Summary
本稿では、前臨床用の単純ヘルペスウイルスの増殖、精製、滴定の簡単な方法について述べる。
Abstract
腫瘍分解性ヘルペス単純ヘルペスウイルス(oHSV)などの腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の分野で急速に成長している治療戦略です。oHSVを含むOVは、抗腫瘍免疫を誘導しながら、癌細胞(健康/正常細胞を温見する)で選択的に複製し、殺す。これらのユニークな特性のために、oHSVベースの治療戦略は、FDA承認タリモジーンラヘルパレベック(T-Vec)を含む、前臨床的および臨床的に癌の治療のためにますます使用されています。成長、精製、滴定は、実験的研究に活用する前に、oHSVを含むあらゆるOVに不可欠な3つの実験室技術です。本論文では、Vero細胞でoHSVを増幅する簡単なステップバイステップの方法について述べている。oHSVが増殖するにつれて、ベロ細胞に細胞パシー効果(CPE)を生み出す。感染細胞の90〜100%がCPEを示すと、それらは穏やかに収穫され、ベンゾナーゼおよび塩化マグネシウム(MgCl2)で処理され、濾過され、スクロース勾配法を用いて精製を行う。精製後、感染性oHSV(プラーク形成単位またはPPFとして指定される)の数は、Vero細胞における「プラークアッセイ」によって決定される。本明細書に記載されたプロトコルは、細胞培養および生体内動物実験におけるインビトロ研究のための高い対値oHSVストックを調製するために使用することができる。
Introduction
腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の新しいユニークな形態です。OVは、抗腫瘍免疫を誘導しながら腫瘍細胞(正常/健康細胞を温かく温かみ)1に選択的に複製およびライゼする。単純ヘルペスウイルス(oHSV)は、すべてのOVの中で最も広範に研究されたウイルスの一つです。それは、タリモジーン・ラヘルパレプベック(T-VEC)が進行黒色腫3の治療のために米国でFDAの承認を受けた最初で唯一のOVである、診療所で最も遠いです。T-VECに加えて、他の多くの遺伝子組み換えoHSVは、異なる癌タイプ3、4、5、6、7、8で前臨床的および臨床的にテストされている。現在の高度な組換えDNAバイオテクノロジーは、治療トランスジーン3、5にコードする新しいoHSVをエンジニアリングする可能性をさらに高めています。oHSVの伝播、精製、およびタイターの決定の効率的なシステムは、(新しく開発された)oHSVをインビトロおよびインビボ研究のためにテストする前に重要である。本論文ではoHSV成長(ベロ細胞)、精製(ショ糖勾配法による)、および滴定(Vero細胞におけるoHSVプラークアッセイによる)の簡単なステップバイステップの方法について説明する(図1)。これは、任意のバイオセーフティレベル2(BSL2)実験室の設定で簡単に前臨床試験のための高品質のウイルスストックを達成するために採用することができます。
ベロは、アフリカの緑色のサルの腎臓細胞株であり、vero細胞が欠陥のある抗ウイルスインターフェロンシグナル伝達経路14を有するoHSV伝播9、10、11、12、13に最も一般的に使用される細胞株である。インターフェロン遺伝子の不活性化刺激因子(STING)シグナル伝達を有する他の細胞株も、oHSV増殖12,13に使用することができる。このプロトコルは、oHSV増殖およびプラークアッセイのためにベロ細胞を利用する。伝播後、oHSV感染細胞は、採取、分解、精製を行い、そこで、細胞をまずベンゾナーゼヌクレアーゼで処理して宿主細胞DNAを分解し、核酸タンパク質凝集を防止し、細胞ライセートの粘度を低下させる。ベンゾナーゼの適切な活性化は、多くの場合、Mg2+を必要とするため、1-2 mM MgCl2がこのプロトコル15で使用されます。ベンゾナーゼ処理細胞リセートからの宿主細胞の破片は、高速スクロース勾配遠心分離の前に連続濾過によってさらに除去される。粘性25%のスクロース溶液クッションは、スクロース層を介したウイルス移動の速度を遅くし、宿主細胞関連成分を上清に残し、ペレット16の浄化およびウイルス損失の制限を改善するのに役立つ。精製されたoHSVは、次いでベロ細胞上で滴定され、そしてウイルスプラークは、17またはX-gal染色(LacZコードoHSV用)18のギムサ染色によって視覚化される。
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Protocol
1) oHSVの成長
注:oHSVと協力する前に、機関バイオセーフティ委員会の承認を確認してください。この研究は、承認されたIBCプロトコルNo.18007の下で行われました。BSL2の注意を維持する:すべてのピペット、先端、チューブ、およびウイルスに接触する他の材料を漂白する。手がBSL2細胞培養フードを離れる前に70%イソプロピルアルコールとスプレー手袋。ウイルスを扱った後は、常に石鹸水で手を洗ってください。
- 1日目に、20-150 cm2 フラスコの低通路ベロ細胞を、通常のベロ細胞培地で10個の細胞 /フラスコの密度を7~8×10個の細胞/フラスコに播種する。
注:ベロ培地は、ダルベッコの修飾ワシ培地(DMEM)に10%熱不活性化胎児子牛血清(IFCS)を加えることによって調製されます。 - 0日目(細胞は80-90%コンフルエント)、ベロ細胞にoHSV接種を加える。
- ウイルス接種の準備
- ウイルス増幅のために0.01(MOIはウイルスの複製能力によって0.01から0.1まで変化する可能性がある)の多重度(MOI)を使用してください。20 フラスコのウイルス (mL) の量を計算するには、式 (1) を使用します。
20フラスコのウイルス量(mL)=必要なウイルス量(pfu)/ウイルスストックの力量(pfu/mL)(1) - 高グルコースダルベックコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)を1%IFCSを加えて使用して、ウイルス接種物(T-150 cm2 フラスコあたり7 mL、すなわち20フラスコで〜140mL)を調製する。必要量のoHSVを140 mLの高グルコースDPBS/1%IFCS溶液に加え、1分間ボルテックスを加え、ベロ細胞に添加する準備ができておきます。
- ウイルス増幅のために0.01(MOIはウイルスの複製能力によって0.01から0.1まで変化する可能性がある)の多重度(MOI)を使用してください。20 フラスコのウイルス (mL) の量を計算するには、式 (1) を使用します。
- T-150 cm2 フラスコ 2x を 1%IFCS (10 mL/洗浄) を補った高グルコース DPBS で洗浄します。DPBS/1% IFCS を吸引し、7 mLのウイルス接種/T-150 cm2 フラスコを加えます。
- ベロ単層上の接種物の適切な分布のためにフラスコロッカーを使用して5分間フラスコを穏やかに揺らし、37°Cでフラスコを1.5〜2時間インキュベートします。インキュベーター棚がレベルであることを確認してください。
- 接種を取り除き、1%のIFCS(25 mL/フラスコ)を添加してDMEMを加えます。フラスコを2~4日間インキュベートします。
- ウイルス接種の準備
- フラスコの CPE が毎日 90~100% かどうかを確認します( 図 2を参照)。
- oHSV感染したベロ細胞を収穫する。
- 培養上清(〜20mL)を各フラスコ(各フラスコに約5mL)から50mL円錐形遠心分離管または媒体容器に入れて回収する。
- セルスクレーパーを使用して、フラスコの底部から細胞を優しく削ります。
注:セルはすぐにフラスコから外れるはずです。 - 各フラスコ(各フラスコに〜20mLの体積、すなわち20個のフラスコに400mL)に培養上清(ステップ1.4.1で収集)の〜15mLを加え、10mLの滅菌血清学的パイプを使用してフラスコの底部を数回静かに洗います。
注:積極的にピペット しないでください 。すべてのセルをそのままに保つことを目指します。 - 氷上の50 mL円錐形遠心分離管に細胞(+培地)を収集します(8チューブを使用して、20フラスコから400mLの収穫細胞を保持します)。
- 4°Cで10分間 300g で細胞を回転させ、上清を吸引します。
- 1.25 mL (50%)のウイルスバッファー (VB) および 1.25 mL (50%)各遠心管に(ステップ1.4.1で収集された)培養上清の各遠心管に、そして各ペレットを十分に再懸濁する。再懸濁した細胞を8本の50 mL遠心分離管から1本の50 mL円錐形遠心分離管に移します。
注: 表 1の VB ソリューションの準備を参照してください。メディア滅菌フィルターを使用してVB溶液をフィルター殺菌します。再懸濁液用のT-150cm2 フラスコあたり0.5mLの上澄み物を使用し、すなわち、20フラスコ(20mL)、10mLのVBと10mLの培養上清を使用する。 - ドライアイス/100%エタノールを使用して再懸濁セルをスナップフリーズし、-80°Cで保存します。
2) oHSV精製
- スナップフリーズ(ドライアイスと100%エタノール)/解凍(37°C温水浴中)に、細胞に続いて1分間水浴超音波処理を行い、細胞の適切なリシスを確実にして上清にウイルスを放出させる。
注:40 kHz、120 Vパワーを使用して1分間の超音波処理を行います。チューニング可能な超音波処理器が利用できない場合は、超音波水浴超音波処理器を使用してください。セクション3の滴定に対して50 μLのアリコートを取り、精製手順中にウイルス損失の原因となる可能性のあるステップを特定するのに役立ちます。 - ベンゾナーゼヌクレアーゼ(175単位/mL)+2 mMMgCl2(1M ストック=2μL/mL)、渦、37°Cで30分間インキュベートを使用して細胞リセートを処理します。 チューブを氷の上に置き、4°Cで次の手順を実行します。
- 低速遠心分離により細胞デブリをペレット化する。
- 300gで細胞ライセートを10分間回転させます。
- 上清を新しい50 mL円錐形遠心分離管に集める(細胞ペレットをVBの0.5 mLで再中断し、ペレット-1と指定し、ステップ2.3.5で使用するために4°Cで保存する; 図1参照)。
- 上清を 500g で再び10分間回転させます(ステップ2.3.2で得られます)。
- 上清を新しい50 mL円錐形遠心分離管に集める(細胞ペレットをVBの0.5 mLに再中断し、ペレット-2と指定し、ステップ2.3.5で使用するために4°Cで保存する; 図1参照)。
- 再懸濁されたペレット-1(2.3.2から)とペレット-2(2.3.4から)を新しい1.7 mL遠心管、渦/超音波(水浴)2xに組み合わせ、400 g で10分間スピンします。上清を収集し、ステップ2.3.4で得られた上清とそれを組み合わせます。 図 1を参照してください。
注:ステップ2.4の濾過手順の前にウイルス凝集を防ぐために40 kHz、120 Vパワーを使用して1分間の超音波処理を行います。セクション3で滴定のために結合された上清の50 μLアリコートを取る。
- 次の3ステップ濾過法を使用して、結合した上清(〜21mL、すなわち1.4.6から20mL、2.3.2から0.5mL、2.3.4から0.5 mL)をフィルター処理します。
- 上清の21mLを10mLシリンジ(フィルターを通り抜けやすくするために毎回5〜7mL)を使用して引き出し、新しい50 mL円錐形遠心分離管 (TUBE 1とラベル付け)に配置された無菌5μmポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜フィルターを通してそれを渡す。
- 2.4.1で空になった50 mLの円錐形遠心分離管に1 mLを加え(ウイルス上清の残りの微量を収集するため)、渦、 およびチューブ1 に配置された同じ5 μm PVDFフィルターを通過します(合計で22 mLの濾液をもたらします)。ステップ 2.4.2 に進みます。
- チューブ1から濾液の22mLを引き出し(2.4.1のように)、新しい50 mL円錐形遠心分離管(TUBE 2として標識)に置かれた無菌0.8 μm混合セルロースエステル(MCE)膜フィルターを通します。
- ステップ2.4.2で空になった 1mLのVBを、 渦に加え、 チューブ2 に配置された同じ0.8 μm MCEフィルタを通過します(合計で23mLの濾液を持ち込みます)。ステップ 2.4.3 に進みます。
- チューブ2から23mLの濾液を引き出し(2.4.1のように)、新しい50 mL円錐形遠心管(チューブ3としてラベル付け)に配置された無菌0.45 μm PVDFフィルターを通します。
- ステップ2.4.3で空になった チューブ2 にVBの1mLを追加し、ボルテックス、チューブ 3 に配置された同じ0.45 μm PVDFフィルタを通過します(合計で24mLの濾液をもたらします)。
注:セクション3で滴定のために濾液の50 μLアリコートを取ります。
- ステップ2.4.3で空になった チューブ2 にVBの1mLを追加し、ボルテックス、チューブ 3 に配置された同じ0.45 μm PVDFフィルタを通過します(合計で24mLの濾液をもたらします)。
- 上清の21mLを10mLシリンジ(フィルターを通り抜けやすくするために毎回5〜7mL)を使用して引き出し、新しい50 mL円錐形遠心分離管 (TUBE 1とラベル付け)に配置された無菌5μmポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜フィルターを通してそれを渡す。
- スクロース勾配法による高速遠心分離
注: 固定角度 F13-14x50cy ローターはこのプロトコルで使用されました。ローターと遠心分離機は、次の手順に進む前に4°Cでなければなりません。- 氷冷、滅菌濾過25%スクロース溶液(ハンクのバランス塩溶液100 mLに25gのスクロース粉末を溶解して調製)を新しい50 mL円錐形遠心分離管に加えます。
- ゆっくりと(3 mL/分)スクロース層の上に24mLのウイルス濾液(ステップ2.4.3.1から得られる)を加える。ウイルス濾液とスクロース溶液の別々の層を維持するように注意してください。
注:最大30mLのウイルス層をスクロース溶液の10mL以上に添加することができます。 - 4°Cで22,620gで90分間チューブを遠心分離します。
- 上清とスクロース層を50 mL円錐遠心管から取り除きます。
注:ウイルスペレットは白っぽいはずです。上清の50 μLのアリコートと、セクション3の滴定用ショ糖層の50 μLアリコートを取ります。
- ペレットを10%グリセロール/PBS溶液に再懸濁します。
- 50 mL円錐形遠心分離チューブに滅菌10%グリセロール(PBSで希釈)を1 mL加えてペレットを覆います。
注: 再懸濁液の量はペレットサイズによって異なる場合があります(0.8~1.2 mLなど)。より小さいボリュームは、ウイルスのより高い濃度を与えるだろう. - 50 mL円錐形遠心分離チューブを氷の上に2〜4時間置きます。この期間中、ペレットを取り外す/再中断するのを助けるために30 sのための15分ごとにペレットを超音波処理/渦。
- 再懸濁ペレット(10%グリセロール/PBSの1 mL+ペレットサイズは、2 mLマイクロ遠心分離管で、総容積を〜1.3 mLにする)を収集します。[オプション:同じ50 mL円錐遠心管にさらに0.3 mLを加えてペレットの残りの微量を収集し、上下にピペットし、ステップ2.6.3で再懸濁ペレットと組み合わせて総体積を~1.6 mLにします。
- ステップ2.6.3の懸濁液が濁ったり曇り(細胞の破片による)、チューブを500gで10分間遠心し、上澄を新しい2mLマイクロ遠心分離チューブに移し、ステップ2.6.4に進む。
- セクション3でoHSV滴定のための50 μLアリコートを取ります。アリコート溶液の残りの部分(250 μL/アリコート)は、スクリューキャップ(長期保存のためによく密封された)を備えた無菌マイクロ遠心チューブに、スナップフリーズ、使用まで-80°Cで保存します(oHSV力価が決定されると実験試験の準備ができています)。
注:ウイルスに接触するすべての材料は、フードや処分から除去する前に、漂白または紫外線で処理する必要があります。
- 50 mL円錐形遠心分離チューブに滅菌10%グリセロール(PBSで希釈)を1 mL加えてペレットを覆います。
3. oHSV滴定とプラークアッセイ
- Seed 1.7-1.8 x 105 ベロ細胞/ウェルをベロ細胞培地の 6 ウェル細胞培養プレートに含めます (DMEM 10% IFCS; ステップ 1.1 参照)。
注: セルがウェル全体に均一に分布していることを確認してください。ウェルの真ん中に細胞の蓄積を引き起こす可能性があるプレートを旋回しないでください。渦巻きを防ぐために、ゆっくりと縦に手でプレートを揺らし、水平に、そしてゆっくりとインキュベーターにプレートを置きます。 - 翌日(細胞が70-80%合流に達したとき)、培養培地を吸引し、1%IFCSを添加した高グルコースPBSの1mL/wellを加える。ステップ3.3が完了するまで、プレートを細胞培養フードに残します。
- PBS/1% IFCS を使用して、5 mL ポリプロピレンチューブでウイルスを連続的に希釈します (図 3)。
メモ:シリアル希釈には、ステップ2.6.4で収集した50 μLのアリコートを使用してください。第1管(10-3希釈)で、1998 μLのPBS/1%IFCS、渦の2μLのウイルスを加える。第2管(10-5希釈)で、PBS/1%IFCS、渦の990 μLの1番目のチューブから10 μLを取ります。3番目のチューブ(10-6希釈)では、PBS/1%IFCS、渦の900 μLの2ndチューブから100 μLを取ります。10-9希釈までこの10倍の連続希釈を続ける。図 3の詳細を参照してください。 - PBS/1% IFCS を吸引し、連続希釈ウイルス (10-5 から 10-9)の 0.7 mL/ウェルを Vero 細胞に加えます。
メモ:細胞を乾燥させないでください。 - プレートをロッカーにゆっくり揺らす 5 分間室温(ウイルス接種の均質な分布を確保するため)。
- プレートを37°Cで1.5時間インキュベートします。
注:この潜伏期間中、1%IFCSを補充したDMEMでヒト免疫グロブリンG(IgG)の1:1000希釈を調製してください。6ウェルプレートの場合、ステップ3.7で2 mL/wellを使用できるように12.5mLを準備します。ヒトIgGのロット変動を考慮して希釈を調整します。 - ウェルからウイルス接種を除去し、1%IFCSを添加したDMEMに0.1%のヒトIgG(培養培地中のoHSVを中和し、二次プラークの形成を防ぐために)の2mL/wellを加える。37°Cでプレートを3〜4日間インキュベートします。
注:クリアプラークは通常3日で形成されます。 - プレートの固定と染色
- 上清を取り除き、純粋なメタノール(1 mL/well)で5分間細胞を固定します。メタノールを取り出し、プレートを空気乾燥させます。
- ギムサ染色(1:5)を脱イオン水で希釈し、希釈したギームサ染色を1mL加えます。プレートを室温で10〜15分間インキュベートします。
- 汚れを取り除き、水道水ですすいで、プレートを空気乾燥させます。
- 解剖顕微鏡を使用してプラークを数えます。
- lacZ式を使用する oHSV の場合はオプションです。
- 上清を取り除き、室温で5〜10分間、冷たい0.2%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
- 固定液を取り出し、細胞3倍をPBSで洗浄する。
- 細胞にX-gal溶液(1 mL/well)を加え、プレートを37°Cで2時間インキュベートします。
注:X-gal染色は、染色の日に新鮮に調製する必要があります。長期保存は色の退色につながる可能性があります。 表 1の X-gal 溶液の準備を参照してください。 - X-gal染色を取り出し、水道水で1分間洗浄します。
- ニュートラルレッド溶液(1 mL/well)を常温で2分間カウンター染色。
注: 表 1のニュートラルレッドソリューションの準備を参照してください。 - 水道水でプレートを1分間洗います。プレートを空気乾燥させます。
- 解剖顕微鏡を用いて青いプラークを数える(図4)。
- 式を使用して、titer を計算します (2)
pfu/mL (プラーク形成単位) の力価 = プラーク数/0.7 mL ×希釈係数 (2)
注: たとえば、10-9 希釈ウェルに 25 個のプラークが見つかった場合、力価は 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 ×10 pfu/mL です。これはステップ2.6.4で準備されたアリコートの最終的なoHSVの上昇です。
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Representative Results
図 1 は、oHSV の成長、精製、および滴定に関連する重要なステップを表す図 1に、プロトコル全体の簡単な概要を示しています。ベロ細胞のCPEは、HSV感染後の4時間の早い時期に検出することができる。図2は、oHSV感染後の3つの異なる時点におけるベロ細胞におけるCPEを示す。CPE のレベルは時間の経過とともに増加します。このプロトコルでは、90-100%CPEは、通常、低MOI oHSV接種の48時間以内に観察される(これは精製のために細胞を収穫するのに最適な時期である)。ただし、ステップ 1.2 で接種された oHSV MOI や oHSV の複製の可能性によっては、最大 4 日かかる場合があります。この期間を超えて、CPEを有する細胞は、上清中のウイルスの放出につながる、除去することができる。したがって、高いウイルス性のチターを得るためには、それらが無傷である場合にCPE影響を受けた細胞を収穫することが重要である。最終的なウイルス価に寄与するもう一つの重要な因子は、oHSV増幅に使用される組織培養フラスコの数または大きさである。図3は、プラークアッセイによる価価決定に必要な所定のウイルスストック(ステップ2.6.4で得られる)の連続希釈(10-3〜10-9)のプロセスを示している。 lacZ発現を有するoHSVの場合、ウイルスプラークはX-gal染色によって可視化することができる(図4)。このプロトコルでは、20 T-150 cm2組織培養フラスコを使用し、10 10 pfu/mLの1×10の力乗を有するoHSVストックの1.3〜1.6mLが期待できる。
図1:oHSVの成長、精製、およびプラークアッセイに関わる主要なステップの概略的な提示 略語: oHSV = 単純ヘルペスウイルス;CPE = 細胞性効果;VB = ウイルスバッファー;HBSS = ハンクのバランス塩ソリューション;PBS = リン酸緩衝生理食塩分。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:oHSV感染後のベロ細胞における細胞性効果 ベロ細胞は、0.01のMOIでmCherry(赤色蛍光で示される)のoHSVコードを接種し、36、48、および72時間のウイルス感染で画像化(10倍拡大)した。CPEは、oHSV感染細胞の丸めによって同定される(黒矢印で示される)。スケールバー= 200 μm。略語: oHSV = 単純ヘルペスウイルス この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:プラークアッセイ用のoHSVストックの連続希釈プロトコルのステップ 3.3 も参照してください。略語: oHSV = 単純ヘルペスウイルスこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:OHSV感染後72時間のX-gal染色斑の代表的な画像。希釈されていない(上ウェル)と希釈(1:10;下ウェル)oHSV感染細胞培養上清はベロ細胞に加え(70〜80%コンフルエント)、続いてセクション3.8.5に記載のX-gal染色プロトコル(ニュートラルレッドによる反染色を除く)。X-gal染色されたウイルスプラーク(左パネルから)の代表的な画像は、中央(4x;スケールバー=1000 μm)と右(10x;スケールバー=200μm)パネルに表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ソリューション構成 | |
| ウイルスバッファーの調製 | 量 |
| 1 M 塩化ナトリウム | 15 mL |
| 1 M トリス塩酸塩 | 3 mL |
| 純水 | 132 mL |
| pH を 6.8 に調整する | |
| X-gal溶液の調製(6ウェルプレート1個分の6.5mL) | |
| 250 mM フェリシアン化カリウム | 130 μL |
| フェロシアン化カリウム 250m | 130 μL |
| 1 M 塩化マグネシウム | 13 μL |
| ジメチルスルホキシド(DMSO)でX-gal予備溶解(20mg/mL) | 162.5 μL |
| PBS | 6064.5 μL |
| 1つの6ウェルプレートのためのニュートラルレッド溶液の調製 | |
| ニュートラルレッド溶液 | 100 μL |
| メタノール | 1 mL |
| 純水 | 7 mL |
表1:溶液組成。
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Discussion
プロトコルは、低通路ベロ細胞におけるoHSVの増殖から始まる。Vero細胞単層の合流率は、増殖細胞がVero細胞20へのoHSVの侵入を減少させることができるタイトな線維構造を開発することができるので、ウイルス接種時に〜80%であるべきである。90〜100%CPEが観察されると、培養上清が除去され、細胞が収穫され、VB/上清(ステップ1.4.6を参照)に再懸濁され、スナップ凍結、後で精製するために-80°Cで保存される。Blahoたちは、感染したベロ細胞の収穫と保存のわずかに異なる方法を採用した。例えば、細胞および培養培地を含むフラスコ(1%ウシ血清アルブミンおよびカリウムを添加したPBS)は、最初は−80°Cで少なくとも15分間保存され、続いてフラスコを室温でゆっくりと温める。次いで、細胞を回収し、滅菌乳と混合し、精製20まで-80°Cで保存する。この場合、滅菌乳は安定剤として働き、かつ、ウイルスストックの力力が培地単独で20に保存される場合よりも滅菌乳/培地に貯蔵されると劇的に高いことが実証された。しかし、別の研究では、−80°Cでのヘルペスウイルスの貯蔵に用いられる異なる安定剤(滅菌乳を含む)間の直接比較は、最終ウイルス力剤21に有意な影響を示さなかった。ここで、細胞ペレットをVBで再懸濁し、トリスバッファー生理液(pH6.8)および10%グリセロールを貯蔵安定剤として構成し、これは通常、実験研究のために高いウイルスの潮質(ステップ3.10で概説されている)を与える。
再中断されたペレットから細胞およびメディア関連のコンポーネントをすべて取り除き、高品質のウイルスストックを得ることが重要です。非ウイルス粒子の除去は、インビボ実験中の潜在的な免疫反応を避けるために重要です。ウイルス精製のいくつかの方法は、遠心分離22、異なる勾配法23、ろ過24、およびアフィニティークロマトグラフィー25を含む記載されている。このプロトコルは、スクロース勾配法を用いた高速遠心法に基づいているが、他の様々な勾配法、例えば、イオデキサノール11、26、パーコール27、およびFicoll-Nycodenz23が使用されている。これらの勾配法は、密度によってウイルスを分離し、ウイルスがペレット化されるスクロースクッションの代わりに、勾配からバンドの分離を必要とする。スクロース勾配法は、ウイルス感染性を保持しながらウイルスエンベロープタンパク質を破壊するリスクを最小限に抑えるため、ウイルス粒子を分離するための穏やかなアプローチを提供します。これらの利点にもかかわらず、濃縮スクロース溶液の高い浸透性は、ウイルス粒子を脱水する可能性があります。したがって、この欠点を克服するために、イオデキサノール勾配法が開発されました。しかし、イオデキサノール勾配法は、超遠心分離機およびビリオンバンドの収集を必要とする。oHSV精製中に考慮する必要がある他の要因は、遠心分離の速度と時間と長期保存に使用されるウイルスバッファーの選択です。このプロトコルには、oHSVの純度が確認されないという制限があります。しかし、Vero細胞上での滴定によって所定の精製oHSVストックに多数の機能性ウイルス粒子が見つかりました(セクション3参照)。
oHSVはベロ細胞にプラークを形成する(図4)。ウイルスプラークは、簡単で便利な方法であるGiemsa染色によって同定することができる。Giemsaはベロ細胞を染色し、ウイルスプラークを透明または空のままにして、簡単に視覚化(肉眼)でき、解剖顕微鏡を使用して数えます。アガロースまたはメチルセルロースとのメディアを重ね合わせながら、ウイルスおよび二次感染およびプラーク尾部28の拡散を防ぐために(ステップ3.7)でプラーク形成中に一般的に使用されるが、培養上清におけるoHSVを中和するヒトIgGの使用はより容易で便利である。lacZを発現するoHSVの場合、プラークはX-gal染色(図4)で可視化され、蛍光顕微鏡は蛍光タンパク質(すなわち緑色蛍光タンパク質)を発現するoHSV18に使用される。oHSV感染細胞を検出するための追加アッセイには、oHSV特異的抗体29を用いた免疫組織化学的または−蛍光または近赤外フルオロフォア結合oHSV特異的抗体30のレーザーベースのスキャンが含まれる。
微生物(細菌、酵母、カビ)の汚染や健康なベロ細胞を防ぐために、殺菌を維持するなど、良好なウイルスストックを達成するために従わなければならない重要な対策があります。oHSVのエンベロープは非常に熱感受性20であるため、oHSVストックは10%グリセロールなどの凍結保護剤で取り扱う必要があります。全体的に見て、このプロトコルは実験室で簡単に使用し、実践することができますが、大規模なウイルス産生には役立ちません。
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Disclosures
SDRは、ジョージタウン大学とマサチューセッツ総合病院が所有・管理する腫瘍性ヘルペス単純ヘルペスウイルスに関する特許の共同発明者であり、アムジェンとActiVec社からロイヤリティを受け、EG 427の科学諮問委員会に参加しています。他の著者は開示するものは何もない。
Acknowledgments
サハラボの研究は、DOD(W81XWH-20-1-0702)とダッジ・ジョーンズ財団-アビリーンからの資金によって部分的に支援されました。サミュエル・D・ラブキンとメリッサ・R.MハンフリーはNIH(R01 CA160762)によって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
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