Summary
タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。
Abstract
タンパク質チオールの可逆的酸化修飾は、最近、細胞機能の重要なメディエーターとして浮上しています。ここでは、タンデム質量タグ(TMT)同重体標識および液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)と組み合わせて、酸化タンパク質チオールのマルチプレックス確率法をプロテオームレベルで定量できる、樹脂支援捕捉(RAC)を利用した定量的レドックスプロテオミクス法の詳細な手順について説明します。酸化システイン残基に関する部位特異的な定量情報は、そのような修飾の機能的影響に関するさらなる洞察を提供します。
このワークフローは、培養細胞(哺乳類、原核生物など)や組織全体(心臓、肺、筋肉など)など、多くのサンプルタイプに適応でき、最初に溶解/ホモジナイズされ、人工酸化を防ぐために遊離チオールがアルキル化されます。酸化されたタンパク質チオールは、チオール親和性樹脂によって還元および捕捉されるため、タンパク質/ペプチドを追加で移すことなく、消化、標識、洗浄手順を実行できるため、ワークフローのステップが合理化および簡素化されます。最後に、標識ペプチドを溶出し、LC-MS/MSで分析して、プロテオーム全体にわたるチオール酸化に関連する包括的な化学量論的変化を明らかにします。この方法は、タンパク質チオール酸化に関連する生理学的および病態生理学的状態下での酸化還元依存性調節の役割の理解を大幅に向上させます。
Introduction
恒常性条件下では、細胞は活性酸素、窒素、または硫黄種を生成し、代謝やシグナル伝達などのプロセスを促進するのに役立ちます1,2,3、原核生物と真核生物の両方にまで及びます。これらの反応性種の生理学的レベルは、「ユーストレス」としても知られる適切な細胞機能に必要です1,4。対照的に、酸化剤と抗酸化物質のバランスを崩す酸化剤の増加は、酸化ストレス、または「苦痛」1を引き起こし、細胞の損傷につながる可能性があります。酸化剤は、タンパク質、DNA、RNA、脂質などのさまざまな生体分子を修飾することにより、生物学的経路にシグナルを伝達します。特に、タンパク質のシステイン残基は、システイン上のチオール基に起因して酸化を起こしやすい反応性の高い部位であり、異なる種類の酸化剤に対して反応性を示す5。これにより、ニトロシル化(SNO)、グルタチオニル化(SSG)、スルフェニル化(SOH)、ペルスルフィド化(SSH)、ポリスルフィド化(SSnH)、アシル化、ジスルフィドなど、システインに対するさまざまな可逆的レドックスベースの翻訳後修飾(PTM)が生じます。システイン酸化の不可逆的な形態には、スルフィニル化(SO2H)およびスルホニル化(SO3H)が含まれる。
システイン残基の可逆的酸化修飾は、さらなる不可逆的酸化を防止する保護的役割を果たすか、または下流の細胞経路のシグナル伝達分子として役立ち得る6,7。一部のチオールレドックスPTMの可逆性により、システイン部位は「レドックススイッチ」として機能し8,9、これらの部位の酸化還元状態の変化はタンパク質機能を変化させ、一過性プロセスにおける役割を調節します。酸化還元PTMs10の調節効果は、触媒作用12、タンパク質間相互作用13、立体配座変化14、金属イオン配位15、または薬理学的阻害剤結合16を含むタンパク質機能11の多くの側面において観察されている。さらに、レドックスPTMは、転写17、翻訳18、または代謝19などの経路を調節するタンパク質のシステイン部位に関与しています。酸化還元PTMがタンパク質の機能と生物学的プロセスに与える影響を考えると、酸化還元状態の摂動に応答してシステイン部位が受ける酸化の程度を定量化することが重要です。
酸化還元状態が変化したシステイン部位の同定は、通常の条件と摂動状態の間の部位特異的レベルでの酸化状態の比較に焦点を当てています。フォールド変化測定は、どのシステイン部位が研究にとって生理学的に重要であるかをユーザーが解釈するのに役立つため、どの部位が大幅に変化しているかを判断するためによく使用されます。あるいは、特定のサンプルタイプにわたる可逆的なチオール酸化の化学量論的測定は、細胞酸化に関する生理学的状態の全体像を示しますが、これは見過ごされ、十分に活用されていないことが多い重要な測定値です。修飾化学量論は、修飾チオールの割合を総タンパク質チオール(修飾および未修飾)に対する比率として定量することに基づいています20,21。その結果、化学量論的測定は、特に質量分析を使用する場合、倍率変化よりも正確な測定を提供します。酸化の増加の重要性は、化学量論を使用して特定のシステイン部位のPTM占有率を決定することにより、より容易に確認できます。たとえば、チオール酸化の3倍の増加は、わずか1%から3%、または30%から90%の大きな遷移に起因する可能性があります。占有率が1%しかない部位の酸化が3倍に増加しても、タンパク質の機能にはほとんど影響しない可能性があります。ただし、休止状態で30%の占有率を持つサイトの3倍の増加は、より実質的に影響を受ける可能性があります。化学量論的測定は、総酸化チオールとタンパク質グルタチオニル化(SSG)およびニトロシル化(SNO)を含む特定の酸化修飾との間で実行されると、特定の修飾タイプに関する比率および定量的情報を明らかにすることができる。
可逆チオール酸化は通常、低存在量の翻訳後修飾であるため、これらの修飾を含むタンパク質を生物学的サンプルから濃縮するために複数のアプローチが開発されています。Jaffreyらが考案したビオチンスイッチ技術(BST)22と呼ばれる初期のアプローチには、未修飾のチオールをアルキル化によってブロックし、可逆的に修飾されたチオールを新生の遊離チオールに還元し、新生の遊離チオールをビオチンで標識し、標識タンパク質をストレプトアビジン親和性プルダウンによって濃縮する複数のステップが含まれます。この技術は、多くの研究でSNOおよびSSGのプロファイリングに使用されており、他の形態の可逆チオール酸化のプローブに適合させることができます23,24。BSTは、さまざまな形態の可逆的チオール酸化のプローブに利用されてきましたが、このアプローチの懸念の1つは、非ビオチン化タンパク質のストレプトアビジンへの非特異的結合によって濃縮が影響を受けることです。私たちの研究室で開発された別のアプローチである樹脂支援捕獲(RAC)25,26(図1)は、ビオチン-ストレプトアビジン系を介したチオール基の濃縮の問題を回避します。
可逆的に酸化されたチオールの還元に続いて、新生遊離チオールを有するタンパク質は、遊離チオール基を共有結合的に捕捉するチオール親和性樹脂によって濃縮され、BSTよりもシステイン含有タンパク質のより特異的な濃縮を可能にする。RACと、アイソバリック標識および質量分析の最近の進歩のマルチプレックスパワーを組み合わせることで、プロテオーム全体のレベルで可逆的に酸化されたシステイン残基の濃縮、同定、定量のための堅牢で高感度なワークフローが作成されます。質量分析の最近の進歩により、チオールレドックスプロテオームのより深いプロファイリングが可能になり、タンパク質チオール酸化の原因と結果の両方の理解が深まりました27。部位特異的な定量データから得られた情報は、可逆的酸化修飾の機構的影響および下流効果のさらなる研究を可能にする28。このワークフローを利用することで、SSGのレベルが年齢に関して異なる老化などの通常の生理学的イベントに対する可逆的なシステイン酸化の生理学的影響についての洞察が得られました。SSGに対する老化効果は、ミトコンドリア機能を高め、老化マウスのSSGレベルを低下させる新規ペプチドであるSS-31(エラミプレチド)を使用して部分的に逆転し、若いマウスにより類似したSSGプロファイルを持つようになりました29。
ナノ粒子曝露に起因する病態生理学的状態は、マウスマクロファージモデルにおいてSSGが関与することが示されている。RACと質量分析を組み合わせて使用することで、SSGレベルが酸化ストレスの程度とマクロファージ貪食機能の障害に直接相関していることが示された。データはまた、異なる程度の酸化ストレスを誘発する異なる工学的ナノ材料に応答する経路特異的な違いを明らかにした30。この方法は、原核生物種でもその有用性を証明しており、チオール酸化に関する光合成シアノバクテリアの日周周期の影響を研究するために適用されました。電子伝達、炭素固定、解糖など、いくつかの重要な生物学的プロセスにわたるチオール酸化の広範な変化が観察されました。さらに、直交検証により、いくつかの重要な機能部位が修飾されていることが確認され、これらの酸化的修飾の調節的役割が示唆された6。
ここでは、標準化されたワークフローの詳細を説明し(図1)、タンパク質の総酸化システインチオールの濃縮とその後の標識および化学量論定量に対するRACアプローチの有用性を実証します。このワークフローは、細胞培養物27,30および全組織(例えば、骨格筋、心臓、肺)29,31,32,33を含む異なるサンプルタイプにおける酸化還元状態の研究において実施されている。ここには含まれていないが、RACプロトコルは、前述のように、SSG、SNO、およびS-アシル化を含む特定の形態の可逆的酸化還元修飾の調査にも容易に適合させる25,29,34。
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Protocol
動物またはヒトのサンプル/組織に関連するプロトコルに記載されているすべての手順は、ヒトおよび動物の研究倫理委員会の制度的ガイドラインによって承認され、それに従いました。
1. サンプルの均質化/溶解
- 凍結組織サンプル
- 凍結組織(~30 mg)を、あらかじめ冷やしたカミソリの刃と鉗子を使用してドライアイス上でスライドさせてガラス顕微鏡上でミンチします。ミンチ組織を700 μLのバッファーA( 表1を参照)を含むプレチルド5 mL丸底ポリスチレンチューブに移し、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。
- 30秒間、またはハンドヘルド組織ホモジナイザーで完全に均質になるまで組織を破壊します。サンプルを氷の上に置き、泡をさらに10分間鎮静させます。
注意: ドライアイスの上に置かれたアルミニウム天板は、組織の初期処理/ミンチのための安定した作業面とプラットフォームを提供します。
- あるいは、100 mm培養皿中の接着細胞培養物を出発材料として使用します。
- 細胞を氷上に保ち、血清学的ピペットを使用して、100 mM NEMを含む10 mLの氷冷PBSで細胞を2回すすぎます。
- 1 mLの冷ホモジナイズ/溶解バッファーを加え、硬質セルスクレーパーで激しく掻き取って細胞を溶解します。マイクロピペットを使用してライセートを2 mL遠沈管に移します。
注:リンスバッファーと溶解バッファーは、異なるサイズの培養容器に応じてスケーリングできます。通常、2〜500万個のセルが必要です。ただし、これは特定の細胞タイプの溶解効率とタンパク質収量によって異なります。ホモジナイズバッファーは、全チオールについて分析されるサンプルに対してNEMなしで調製することができる。
- 得られたホモジネート(ステップ1.1.2または1.2.2)をマイクロピペットを使用して2 mL遠沈管に移し、4°Cで10分間、全速力(≥16,000 × g)で遠心分離します。
- マイクロピペットを使用して上清(細胞培養の場合は~700 μLまたは~1 mL)を5 mLのコニカルマイクロ遠心チューブに移し、850 rpmで振とうしながら暗所で55°Cで30分間インキュベートします。
- ガラス血清学的ピペットを使用して、4 mLの氷冷アセトンをサンプルに加え、-20°Cで一晩インキュベートして、タンパク質の沈殿と過剰な N-エチルマレイミドの除去を行います。
2. 樹脂アシストキャプチャ
- 沈殿したタンパク質ペレットをアセトンで2回洗浄し、20,500 × g で4°Cで10分間遠心分離し、アセトンをデカントし、マイクロピペットを使用して残りのアセトンを除去し、ガラス血清学的ピペットを使用して3 mLの新鮮な氷冷アセトンを加えます。数回反転させて混ぜます。2回目の洗浄後、ペレットを1〜2分間風乾させ、再懸濁が困難になる可能性があるため、過度に乾燥させないように注意してください。
- マイクロピペットを使用して、1mLのバッファーB( 表1を参照)を追加し、出力250Wおよび短時間のボルテックスを有するバス超音波処理器を使用して、一度に15〜30秒間の繰り返し超音波処理を用いてタンパク質を可溶化する。メーカーのプロトコルに従って、ビシンコニン酸(BCA)アッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
- さらなる処理のためにサンプル間でタンパク質濃度を標準化し、NEMを完全に除去するには、マイクロピペットを使用して500 μgのタンパク質を0.5 mL 10 kDa遠心フィルターに移し、再懸濁バッファーで最終容量500 μLに調整します。
- 遠心フィルター内の容量が100μL未満になるまで、室温で14,000 × g で遠心分離します。 収集チューブ内のフィルターを反転させてサンプルを収集します。1,000 × g で2分間遠心分離し、バッファーCを使用して最終容量500 μLに調整します( 表1を参照)。
- マイクロピペットを使用して20 μLの500 mMジチオスレイトール(DTT)を最終濃度20 mMまで添加し、850 rpmで振とうしながらサンプルを37°Cで30分間インキュベートすることにより、タンパク質チオールを減らします。
- 還元後、マイクロピペットを使用してサンプルを0.5 mLの10 kDa遠心フィルターに移し、室温で14,000 × g で15分間、または遠心フィルター内の容量が100 μL未満になるまで遠心分離します。 バッファーD( 表1を参照)を加えて、遠心フィルター内の容量を500 μLにします。
- ステップ2.6で500μLへの添加と遠心分離を3回繰り返し、4回目の遠心分離後、回収チューブ内でフィルターを反転させ、1,000× g で2分間遠心分離してサンプルを回収します。
- メーカーのプロトコルに従ってBCAアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。
- このバッファー交換の際、マイクロ天秤を用いて適量の樹脂(30mg/サンプル)を秤量し、50mL遠沈管に移してチオール親和性樹脂を調製します。次に、血清学的ピペットを使用して、最終濃度30 mg/mLの樹脂の水を加え、室温で1時間インキュベートしながら攪拌して、樹脂を適切に水和させます。
注:上記のチオール親和性樹脂は、メーカーによって製造中止になりました。このチオール親和性樹脂の可能な代替品が市販されている。ただし、この置換品の結合能力は約5倍少なくなります( 補足情報を参照)。あるいは、チオール親和性樹脂は、2−(ピリジルジチオ)エチルアミン塩酸塩および N−ヒドロキシスクシンイミド活性化樹脂を用いて合成することができる( 補足情報を参照)。- 樹脂の水和後、スピンカラムを真空マニホールド上に置き、マイクロピペットを使用して500 μLの樹脂スラリーを各カラムに移します。水分を除去するために真空を適用します。この手順を1回繰り返して、カラムあたり合計30 mgの樹脂を得ました。あるいは、このステップとすべての樹脂洗浄および溶出ステップに真空マニホールドを使用する代わりに、1,000 × g で2分間遠心分離します。
注:1000 μLピペットチップの端を切断してボアサイズを大きくすると、樹脂の移動に役立ちます。ピペッティングの間に粉砕して、樹脂が懸濁したままであり、均一で等量の樹脂が各カラムに移されるようにすることが重要です。 - マイクロピペットで500μLの超純水を加え、真空を加えて樹脂を洗浄し、水分を除去します。これを5回繰り返します。その後、500 μLのバッファーEで樹脂を5回洗浄します( 表1を参照)。
注:あるいは、1,000 x g で2分間遠心分離を、後続のすべての洗浄ステップで真空マニホールドの代わりに使用することもできます。進行中のすべての洗浄ステップは、500μLの容量で実行されます。洗浄バッファーをカラムに加えるときは、樹脂の飛沫や損失を避けながら、樹脂を完全に再懸濁させるのに十分な力で慎重に添加してください。これにより、樹脂の完全かつ効率的な洗浄が可能になります。
- 樹脂の水和後、スピンカラムを真空マニホールド上に置き、マイクロピペットを使用して500 μLの樹脂スラリーを各カラムに移します。水分を除去するために真空を適用します。この手順を1回繰り返して、カラムあたり合計30 mgの樹脂を得ました。あるいは、このステップとすべての樹脂洗浄および溶出ステップに真空マニホールドを使用する代わりに、1,000 × g で2分間遠心分離します。
- マイクロピペットを使用して、還元した各サンプルから150 μgのタンパク質を新しいチューブに移し、最終容量の120 μLのバッファーCに調整します( 表1を参照)。マイクロピペットを使用してタンパク質溶液を樹脂を含む詰まったスピンカラムに移し、カラムにキャップを置き、850 rpmで振とうしながら室温で2時間インキュベートします。
- 樹脂を25 mM HEPES、pH 7.0で5回洗浄します。8 M尿素;続いて2 M NaClで5回;続いて、80%アセトニトリル(ACN)と0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で5回続きます。最後に、ステップ2.8.2で説明されているように、25 mM HEPES、pH 7.7で5回、プラグを交換します。
注:サンプルは、ステップ4.1に記載されているように、タンパク質レベルでの分析(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、ウェスタンブロットなど)のためにここで溶出できます。
3. オンレジントリプシン消化とTMTラベリング
- 最終容量がサンプルあたり少なくとも120 μLになるように、バッファーC( 表1を参照)に0.5 μg/μLの濃度で可溶化することにより、サンプルあたり6〜8 μgの十分なシーケンシンググレードの修飾トリプシン溶液を調製します。マイクロピペットを使用して、このトリプシン溶液120 μLをサンプルに加え、850 rpmで振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。
注:消化効率を高めるために、トリプシン溶液を除去して新しい溶液と交換することにより、翌日追加の消化ステップを含め、2時間消化を続けることができます。 - 樹脂を25 mM HEPES、pH 7.0で5回洗浄します。続いて5回2 M NaCl;続いて80%ACNで0.1%TFAで5回続きます。続いて、25 mM HEPES、pH 7.7で3回行った。最後に、50 mMトリエチルアンモニウム重炭酸バッファー(TEAB)で樹脂を2回洗浄し、プラグを交換します。
- TMT標識試薬を調製するには、まず室温まで温めてから、遠心分離機を16,000 × gで短時間スピンダウンします。マイクロピペットを使用して、TMT標識試薬の各バイアルに150 μLの無水ACNを追加します。バイアルを室温で850 rpmに設定されたサーモミキサーで5分間インキュベートし、試薬を完全に可溶化します。16,000 × g で短時間ボルテックスしてスピンダウンし、試薬を回収します。
- マイクロピペットを使用して、洗浄した樹脂に100 mM TEABを40 μL加え、次に溶解したTMT試薬70 μLを加え、850 rpmで振とうしながら室温で1時間インキュベートします。残りのTMT試薬は-80°Cで保存してください。
注:各生物学的サンプルに割り当てられた個々のTMTラベルに注意してください(図1)。 - 前述のように、0.1% TFAを含む80%ACNで5回、100 mM重炭酸アンモニウムバッファー(ABC)、pH 8.0で3回、水で2回レジンを洗浄し、プラグを交換します。
4. ペプチド溶出
- マイクロピペットを用いて100 mM ABC、pH 8.0の20 mM DTTを100 μL添加して標識ペプチドを各カラムに溶出し、850 rpmに設定したサーモミキサー上で室温で30分間インキュベートします。
注意: DTTの添加後、樹脂は凝集します。樹脂をピペットチップで破壊して、塊を破壊し、ペプチドの完全な溶出を確実にすることができます。 - このインキュベーションの後、固相抽出(SPE)用の真空マニホールドにカラムを置き、真空を適用して、サンプルを5 mLマイクロ遠心チューブに溶出します。この手順を一度繰り返します。
- 最後に、100 μLの80%ACNと0.1%TFAを加え、室温で10分間インキュベートし、同じ5 mL遠沈管に溶出します。すべての画分を同じ5 mLマイクロ遠心チューブに集めます。
注:サンプルの損失を防ぐために、溶出には低結合チューブを使用し、単一の5 mLチューブの容量は4.0 mL以下に維持する必要があります。 - 溶出したサンプルを乾燥するまで真空濃縮器に入れます。乾燥ペプチドを-80°Cで保存し、後で再懸濁します。
注:サンプルは個別に溶出することもでき、サンプルを組み合わせる前に、アリコートを除去してSDS-PAGEで分析し、ペプチドレベルで分析することができます。
5. ペプチドアルキル化および脱塩/クリーンアップ
- マイクロピペットを使用して、pH 8.0(500 μL以下)の少量の100 mM ABCバッファーを加えて、乾燥したペプチドを再懸濁します。250 Wの出力と渦を持つバス超音波処理器を使用して一度に15〜30秒間繰り返し超音波処理を使用して、2mLチューブに可溶化して転送します。
注:添加する100 mM ABC、pH 8.0の容量は、150 mMのモル濃度でDTTを再懸濁するために必要な容量に基づいています。ユーザーは、手順 4.1 で最初に追加された内容に基づいて、サンプルに存在する DTT の量を決定する必要があります。 - マイクロピペットを使用してABCに溶解したヨードアセトアミド(IAA)の濃縮ストック溶液(600 mM)を加えて、DTT:IAAのモル比を1:4にし、サンプルをRTで850 rpmで振とうしながら1時間インキュベートします。
- マイクロピペットを使用して濃縮TFA(10%)を加えてサンプルをpH < 3に酸性化し、製造元の指示に従って逆相クリーンアップを使用してサンプル脱塩を実行します。
- きれいなペプチドを乾燥するまで真空濃縮器に入れます。乾燥ペプチドは、さらに分析されるまで-80°Cで保存してください。
6. 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析
- 250Wの出力を有するバス超音波処理器を使用し、3%ACNを含む20〜40μLの水中でボルテックスすることにより、一度に15〜30秒間超音波処理を繰り返すことにより、乾燥ペプチドを再懸濁する。メーカーのプロトコルに従ってBCAアッセイを実行してペプチド濃度を決定します。
- 前述のように逆相LCとMS/MSでサンプルを分離し6、400〜2000のm/z範囲でMS1スペクトルを記録します。高エネルギー衝突解離(HCD)を利用して、等圧標識ペプチドの分析のためのレポーターイオン強度情報を取得します。機器の運転条件27,30およびMSデータの分析27,31の詳細については、以前のレポートの方法のセクションを参照してください。
注:異なるLC-MS/MSシステムまたは設定を使用して、ペプチドサンプルを分析することができます。ペプチド同定のカバレッジと感度は、使用される特定のシステムと設定によって異なります。
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Representative Results
プロトコルの完了は、以前に酸化されたシステイン含有ペプチドの非常に特異的な濃縮をもたらし、多くの場合、>95%の特異性を有する27,35,36。しかしながら、プロトコルのいくつかの重要なステップは、特別な注意を必要とする、例えば、人工酸化および人工的に酸化されたチオールの非特異的濃縮を禁止するサンプル溶解/均質化前の遊離チオールの初期ブロッキング25。サンプルは、プロトコルのいくつかの段階で、タンパク質とペプチドの両方のSDS-PAGE分析を含むさまざまな方法で分析できます。SDS-PAGEは、全チオールサンプルが処理/刺激による異なるレベルの酸化を決定するためのサンプル間のレシオメトリック比較を可能にするサンプルの定性分析を可能にします(図2A)。個々のタンパク質の酸化レベルをさらに調査するために、SDS-PAGEゲルをウェスタンブロッティングに供してもよい36(図2B)。これにより、モデルシステムをより詳細に分析し、ネットワークと生物学的経路に関する裏付けデータとさらなる仮説を生成できます。LC-MS/MSで分析したシステイン含有ペプチドのレポーターイオン強度は、個々のCys部位レベルでのチオール酸化化学量論を定量するために使用できます(図2C、D)。
図1:サンプル処理ワークフロー。 サンプル処理ワークフローは、さまざまなサンプルタイプや生物学的システムにおけるチオール酸化の調査に適応できます。このワークフローにより、タンパク質レベルとペプチドレベル(SDS-PAGE、ウェスタンブロットなど)の両方で酸化を調べることができ、HPLCと質量分析を組み合わせて個々のシステイン部位を定量的かつ部位特異的に同定するための深いカバレッジが可能になります。サンプル処理は、高品質で一貫性のあるデータを生成するためのいくつかの重要なステップの完了を含め、わずか3日で完了することができます。TMTラベリングによるサンプルマルチプレックスにより、複数のサンプルを同時に並行して処理することができます。代表的な10プレックスTMTラベリングスキームは、全チオールチャネルからの潜在的なクロストークを考慮してサンプルをどのように配置できるかを示しています。TMT試薬の同位体不純物では、高強度の1つのチャネル(全チオールなど)のシグナル強度が、シグナル強度の低い別のチャネルに寄与し、その定量に影響を与える可能性があります37。スキームでは、プールされた全チオールチャネル(対照サンプルと実験サンプルの組み合わせ)は、高レベルのCysペプチドを含むと予想され、チャネル130Nにシグナルを持つ131Nで標識されます。したがって、チャネル130Nは実験では使用されません。TMTラベルによって生成されるチャネルクロストークの量は、試薬の対応するバッチのメーカーの分析証明書に記載されています。この図は、Guo et al., Nature Protocols, 201425から改作されたものである。略語:NEM = N-エチルマレイミド;DTT = ジチオスレイトール;SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動;SPE =固相抽出;LC-MS/MS = 液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析;TMT = タンデム質量タグ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:RAC濃縮からのペプチドの分析 。 (A)化学酸化剤であるジアミドで30分間処理したRAW264.7細胞からの酸化ペプチドのSDS-PAGE分析を、増加濃度(0.1および0.5 mM)および総ペプチドチオールで処理しました。このサブ図およびサブ図Dは、Guoら、Nature Protocols、2014 25から適応されています。ペプチドは銀染色により可視化した。(B)RAW 264.7細胞を、外因性オキシダント(過酸化水素およびジアミド)で増加濃度で処理した。得られたSSG濃縮タンパク質溶出液をSDS-PAGEで分離し、続いて個々のタンパク質(GAPDH、TXN、PRDX3、およびANXA1)についてウェスタンブロットでプローブしました。このサブ図は 、Su et al., Free Radical Biology and Medicine, 201436から改作されている。(C)Xcaliburソフトウェアで見たシステイン含有ペプチドの代表的なMS/MSスペクトルデータ。挿入図MS/MS画像は、各TMTチャネルの同じペプチドの対応するレポーターイオン強度を示しています。この実験では、全チオールサンプルを、実験で使用されたすべてのチャネルの中で最も強度の高いTMTラベル131Nに割り当てました。(D)LC-MS/MSで測定したiTRAQ標識、濃縮、酸化ペプチドの化学量論。全チオールチャネルは、全チオールチャネルと比較した各サンプルのレポーターイオン強度の比に基づいて酸化の化学量論を計算するための基準として使用されました。略語:RAC =樹脂支援キャプチャ。SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動;Ctrl = コントロール;GAPDH =グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ;TXN = チオレドキシン;PRDX3 = チオレドキシン依存性過酸化物レダクターゼ;ANXA1 = アネキシンA1;LC-MS/MS = 液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析;MS / MS =タンデム質量分析;TMT =タンデム質量タグ。iTRAQ = 相対定量および絶対定量用のアイソバリックタグ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| バッファー名 | 目的 | 内容 |
| バッファ A | 溶解/均質化 | 250 mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES), pH 6.0;1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS);1%トリトンX-100;および100 mM N-エチルマレイミド(NEM) |
| バッファ B | タンパク質沈殿および最初のバッファー交換後の再懸濁 | 250 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、pH 7.0;8 M尿素;0.1% SDS |
| バッファ C | システイン含有タンパク質の還元/濃縮/消化 | 25 mM HEPES, pH 7.7;1 M尿素;0.1% SDS |
| バッファ D | 削減後の2回目のバッファ交換 | 25 mM HEPES, pH 7.0, 8 M 尿素;0.1% SDS |
| バッファ E | 水和後の樹脂の洗浄 | 25 mM HEPES, pH 7.7 |
表 1. バッファのリスト
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Discussion
樹脂支援捕捉は、システイン残基の酸化的修飾の研究のために、様々なサンプルタイプおよび生物学的系にわたって利用されている25、29、30。この方法では、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を使用したタンパク質およびペプチド、ならびに質量分析を使用した個々のシステイン部位を含む、複数のレベルおよび読み出しでサンプルの評価が可能になります。試料の種類または最終エンドポイントにかかわらず、この方法は最終的にシステイン含有タンパク質およびペプチドの非常に効率的かつ特異的な濃縮を可能にする38。RACを用いて、摂動後の異なるモデル系における最大数千のシステイン部位の酸化状態の変化を特定しました。
疲労筋収縮を受けたマウスでは、2,200のS-グルタチオニル化部位が同定され、半数以上がS-グルタチオニル化のレベルを有意に変化させました32。RACは、光合成阻害剤または異なる光条件への曝露後のシアノバクテリアの>2,100部位の可逆的チオール酸化のプロファイリングにも使用されています6。最近、我々は、休止条件下でのRAW 264.7マクロファージ細胞における>4,000システイン部位の全可逆チオール酸化およびS-グルタチオニル化をプロファイリングした27。同様に、Behringらは、上皮成長因子刺激後のA431細胞における~4,200個のシステイン部位の酸化を定量化した39。これらの研究は、可逆的なチオール酸化を受ける多くのシステイン部位(少なくとも数千)を同定するRACの堅牢性を実証しています。さらに、サンプルの分画により、実験から回収されたペプチドのカバレッジを高めることができます。
実験対照の外で、ここで、陽性または陰性対照試料のいずれかがモデル系の生物学的応答を確認するために採用されてもよく、全チオール濃縮はチオールの酸化と並行して行われてもよい。この全チオールサンプルは、化学量論的比較と、実験サンプルまたは処理サンプルを比較できるベースラインの両方を提供します。要するに、この全チオールサンプルは、所与の試料中の所与のCys部位に対するシステインチオールの総数の測定値を提供する。この概念は、酸化システイン40と比較するために「総システイン含有量」を表す完全に還元されたチオールを含むサンプルを生成するOxiTMT法でも採用されました。
OxiTMTとは対照的に、RACはヨードTMTのプレックス数に制約されないため、より多くの総チオールチャネルを組み込んで、研究で使用される複数のサンプルタイプのチオール含有量をより適切に表すことができます。さらに、チオールレドックスプロテオミクスワークフローと並行してグローバルサンプル(濃縮の対象とならない)を調製して、異なるサンプルタイプでタンパク質の存在量が変化するかどうかを確認する必要がある場合があります。この方法は複数のタイプの酸化還元修飾に適応可能であるため、目的の特定の修飾に対する適切な制御を考慮する必要があります。例えば、紫外線と塩化水銀はどちらもタンパク質からSNOを切断するのに効果的であり、SNO7,25の測定に効果的なネガティブコントロールを作成します。SSG修飾タンパク質を調査するための効果的な対照は、還元ステップ中に還元カクテルからグルタレドキシン酵素を省略することです。グルタレドキシンの比較的高い特異性のために、その省略はSSG修飾タンパク質の減少を排除し、それらがジスルフィド交換を受け、最終的に最終分析において濃縮されることを妨げる36。
RAC のワークフローには、高品質で再現性のあるデータを生成するための基本的なステップがいくつかあります。最初の重要なステップの1つであり、最も重要なのは、広いpH範囲41,42で迅速に反応する膜透過性アルキル化剤N-エチルマレイミド(NEM)を使用した遊離チオールのアルキル化/ブロッキングです。このステップは、サンプル処理中に新生チオールが酸化されることを禁止し、ジスルフィド交換濃縮中のこれらの人工的に酸化されたチオールの非特異的濃縮を軽減します。不十分なアルキル化は、以前の報告6で特定されたように、バックグラウンドと偽陽性シグナルの増加をもたらします。
ただし、反応性が高く、遊離チオールをブロックする能力があるため、濃縮前にサンプルから完全に除去するように注意する必要があり、残りのNEMが結合して樹脂カップリングを妨害し、最終的にタンパク質結合の減少によるシグナルが失われる可能性があります。これは、アセトン沈殿および分子量カットオフフィルターを使用した数ラウンドのバッファー交換を行うことによって達成される。プロトコル全体で適切なpHを監視および維持することも重要です。濃縮前のジスルフィドシャッフルおよび混合ジスルフィドの形成を軽減するために、6.0のpHが維持されます。特別な注意が必要な他のステップには、適切な濃縮と溶出のためにそれぞれ7.7と8.0のpH値が必要な濃縮ステップと溶出ステップが含まれます。これらのステップ中に誤ったpH値は、シグナルの減少または損失をもたらす。
今日まで、システインチオール酸化の研究に広く使用されているRAC以外にも、最も使用されている方法であるビオチンスイッチ技術を含む多くの化学ベースの方法があります43,44。RACを含むこれらすべての方法に共通していることの1つは、酸化システインを検出するための間接的な方法に基づいていることです。それらは、検出のために元の酸化チオールの化学的に修飾された中間体に依存しています。ただし、RACを他の方法と一線を画す重要な属性は、酸化チオールの特定のシステイン部位に関する多重化された定量データを収集できることです。
この方法は、樹脂に共有結合したタンパク質/ペプチドを用いて行われるため、さらなる取り扱いを行うことなく、進行工程(還元、標識、洗浄、消化など)を実行できます。マルチプレックスサンプルに対してLC-MS/MSを実行することで、プロテオーム全体の発見を可能にするデータセットが生成されます。複数のサンプルグループにわたる特定の治療または刺激の効果がグローバルレベルで観察され、新しいメカニズムと経路の発見が可能になります。基本的なワークフローは、エンドユーザーの特定のニーズと関心のある分野に非常に適応できます。質量分析データで観察された所見の直交検証は依然として課題です。特定の部位の部位特異的突然変異誘発および結果として生じる影響を調査するアッセイの利用は、一般的であるが労働集約的なアプローチである。
生物学的に重要であり得る候補部位をスクリーニングするために、バイオインフォマティクス研究を用いて、活性部位または二次構造への部位の近接性など、高レベルの酸化を有する部位の特性についてさらに学習することができる27。分子動力学シミュレーションは、タンパク質構造に対する酸化還元修飾の影響をモデル化し、タンパク質の機能がどのように影響を受けるかについての洞察を提供できるため、将来の研究で大きな価値があることが証明される可能性があります13,45。この堅牢な戦略を実施することにより、科学界がこの方法を独自のモデルシステムに適応させ、酸化還元生物学の現在の知識を多くの異なるモデルや生物学的システムに拡大することで利益を得ることを願っています。
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Disclosures
著者は、金銭的またはその他の利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
作業の一部は、NIH助成金R01 DK122160、R01 HL139335、およびU24 DK112349によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(Pyridyldithio)ethylamine hydrochloride | Med Chem Express | HY-101794 | Reagent for in-house resin synthesis |
| 2.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind centrifuge tubes | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL round bottom tubes | Falcon | 352054 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Activated Thiol–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | Potential replacement for thiol-affinity resin |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Bicinchonicic acid (BCA) | Thermo Scientific | 23227 | Protein Assay Reagent |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Homogenizer | BioSpec Products | 985370 | |
| Iodoacetimide (IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | Reagent for in-house resin synthesis |
| QIAvac 24 Plus vacuum manifold | Qiagen | 19413 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| Sonicator | Branson | 1510R-MT | |
| Spin columns | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E reverse phase columns | Phenomenex | 8B-S001-DAK | Peptide desalting |
| Thermomixer | Eppendorf | 5355 | |
| Thiopropyl Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | Thiol-affinity resin; *Production of Thiopropyl Sepharose 6B resin has been discontinued by the manufacturer (see protocol for details). |
| TMT isobaric labels (16 plex) | Thermo Scientific | A44522 | Peptide labeling reagent; available in multiple formats |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Trypsin | Promega | V5820 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus speedvac | Eppendorf | 22820001 | vacuum concentrator |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 |
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