. Vær opmærksom under prøvehåndtering: Forstyr ikke percoll-grænsefladen |
| Lavt antal leukocytter (f.eks. når du bruger en ikke-gravid livmoder) | Grænsefladen kan ses, selv når cellenummeret på grænsefladen er meget lavt. Selv hvis ringen ikke er synlig, opsamles væske ved mellem 40% og 80% percollopløsninger, da der stadig kan være nok celler til videre behandling | |
| Ufuldstændig RBC lysis | Cellerne blev ikke suspenderet korrekt i lysbufferen | Pipetteceller op og ned for at bryde klumperne og genbruge celler fuldt ud i lysbufferen |
| Lysing løsning er kold | Ekvilibrere lysopløsningen til stuetemperatur før brug | |
| Forlænge inkubationstiden med lysopløsningen op til 15 minutter | ||
| RBC lysis trin kan gentages | ||
| Lavt celleudbytte | Dårlig enzymatisk fordøjelse | Kontroller, om enzymer ikke er forældede og er blevet opbevaret i henhold til deres manualer |
| Celletab under vasketrin | Undersøg cellepillen efter hvert vasketrin: den uigennemsigtige pellet i bunden af brønden efter spin. Brug af V-bund i stedet U-bund plader, swing rotor centrifuge, længere centrifugering tid kan reducere celletab | |
| Vævsprøve indeholder et lavt antal lymfocytter (f.eks. når du bruger en ikke-gravid livmoder) | Pool flere livmoder for at opnå nok begivenheder til analyse. Overvej at bruge alternativ B i protokollen til celleisolation | |
| Høj variation af absolutte leukocyttal fra mus i samme gruppe | Inkonsekvent samling af celler på grænsefladen af 40% og 80% percoll løsninger | Sørg for at samle hele cellefraktionen på percoll-grænsefladen. Overvej at bruge alternativ B i protokollen til celleisolation |
| Ikke i stand til at opdage forventede lymfocyt delpopulationer / markører eller usædvanligt lav MFI for nogle celleoverflade markører | Enzymatisk fordøjelse påvirker overfladeudtrykket af nogle epitoper eller deres nedbrydning | Optimere enzymatisk fordøjelse ved at ændre: enzym (f.eks. til forskellige typer liberase eller kollagenase) og/eller længden af inkubation og/eller enzymkoncentration |
| Høj baggrundsstøj i flowcytometeret | Høj andel af celleaffald eller RBC-forurening | Juster parameteren FOR FSC-tærskel. Overvej at bruge alternativ A i protokollen til celleisolation |
Tabel 2: Fejlfindingsvejledning.
Discussion
Metoden indeholder flere kritiske trin, der diskuteres herefter. Det første kritiske skridt er at opnå flere synkrone graviditeter som den relative hyppighed af leukocyt populationer ændringer gennem graviditet. At have flere dæmninger på samme svangerskabsdag giver mulighed for enten biologiske gentagelser i de samme eksperimenter eller samle lymfocytter fra individuelle dæmninger for at opnå større antal, der kræves til downstream applikationer. Timet parring gør det muligt for forskeren at lokalisere undfangelsen inden for en 24 timers periode. Selvom mus lever i omkring 2,5 år, vil de være af reproduktiv alder fra 4-7 uger til 6-8 måneder gamle. Da yngre mus normalt producerer mindre hvalpe, parres hunmus generelt ikke, før de er mellem 6-8 uger, og hanmus, indtil de er mellem 8-10 uger. I betragtning af at østrus varer ca. 15 timer i mus og forekommer hver 4-5 dage, er den typiske parringshastighed (afsløret af et vaginalt stik, se figur 4) omkring 25%. Det er derfor vigtigt at bruge mus i østrus og planlægge et tilstrækkeligt antal til at opnå det nødvendige antal dæmninger til et givet forsøg. Østrus cyklus fase kan bestemmes af vaginal smear cytology22. Stikhastigheden kan forbedres ved at hvile mænd 48 timer før parring og ved at drage fordel af Whitten-effekten18. Alternativt kan man administrere gravid hoppe serum, som efterligner effekten af det endogene follikelstimulerende hormon, fremkalder oocytmodning og 42-50 timer senere human chorionic gonadotropin, som efterligner effekten af det endogene luteiniserende hormon, der fremkalder ægløsning. Denne hormonelle behandling omgår kravet om østrus og gør stort set alle behandlede kvinder modtagelige.
Et andet kritisk skridt er at sikre kvaliteten af FACS farvning. Antistoffer, der anvendes i flowcytometri, skal altid titreres og anvendes ved den optimale koncentration, og det er nødvendigt at kontrollere, at den enzymatiske fordøjelse ikke kløve afgørende antigene epitoper. For at vurdere, om et enzym vil kløve en epitop, kan man plette to fraktioner af den samme prøve parallelt, den ene gennemgår enzymatisk og den anden mekanisk fordøjelse. På samme måde er brugen af passende kontroller og enkelte pletter afgørende for at opnå pålidelige data. For sjældne begivenheder, kan perler bruges til at generere enkelt plet prøver. Det anbefales ikke at bruge perler til opsætning af spændinger, men snarere en population af celler, der indeholder lymfocytter og andre leukocytter, såsom splenocytter. Hvis der anvendes perler, er det nødvendigt at titrere antistoffer til perlefarvning, så fluorescensintensiteten af farvede perler vil kunne sammenlignes med cellernes fluorescensintensitet. I tilfælde af vanskeligheder med at adskille positive fra negative celler for en bestemt markør kan en FMO-kontrol også bruges til at lette gating for en bestemt markør. For intracellulære markører skal der anvendes en isotypekontrol, da intracellulær farvning kan resultere i resterende ubundne antistoffer, som stadig kan være til stede i cellerne efter vasketrinene og derfor øge baggrundssignalet. Det anbefales at køre prøverne inden for 24 timer efter fastsættelse af cellerne for at opnå de bedste resultater i phenotyping ved FACS analyse, som autofluorescence stiger betydeligt over tid og fluorescens intensitet af nogle antistoffer kan falde over tid.
En anden afgørende faktor at overveje er downstream-anvendelsen af den enkeltcellede suspension, der er opnået med protokollen. For funktionelle analyser er det vigtigt at arbejde under sterile forhold. Tilsvarende er det for efterfølgende omics undersøgelser vigtigt at arbejde i steril og RNase, DNase og protease-fri.
Protokollen præsenteres her fokuserer på phenotyping gruppe 1 ICS, men kan tilpasses til phenotyping andre celletyper ved at ændre antistofpanelet. Det anbefales, at alle antistoffer testes mod fordøjet og ikke-fordøjet celleaffjedring for at påvise tab/ændring af overflade epitoper ved enzymatisk behandling. Tilsvarende kan forskellige enzymer bruges til at fordøje vævet og øge celleudbyttet, men dets virkning på afgørende antigene epitoper skal omhyggeligt undersøges. Mens NKp46 er en god markør for milt NK-celler og virker i alle stammer af laboratoriemus, er udtrykket NKp46 på uNK-celler i C57BL/6 mus betydeligt lavere end på milt NK-celler. Det er bedst at plette for både NK1.1 og NKp46 samtidigt. Hvis flere organer skal sammenlignes direkte, anbefales det at behandle alle prøver lige, selvom den enzymatiske fordøjelse ikke er nødvendig for væv som milten eller knoglemarven. Selv om den metode, der præsenteres her gælder for den ikke-gravide livmoder, lymfocyt ring isolation ved en to-faset Percoll gradient vil være udfordrende, og udbyttet af isolerede celler kan være for lavt til pålidelig FACS analyse og derfor vil kræve sammenlægning celler isoleret fra livmoderen af individuelle, ikke-gravide mus23.
Der er begrænsninger i protokollen til at overveje for fortolkningen af dataene. Som det er tilfældet for alle væv, cirkulerende lymfocytter, der kommer fra blodet vil blive isoleret sammen med væv-resident celler. Hvis udelukkelsen af cirkulerende lymfocytter er afgørende for datafortolkning, kan intravital farvning udføres for at mærke cirkulerende celler. Desuden er en anden begrænsning af protokollen, at nogle celler vil gå tabt, da ikke alle celler kan udvindes fra vævet. De mest almindelige problemer og deres fejlfinding præsenteres i tabel 2.
Historisk set har studiet af celler i væv været baseret på histologisk undersøgelse af vævsafsnit. Sandra Peel's fremragende gennemgang24 opsummerer det arbejde, der er gjort over mere end 100 år indtil slutningen af 80'erne. Beskrivelser af celler senere kendt som uNK celler faktisk vises i manuskripter offentliggjort mere end et halvt århundrede før lymfocytter blev endda opdaget. Så før opdagelsen af NK-celler i 1975, og uNK-cellerne er blevet angivet som moderens glykogenceller eller granulerede metriske kirtelceller. Anne Croy har ydet store bidrag på området25 og venligt undervist holdet dissektion hun havde optimeret3, og det bruges i øjeblikket. Selv om det er medvirkende til at beskrive morfologi og væv placering af uNK celler, klassisk histologisk undersøgelse er begrænset til påvisning af kun et par markører på cellerne af interesse. I 2008 blev en flowcytometribaseret metode til samtidig at opdage flere markører på livmoderlymfocytter beskrevet26. Dette er hovedsagelig den metode, der er blevet beskrevet i dette papir. Nyere teknologier såsom rumlige transskriptomics og billeddannelse ved massecytometri kombinerer kraften i histologi og flowcytometri, hvilket gør det muligt både samtidig påvisning af flere gener eller proteiner og bevarelsen af den normale vævsarkitektur.
Anvendelsen af den metode, der er beskrevet her, er flere og omfatter FACS phenotyping, funktionel analyse (såsom ELISPOT, degranulation eller cytotoksiske assays), celle sortering, og efterfølgende transcriptomics eller proteomics. Yderligere applikationer, der kunne udvikles baseret på denne metode omfatter kultur og udvidelse af decidual NK celler efter celle sortering eller berigelse ved negativ udtømning. I øjeblikket er der ingen protokol til kultur og udvide mus uNK celler og bevare deres levedygtighed og funktionalitet i en længere periode, på samme måde som menneskelige NK celler, der kan dyrkes og udvides i 7-14 dage ved tilsætning af IL-2 eller en kombination IL-12 og IL-15. Optimering af en sådan metode til mus uNK celler ville give mere fleksibilitet, når de udfører funktionelle assays og giver mulighed for flere betingelser, der skal testes med et højere celletal. På den anden side, kultur betingelser er kendt for at ændre den unikke fæmfotype af lymfocytter og potentielt deres funktion også.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre og ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker de tidligere og de nuværende teammedlemmer, der har hjulpet med at udvikle denne metode, herunder Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic og Anita Qualls. Denne forskning blev finansieret af Wellcome trust [Grant nummer 200841/Z/16/Z] og Medical Research Council (MR/P001092/1). Med henblik på åben adgang har forfatteren anvendt en CC BY-licens til offentlig ophavsret på enhver forfatter accepteret manuskriptversion, der følger af denne indsendelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
| BSA | Sigma | A9647-100G | |
| CD19 antibody | BD | 562701 | |
| CD3 antibody | BD | 562600 | |
| CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
| CD49a antibody | BD | 740262 | |
| DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
| EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
| Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
| Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
| Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
| Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
| NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
| NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
| Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
| PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
| PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
| Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
| RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
| Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |
References
- Colucci, F.
- Mor, G., Aldo, P., Alvero, A. B. The unique immunological and microbial aspects of pregnancy. Nature reviews. Immunology. 17 (8), 469-482 (2017).
- Croy, A., Yamada, A., DeMayo, F., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , Elsevier, Academic Press. (2014).
- Filipovic, I., et al. Molecular definition of group 1 innate lymphoid cells in the mouse uterus. Nature Communications. 9 (1), 4492 (2018).
- Chen, Z., et al. DBA-lectin reactivity defines mouse uterine natural killer cell subsets with biased gene expression. Biology of Reproduction. 87 (4), 81 (2012).
- Moffett, A., Colucci, F. Uterine NK cells: active regulators at the maternal-fetal interface. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 1872-1879 (2014).
- Gaynor, L. M., Colucci, F. Uterine natural killer cells: Functional distinctions and influence on pregnancy in humans and mice. Frontiers in Immunology. 8, 467 (2017).
- Sojka, D. K., Yang, L., Yokoyama, W. M.
- Wilkens, J., et al. Uterine NK cells regulate endometrial bleeding in women and are suppressed by the progesterone receptor modulator asoprisnil. The Journal of Immunology. 191 (5), 2226-2235 (2013).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon γ contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine. 192 (2), 259-270 (2000).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nature Medicine. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Chakraborty, D., Rumi, M. A. K., Konno, T., Soares, M. J. Natural killer cells direct hemochorial placentation by regulating hypoxia-inducible factor dependent trophoblast lineage decisions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16295-16300 (2011).
- Crespo, ÂC., et al. Decidual NK cells transfer granulysin to selectively kill bacteria in trophoblasts. Cell. 182 (5), 1125-1139 (2020).
- Shmeleva, E. V., Colucci, F. Maternal natural killer cells at the intersection between reproduction and mucosal immunity. Mucosal Immunology. , 1-15 (2020).
- Kather, A., et al. Neither lymphotoxin alpha nor lymphotoxin beta receptor expression is required for biogenesis of lymphoid aggregates or differentiation of natural killer cells in the pregnant mouse uterus. Immunology. 108 (3), 338-345 (2003).
- Croy, B. A., et al. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods in Molecular Biology. 612, Clifton, N.J. 465-503 (2010).
- Vander lee, S., Boot, L. M.
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. The Journal of Endocrinology. 13 (4), 399-404 (1956).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Kim, S., et al. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 436 (7051), 709-713 (2005).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Caligioni, C. S.
- Doisne, J. -M., et al. Composition, development, and function of uterine innate lymphoid cells. Journal of Immunology. 195 (8), Baltimore, Md. 3937-3945 (2015).
- Peel, S. Fate of GMG Cells. Granulated Metrial Gland Cells Advances in Anatomy, Embryology and Cell Biology. 115, Springer. Berlin. (1989).
- Croy, B. A., vanden Heuvel, M. J., Borzychowski, A. M., Tayade, C. Uterine natural killer cells: a specialized differentiation regulated by ovarian hormones. Immunological Reviews. 214, 161-185 (2006).
- Yadi, H., Burke, S., Madeja, Z., Hemberger, M., Moffett, A., Colucci, F. Unique receptor repertoire in mouse uterine NK cells. Journal of Immunology. 181 (9), Baltimore, Md. 6140-6147 (2008).
