Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Et optimalisert O9-1/Hydrogel-system for å studere mekaniske signaler i nevrale kamceller

Published: August 13, 2021 doi: 10.3791/62693
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatrics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3SEM AFM Core in the Houston Methodist Hospital Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Detaljerte trinnvise protokoller er beskrevet her for å studere mekaniske signaler in vitro ved hjelp av multipotente O9-1 nevrale kamceller og polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet.

Abstract

Neural crest celler (NCCs) er virveldyr embryonale multipotente celler som kan migrere og skille seg inn i et bredt utvalg av celletyper som gir opphav til ulike organer og vev. Vevsstivhet produserer mekanisk kraft, et fysisk signal som spiller en kritisk rolle i NCC-differensiering; Mekanismen er imidlertid fortsatt uklar. Metoden beskrevet her gir detaljert informasjon for optimalisert generering av polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet, nøyaktig måling av slik stivhet og evaluering av virkningen av mekaniske signaler i O9-1 celler, en NCC-linje som etterligner in vivo NCCs.

Hydrogelstivhet ble målt ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM) og indikerte forskjellige stivhetsnivåer tilsvarende. O9-1 NCC dyrket på hydrogeler av varierende stivhet viste forskjellig cellemorfologi og genuttrykk av stressfibre, noe som indikerte varierende biologiske effekter forårsaket av mekaniske signalendringer. Videre slo dette fast at varierende hydrogelstivhet resulterte i et effektivt in vitro-system for å manipulere mekanisk signalering ved å endre gelstivhet og analysere den molekylære og genetiske reguleringen i NCCs. O9-1 NCCs kan skille seg ut i et bredt spekter av celletyper under påvirkning av de tilsvarende differensieringsmediene, og det er praktisk å manipulere kjemiske signaler in vitro. Derfor er dette in vitro-systemet et kraftig verktøy for å studere rollen som mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med kjemiske signaler, noe som vil hjelpe forskere til å bedre forstå de molekylære og genetiske mekanismene for nevral kamutvikling og sykdommer.

Introduction

Neural crest celler (NCCs) er en gruppe stamceller under virveldyr embryogenese med en bemerkelsesverdig evne til å migrere og bidra til utvikling av ulike organer og vev. NCCer kan skille seg ut i forskjellige celletyper, inkludert sensoriske nevroner, brusk, bein, melanocytter og glatte muskelceller, avhengig av plasseringen av aksial opprinnelse og den lokale miljøveiledningen til NCC1,2. Med evnen til å skille seg ut i et bredt spekter av celletyper, kan genetiske abnormiteter som forårsaker dysregulering på et hvilket som helst stadium av nevral kam (NC) utvikling føre til mange medfødte sykdommer2. For eksempel fører perturbasjoner under dannelsen, migrasjonen og utviklingen av NCCer til utviklingsforstyrrelser kjent samlet som nevrokritiske1,3. Disse sykdommene spenner fra kraniofaciale defekter på grunn av svikt i NCC-dannelse, som Treacher Collins syndrom, til utvikling av ulike kreftformer på grunn av NCC metastatisk migrasjonsevne, sett i melanom3,4,5,6. I løpet av de siste tiårene har forskere gjort bemerkelsesverdige funn om NCCs roller og mekanismer i utvikling og sykdommer, der de fleste funnene er fokusert på kjemiske signaler7,8. Mer nylig har mekaniske signaler blitt indikert for å spille en kritisk, men dårlig forstått rolle i NCC utvikling9,10.

Miljøsignalene til NCCer spiller en kritisk rolle under utviklingen, inkludert regulering av NCC-differensiering i ulike celletyper. Miljøsignaler, for eksempel fysiske signaler, påvirker pivotal atferd og cellulære responser, for eksempel funksjonell diversifisering. Mechanotransduction gjør det mulig for celler å føle og reagere på disse signalene for å opprettholde ulike biologiske prosesser2. NCCer er omgitt av nærliggende celler og forskjellige substrater, for eksempel den ekstracellulære matrisen (ECM), som kan gi opphav til mekaniske stimuli for å opprettholde homeostase og tilpasse seg endringene gjennom skjebnebestemmelse, spredning og apoptose11. Mekanotransduksjon begynner ved plasmamembranen der den sensoriske komponenten av mekaniske ekstracellulære stimuli oppstår, noe som resulterer i intracellulær regulering av celle12. Integrins, fokale vedheft og veikryss i plasmamembranreléet mekaniske signaler, for eksempel skjærekrefter, stress og stivheten til omkringliggende substrater, til kjemiske signaler for å produsere cellulære responser12. Videresending av kjemiske signaler fra plasmamembranen til den endelige cellulære reguleringen utføres via forskjellige signalveier for å fullføre vitale prosesser for organismen, for eksempel differensiering.

Flere studier har antydet at mekanisk signalering fra substratstivhet spiller en rolle i celledifferensiering13,14. For eksempel har tidligere studier vist at mesenchymale stamceller (MSC) vokst på myke substrater med en stivhet som ligner på hjernevev (i området 0,1-1,0 kPa) resulterte i nevronal celledifferensiering15,16. Imidlertid skiller flere MSCer seg inn i myokyttlignende celler når de vokser på 8-17 kPa-substrater som etterligner muskelens stivhet, mens osteoblastlignende differensiering ble observert når MSCer ble dyrket på stive substrater (25-40 kPa)15,16. Betydningen av mekanotransduksjon fremheves av uregelmessigheter og abnormiteter i den mekaniske signalveien som potensielt fører til alvorlige utviklingsfeil og sykdommer, inkludert kreft, kardiovaskulære sykdommer og osteoporose17,18,19. I kreft er normalt brystvev mykt, og risikoen for brystkreft øker i stivt og tett brystvev, et miljø som er mer lik brystsvulster15. Med denne kunnskapen kan effekten av mekanisk signalering på NCC-utvikling studeres gjennom enkel manipulering av substratstivhet gjennom et in vitro-system, noe som gir ytterligere fordeler og muligheter til å forstå det grunnleggende om NC-relatert sykdomsprogresjon og etiologi.

For å studere effekten av mekaniske signaler i NCCer etablerte vi et effektivt in vitro-system for NCCer basert på optimalisering av tidligere publiserte metoder og evaluering av NCCs respons på ulike mekaniske signaler20,21. Det ble gitt en detaljert protokoll for varierende hydrogelstivhetsforberedelse og evaluering av virkningen av mekanisk signalering i NCCer. For å oppnå dette benyttes O9-1 NCC som NC-modell for å studere effekter og endringer som følge av stive kontra myke hydrogeler. O9-1 NCCs er en stabil NC celle linje isolert fra musen embryo (E) på dag 8.5. O9-1 NCCer etterligner NCCer in vivo fordi de kan skille seg ut i ulike NC-avledede celletyper i definert differensieringsmedie22. For å studere mekanisk signalering av NCCer ble et matrisesubstrat fremstilt med justerbar elastisitet fra varierende konsentrasjoner av akrylamid- og bisakrylamidløsninger for å oppnå ønsket stivhet, korrelert med den biologiske substratstivheten20,21,23. For å optimalisere betingelsene for matriseunderlag for NCCer, spesielt O9-1-celler, ble det gjort endringer fra den tidligere publiserte protokollen20. En endring i denne protokollen var å inkubere hydrogeler i kollagen I, fortynnet i 0,2% eddiksyre i stedet for 50 mM HEPES, ved 37 °C over natten. Den lave pH av eddiksyre fører til en homogen fordeling og høyere kollagen I inkorporering, og dermed muliggjør en mer jevn vedlegg av ECM protein24. I tillegg ble en kombinasjon av hesteserum og fostal bovin serum (FBS) brukt i konsentrasjonene på henholdsvis 10% og 5% i fosfatbuffersalt (PBS), før de lagret hydrogelene i inkubatoren. Hesteserum ble brukt som et ekstra supplement til FBS på grunn av sin evne til å fremme celleproliferasjon og differensiering ved konsentrasjonen på 10%25.

Med denne metoden ble et biologisk miljø etterlignet av ECM-proteinbelegget (f.eks. kollagen I) for å skape et nøyaktig in vitro-miljø for NCCer å vokse og overleve20,21. Stivheten til de forberedte hydrogelene ble kvantitativt analysert via atomkraftmikroskopi (AFM), en kjent teknikk for å skildre den elastiske modulus26. For å studere effekten av ulike stivhetsnivåer på NCCer ble ville O9-1-celler dyrket og forberedt på hydrogeler for immunfluorescens (IF) farging mot filamentøs aktin (F-aktin) for å vise forskjellene i celleadhesjon og morfologier som svar på endringer i substratstivhet. Ved hjelp av dette in vitro-systemet vil forskerne kunne studere rollene til mekanisk signalering i NCCer og dets interaksjon med andre kjemiske signaler for å få en dypere forståelse av forholdet mellom NCCer og mekanisk signalering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hydrogel forberedelse

MERK: Alle trinn må utføres i en cellekulturhette som har blitt desinfisert med etanol og ultrafiolett (UV)-sterilisert før bruk for å opprettholde steriliteten. Verktøy, som pinsett og pipetter, må sprøytes med etanol. Bufferløsninger må også sterilfiltreres.

  1. Tilberedning av aminosilanebelagte glassdeksler
    1. Plasser ønsket antall glassdeksler på et stykke laboratorieserviett.
      MERK: Forbered ytterligere 3-4 deksler for å sikre tilstrekkelig reserveutstyr da de går i stykker enkelt. Ulike materialer av glassdeksler vil gi forskjellig kompatibilitet med cellesåing og vedlegg. Det er bedre å finne ut hvilken type som passer best til eksperimentet før du starter forsøkene (se Materialfortegnelse).
    2. Bruk en alkoholbrenner eller Bunsen-brenner til å sterilisere hver deksleslip ved å sende den frem og tilbake gjennom flammen (30 s for proteinanalyseeksperimenter). Plasser hvert glassdeksle på en laboratorieserviett for å kjøle deg ned.
    3. Når glassdekslene er avkjølt, kan du overføre dem til en Petri-tallerken foret med parafilm for å forhindre glidning.
      MERK: Hvis dekslene ikke er kjølige nok, vil restvarmen smelte parafilmen på glidene, noe som gjør dem ubrukelige.
    4. Dekk dekslene med henholdsvis ca. 200 μL og 800 μL 0,1 M NaOH for henholdsvis 12 mm og 25 mm deksler, og la dem sitte i 5 minutter. Deretter aspirerer du 0,1 M NaOH og lar dekslene lufttørke i ytterligere 5 minutter for å danne en jevn film.
    5. Når dekslene er tørket, pipette ca 80 μL og 150 μL av 3-aminopropyl trietoxysilane (APTS) for henholdsvis 12 mm og 25 mm deksler. Vær forsiktig så du unngår å søle løsningen på parafilmen. La løsningen sitte i 5 min.
    6. Aspirer så mye overflødig APTS som mulig og la gjenværende APTS tørke i 5 min. Skyll dekslene godt ved å senke dem ned i steril, deionisert (DI) H2O tre ganger i 5 minutter hver gang.
      MERK: Hvis glassdekslene ikke skylles godt, forårsaker resterende APTS uønskede reaksjoner med glutaraldehyd, noe som får et hvitt bunnfall til å danne seg og resulterer i ubrukelige deksler.
    7. Flytt dekslene til en ny Petri-tallerken med den reaktive siden vendt opp. Tilsett nok 0,5% glutaraldehyd til Petri-parabolen for å dekke dekslene helt og la dekslene sitte i 30 minutter.
    8. Aspirer 0,5% glutaraldehyd og skyll dekslene igjen i DI H2O en gang i 3 min. Sett dekslene reaktiv side opp på en laboratorieserviett eller en ren Petri-tallerken for å lufttørke helt før bruk.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her; deksler må plasseres i steril DI H2O til bruk.
  2. Fremstilling av silikoniserte deksler
    1. Legg samme antall coverlips som de aminosilanebelagte dekslene (trinn 1.1.1) i en Petri-tallerken foret med parafilm.
    2. Pipette 40 μL eller 150 μL for henholdsvis 12 mm og 25 mm deksler av dichloromethylsilane (DCMS) til den ene siden av dekslene og la løsningen sitte i 5 minutter.
    3. Aspirer eventuelle gjenværende oppløsninger fra dekslene, vask i steril DI H2O en gang i 1 min, og plasser de reaktive dekslene med forsiden opp på en laboratorieserviett for å lufttørke helt før du går videre til neste trinn.
  3. Forbereder hydrogeler
    1. Bland akrylamid, bis-akrylamid og DI H2O i et 1,5 ml sentrifugerør for å tilberede 500 μL oppløsninger med varierende stivhet (se tabell 1). Virvel løsningen for 30 s for å blande den grundig.
    2. Arbeid raskt, legg til 10% ammoniumpersulfatoppløsning (APS) og tetrametyletylendiamin (TEMED) til røret og virvel løsningene igjen for å blande løsningene.
      MERK: Forbered fersk 10% APS og la den stå på is eller frys i engangs aliquots på grunn av sin følsomme fryse / tine syklus.
    3. Pipette ca. 33 μL eller 100 μL av oppløsningen på henholdsvis de tørkede 12 mm eller 25 mm aminosilanebelagte dekslene (avsnitt 1.1).
    4. Bruk buede pinsett, plasser straks DCMS-behandlet deksler på toppen av geloppløsningen med den behandlede siden som berører geloppløsningen, og smør dermed geloppløsningen mellom DCMS-behandlet dekslelip og aminosilanebelagte deksler.
    5. La gelløsningen polymerisere i 5-15 min, mens du aktivt overvåker for gelpolymerisering av restløsningen i røret.
    6. Når gelen er polymerisert, separer dcms-behandlet dekslerlip med buede pinsett eller et barberblad, slik at gelen er festet til den originale aminosilanebelagte dekslen.
    7. Plasser straks dekslene med den vedlagte hydrogelen i en forhåndsbestemt 4-brønns/24-brønns og 6-brønnsplate dekket med henholdsvis 500 μL og 2 ml steril PBS eller DI H2O for henholdsvis 12 mm og 25 mm deksler for å forhindre at gelen tørker ut.
    8. Gjenta trinn 1.3.4-1.3.7 for alle deksler.
    9. Senk hydrogelene ned i steril PBS eller DI H2O i 30 min for å fjerne overflødig akrylamidoppløsning. Oppbevar hydrogelene i steril PBS eller DI H2O ved 4 °C for en prosedyrestopp her.
    10. I et mørkt rom, forbered sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) heksanoat (sulfo-SANPAH) blanding ved å blande 2,5 ml 50 mM 2-[4-(2-hydroksyetyl) piperazin-1-yl] etanesulfonsyre (HEPES) (pH =8,5) med 25 μL av 50 μg/ml sulfo-SANPAH i et konisk rør, innpakket i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. Bruk en pipette til å blande oppløsningen godt før bruk.
      MERK: Et volum på 2,5 ml sulfo-SANPAH-oppløsning er nok for omtrent tjuefem 12 mm hydrogeler eller fem 25 mm hydrogeler.
    11. Aspirer PBS eller DI H2O fra brønnplaten. Tilsett ca. 100 μL eller 500 μL for henholdsvis 12 mm og 25 mm deksler av sulfo-SANPAH-oppløsning (trinn 1.3.10) for å dekke gelen. Sørg for at oppløsningen dekker gelen helt.
      MERK: Juster sugestyrken for å hindre at den sterke kraften eller forstyrrer hydrogelene.
    12. Plasser gelene med oppløsningen under et UV-lys på 15 W, 365 nm i 10 minutter, avdekket for å minimere eventuelle forstyrrelser i UV-lyset som reagerer med sulfo-SANPAH.
    13. Aspirer overflødig sulfo-SANPAH ved å vippe platen for å samle så mye av løsningen som mulig. Vask gelen med 50 mM HEPES to til tre ganger.
    14. Tilsett henholdsvis 500 μL og 2 ml for 12 mm og 25 mm geler på 50 mg/ml kollagen I fortynnet i 0,2% eddiksyre til hver brønn som inneholder hydrogelen. La gelene inkubere over natten i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
      MERK: Fortynn kollagen I i 0,2% eddiksyre i stedet for 50 mM HEPES for å fremme homogen distribusjon og festing av kollagen I.
    15. Aspirer kollagen I og vask gelene med steril PBS tre ganger for å fjerne overflødig kollagen I i 5 minutter hver vask. Inkuber hydrogelene i PBS med 10% hesteserum, 5% FBS i 2 timer i 37 °C, 5 % CO 2-inkubator.
      MERK: Tilsetningen av 10% hesteserum fremmer høyere spredning sammenlignet med bare å bruke FBS som gjort i forrige publikasjon.
    16. Aspirer mediet. Tilsett 500 ml sterilt filtrert Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (P / S) til hver brønn. Oppbevar gelene i 37 °C, 5 % CO2 inkubator til de er klare for cellekultur.
    17. Når du er klar, tallerken ca 1,5 × 104 O9-1 celler / cm2 i basal medium i kulturrettene. Inkuber cellene i 2 dager i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2. Kontroller cellene for samløp for å sikre at cellene er tilstrekkelig festet til geler, og at antall celler er nok før innsamling for analyse.
      MERK: Se den tidligere publiserte protokollen for trinnene for gjenoppretting, passasje og innsamling av O9-1-celler20.
    18. Fortsett til § 2, 3 eller 4 for videre analyse av hydrogelene.

2. Kvantitativ analyse av stivhet via AFM

  1. Start AFM-systemdatamaskinen etterfulgt av AFM-kontrolleren (se Materialtabellen).
  2. Monter AFM cantilever på AFM-probeholderen. Bruk en sfærisk cantilever med en 0,5 μm silikaperle montert på enden av cantilever (cantilever med sfærisk perle).
    MERK: For stivere hydrogeler, som 10 kPa, 20 kPa og 40 kPa, ble det brukt en stivere sonde med fjærkonstanten på 0,24 N/m. En mykere sonde ble brukt til mykere hydrogeler, som 0,5 kPa og 1 kPa, med en fjærkonstant på 0,059 N/m.
  3. Sett AFM-programvaren i kontaktmodus.
  4. Monter silisiumskiven på AFM-prøvetrinnet for å samle kraftkurver ved å klikke på Engasjer for cantileveren for å berøre silisiumsubstratet, og dermed generere kraftkurvene.
  5. Bruk kraftkurvene ovenfor (2.4) for kalibrering, klikk på Kalibrer i den kontrollerende programvaren for å få en gjennomsnittlig fjærkonstant av cantilever under termisk innstilt tilstand, og lagre de kalibrerte verdiene i den kontrollerende programvaren.
  6. Monter prøvene ved å plassere dekslene med den vedlagte hydrogelen i en 60 mm Petri-tallerken på AFM-skannetrinnet. Tilsett 3 ml PBS i parabolen før du utfører målinger for å forhindre at gelen tørker ut.
  7. Sett AFM til å fungere i kontaktmodus (væske) for å starte målingen. Engasjer den sfæriske perlen for å kontinuerlig berøre og løfte fra gelprøven.
  8. Sett cantilever slik at avbøyningsterskelen forblir på 10 nm. Hold rampestørrelsen på sonden på 10 μm. Deretter registrerer du kraftkurvene som i trinn 2.4.
  9. Skaff minst 20 kraftkurver fra minst 3 til 10 forskjellige flekker over overflaten av hydrogelen.
  10. Beregn den gjennomsnittlige Youngs modulus på ~20 kraftkurver for hvert sted med AFM-bilde- og analyseprogramvare. Bruk forlenget rampekraftkurver og en linearisert modell (sfærisk). Beregn gjennomsnittet av alle flekkene for hver prøve for å gi den endelige stivheten.
    MERK: Unges modulus og relaterte data (dvs. standardavvik) lagres automatisk som et regneark.
  11. Gjenta trinn 2.6-2.10 for alle prøver.

3. Molekylær analyse av stivhet via immunfluorescensfarging

  1. Bruk pinsett til å transportere dekslene til en ny plate for å minimere falske signaler fra celler som vokser direkte på platen. Vask cellene med 500 μL steril PBS tre ganger for å fjerne døde celler og eventuelt gjenværende kulturmedium.
  2. Fest cellene ved hjelp av 500 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 min ved romtemperatur, uforstyrret. Deretter vasker du cellene tre ganger ved hjelp av 500 μL PBS / brønn i 2 minutter hver.
    MERK: Oppbevar den ved 4 °C for en prosedyrestopp.
  3. Behandle cellene med 500 μL 0,1% Triton X-100 i 15 min ved romtemperatur. Vask deretter cellene tre ganger med 500 μL PBS / brønn.
  4. Blokker cellene med 250 μL 10% eselserum (fortynnet i PBS og 0,1% Tween 20) per brønn i 30 minutter ved romtemperatur.
  5. Inkuber cellene med 250 μL primære antistoffer i 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C. Vask deretter cellene tre ganger med 500 μL PBS / brønn i 5 min hver.
    MERK: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) og anti-AP2 alfa (1:250) ble brukt i dette eksperimentet og ble fortynnet i 10% eselserum.
  6. Inkuber cellene med tilsvarende sekundære antistoffer og/eller falloidin som brukes til F-aktinfarging ved en fortynning på 1:400 i 250 μL 10% eselserum i 30 minutter ved romtemperatur. Vask deretter cellene tre ganger med PBS i 5 min hver.
    MERK: 568 nm Phalloidin kan inkuberes sammen med 488 nm eller 647 nm sekundære antistoffer eller alene.
  7. Inkuber cellene med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 1:1000 fortynning) i 250 μL PBS i 10 min etterfulgt av en siste vask av PBS i 2 min.
  8. Tilsett 3-4 dråper monteringsmedium til hver brønn. Oppbevar prøvene ved 4 °C for å stille dem inn i minst 2 timer før bildebehandling for å sikre at monteringsmediet er riktig innstilt.
  9. Ta bilder av minst 3 tilfeldige rammer per hydrogelprøve med et fluorescensmikroskop, som produserer individuelle og sammenslåtte kanaler.

4. Kvantitativ PCR i sanntid (RT-qPCR)

  1. Overfør hydrogelene med tilhengercellene for RNA-oppsamling til en ny plate for å minimere uønsket RNA fra celler festet til celleplaten. Vask cellene med PBS tre ganger for å fjerne døde celler og kulturmedium.
  2. Trekk ut den totale mRNA ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett. Utfør omvendt transkripsjon av RNA til cDNA ved hjelp av en omvendt transkripsjon supermix i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Utfør RT-qPCR med primere for Vcl som den valgte stivhetsmarkøren og analyser ved hjelp av 2-ΔΔCT-metoden.
    MERK: Primersekvens av Vcl: Fremover 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; reversere 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hydrogel forberedelse og stivhetsvurdering gjennom AFM og Hertz-modellen
Her er det gitt en detaljert protokoll for å generere polyakrylamidhydrgeler av varierende stivhet ved å regulere forholdet mellom akrylamid og bis-akrylamid. Polyakrylamidhydrogelene er imidlertid ikke klare for vedheft av celler på grunn av mangel på ECM-proteiner. Dermed binder sulfo-SANPAH, som fungerer som en linker, kovalente til hydrogelene og reagerer med de primære aminer av ECM-proteiner for å tillate vedheft av ECM-proteiner til overflatene av hydrogelene via N-hydroksysuccinimide ester i sulfo-SANPAH etter UV-aktivering. Kollagen type I ble brukt som ECM-protein for å effektivt fremme O9-1 cellevedlegg. For å sikre nøyaktige stivhetsverdier for forskjellige hydrogeler ble det utført en stivhetsvurdering ved hjelp av AFM, en kjent teknikk for å skildre den elastiske modulen.

Ved vellykket dannelse og festing av polyakrylamidhydrgelen til glassdekslene, forble gelen festet til dekslenelip med en jevn overflate og minimal tåre. Stivheten ble målt ved AFM basert på prinsippet om innrykksteknikk, hvor det ble brukt et stivt innrykk på prøven med den nødvendige kraften for å nå en innrykksdybde26. Med denne målingen ble Youngs elastiske modul beregnet basert på innrykk av dybde og kraft i Hertz modell, en elastisk teori26. På grunn av den store variasjonen i resultatene fra AFM ble det imidlertid brukt en ekstra statistisk metode for å oppnå et kvantitativt resultat med minimal innvirkning av ujevne overflater og ufullkommen homogenitet av gelløsningene26. For å produsere et kvantitativt mål ved hjelp av AFM ble det tatt en samling av minst 50 kraft- og avstandskurver fra hvert sted på gelprøven for en gjennomsnittlig prøvestivhet. Kraften på høystivhetsgelen var høyere enn den som ble påført den mykere gelen, noe som indikerer at et stivere substrat ga en brattere skråning i Force vs. Z-grafen, der kraft måles i nN, og Z indikerer innrykksdybden mellom innrykkeren og prøven.

På myke hydrogeler var hellingen av den genererte kraftkurven skånsom da den nødvendige kraften fra AFM-sonden var mindre (figur 1A). Men på stive hydrogeler, som de med modulus på 40 kPa, var den genererte skråningen mye brattere da den påførte kraften var høyere enn for mykere geler (Figur 1B). Etter hvert som separasjonen mellom sonden og hydrogelprøven reduseres, øker kurven betydelig etter hvert som spissen av sonden berører glassdekslene. Men etter hvert som separasjonsavstanden øker, nærmer kurven seg bare 0, da det ikke er noen anvendt kraft til stede.

Som vist i figur 1A, kom cantileveren på AFM-sonden inn i gelen, indikert av den blå linjen, og sonden målte den påførte kraften som kreves for å trenge inn i gelprøven og til slutt nå glassdekslene, noe som førte til en plutselig økning i kraft. På grunn av mulige prosedyremessige og instrumentelle feil, for eksempel kvaliteten på de nødvendige løsningene, varierer den sanne stivheten til hydrogelprøver i stor grad og langt fra ønsket stivhet. Dermed er AFM et nyttig verktøy for å validere og bekrefte metodikken samtidig som falske datapresentasjon forhindres i videre eksperimenter.

I denne AFM-vurderingen ble de fem forberedte hydrogelprøvene målt gjennom den kvantitative tilnærmingen. Protokollen fokuserte på hydrogelstivhetsnivåer på 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa og 40 kPa, som etterligner bredden av biologiske substratstivhetsnivåer rapportert for differensiering av ulike celletyper. Kraftkurvene hentet fra AFM-målinger ble brukt til å generere Youngs elastiske modulus i kilopascals ved hjelp av en AFM-analysealgoritmeprogramvare (figur 2).

Sammenligning av polyakrylamidhydrgelsystemer og celletyper
Denne tilpasningen av den opprinnelige protokollen av Tse og kolleger gir en effektiv og effektiv tilnærming for å studere de mekanosensitive aspektene ved NCC ved hjelp av O9-1 celler20. Modifikasjoner på den forrige protokollen inkluderer modifisering av ECM proteininkubasjon: erstatte 50 mM HEPES med 0,2% eddiksyre og tilsetning av 10% hesteserum og FBS for cellekultur (trinn 1.3.14-1.3.15). Disse modifikasjonene ble validert ved å sammenligne veksten og vedlikeholdet av O9-1 NCCer på dette modifiserte gelsystemet med det i den opprinnelige (kontroll) protokollen. Her dyrket vi wild-type O9-1 celler på begge hydrogelsystemene med den elastiske modulen på 1 kPa og 40 kPa for hvert system i basalmedium. Den samlede cellevekststatusen og utviklingen ble visualisert ved hjelp av et lysmikroskop med lysfelt for apoptotiske egenskaper, stresset morfologi og celletilknytning til hydrogelene. O9-1 celler dyrket på det opprinnelige gelsystemet resulterte i et høyere antall døde celler indikert av et overskudd av runde celler (Figur 3E, F) for både 1 kPa og 40 kPa hydrogeler.

O9-1-cellene som vokste på det modifiserte gelsystemet viste derimot sunn cellevekst og tilstrekkelig feste til hydrogelsubstratet (Figur 3G,H). I tillegg ble kompatibiliteten til NCCer med det modifiserte hydrogelsystemet vurdert ved å utføre IF-farging av NCC-markøren, Tcfap2α (AP-2). AP-2 er en transkripsjonsfaktor uttrykt i NC-avstamninger for å regulere utviklingen i museembryoer, og dermed gjøre den egnet til å vurdere kompatibilitet27. Selv om O9-1-celler dyrket på kontroll- og modifiserte hydrogelsystemer begge uttrykte AP-2, var det en betydelig økning i AP-2-uttrykket i O9-1-celler belagt på det modifiserte hydrogelsystemet, som indikert av det sterkere fluorescenssignalet og tilsvarende kvantifisering (Figur 4A,B).

I tillegg ble P19-celler brukt til å validere fordelene ved det modifiserte hydrogelsystemet ytterligere for vekst av celler. P19 er en embryonal karsinomcellelinje som ble avledet fra embryoavledet teratokarsinom i mus28. Ved hjelp av den tilsvarende kulturprotokollen ble P19-celler dyrket på både kontroll- og modifiserte hydrogelsystemer for å overvåke overlevelses- og vekstegenskaper. Brightfield-avbildning viste at P19-celler belagt på begge hydrogelsystemene viste et overskudd av runde flytende celler og mangel på celle-substratfester (Figur 3A-D). Denne observasjonen antydet at den modifiserte protokollen var mer egnet for O9-1 NCCer til å studere mekanisk signalering i NCCer.

Visualisering av fiberuttrykk med høy stress på stive substrater
Den modifiserte hydrogelen tillot kvantitativ og kvalitativ analyse av forskjellene i morfologien til celler dyrket på geler av forskjellige stivhetsnivåer og andre effektorer. Når hydrogelene var klare for cellesåing, ble ville O9-1-celler passeret på hydrogeler med forskjellige stivhetsnivåer. Celler ble overvåket for deres helse og vekst ved å observere deres form, romlige spredning og til og med vedlegg på hydrogelen med minimale døde celler. Noen studier har vist en økning i stressfibre og celleadhesjon for MSC på substrater med høy stivhet, noe som tyder på at NCCer som vokser på et stivere substrat, også vil vise lignende funn sammenlignet med NCCer dyrket på mykere substrater29,30.

F-aktin sammen med myosin II, α-aktinin og andre cytoskeletale proteiner er kjent kollektivt som stressfibre31. Tidligere studier observerte en økning i stressfibermontering som svar på økt mekanisk kraft31. I en eller begge ender av stressfibrene gjør vedlegg til brennviddekomplekset celler i stand til å migrere og følge ECM31. Phalloidinfarging for å visualisere F-aktinuttrykk og organisering på norsk sokkel viste sunn cellevekst som svar på mekanisk signalering (figur 5). I tillegg viste O9-1-cellene som vokste på lav- eller høystivhetshydrgeler forskjellige morfologier gjennom varierende mengder stressfibre (figur 5). I likhet med observasjoner fra rapporterte studier utført ved hjelp av MSC, ble det observert at O9-1 celler dyrket på et stivere substrat, 40 kPa, viste flere stressfibre og var godt spredt sammenlignet med celler dyrket på en mykere hydrogel, indikert med 1 kPa stivhet29,30.

Vurdering av celleadhesjoner
For ytterligere å bekrefte hypotesen om at endringen i substratstivhet påvirker NCC-vedheft, ble endringer i Vcl-uttrykk kvantitativt målt via RT-qPCR i NCCer som reagerte på forskjellige hydrogelstivhetsnivåer. Vcl er et av de mange cytoskeletale proteinene som finnes i fokaladhesjonskomplekset under prosessen med cellen som etablerer kontakter med substratet og registrerer ECM-egenskapene32. Fokale vedheft er kontaktpunktene til cellene til ECM via integrinske reseptorer, som forankrer til cytoplasmatisk aktin cytoskeleton, F-aktin33 Vcl genuttrykksnivå antyder endringene i fokale vedheft og celleadhesjoner av O9-1-cellene som svar på substratets stivhet.

Tidligere studier viste effekten av Vcl på celleadhesjon i embryonale stamme- og fibroblastceller ved forskjeller i uttrykket. Som svar på det høye uttrykket av Vcl, økte antall og størrelser av fokale vedheft også, men reduserte da Vcl ble slått ned34. Konsekvent viste Vcl-mangelfulle celler også en betydelig reduksjon i celleadhesjon og spredning35. I tillegg spiller Vcl en rolle i å regulere celleadhesjon ved å stabilisere fokale vedheft36. Størrelsen på fokaladhesjoner, modningsnivå og komposisjoner varierer i henhold til substratets stivhet, og tillater dermed signaler å bli transdusert intracellulært og cellene reagerer på deres miljøsignaler37. Dermed er Vcl svært rekruttert til fokale vedheftskomplekser i celler som vokser på stive substrater, som reflektert av høyere mRNA-nivåer oppdaget av RT-qPCR (Figur 6C).

Celler som vokser på mykere substrater danner minimale følladhesjonskomplekser, som reflekteres av lavere mRNA-nivåer av Vcl i cellene15. I figur 6Cviste O9-1-celler et høyere uttrykk for Vcl på det stive substratet enn på det myke substratet. Disse resultatene antyder et høyere nivå av celle-substratadhesjoner av O9-1 celler på stive substrater enn O9-1 celler på mykere substrater. I tillegg ble Vcl-uttrykket kvalitativt visualisert gjennom IF-farging med et anti-Vcl-antistoff for ytterligere å utfylle og støtte RT-qPCR-funnet. Konsekvent var Vcl-uttrykket i O9-1-celler dyrket på det stivere substratet høyere enn de som vokste på det mykere substratet (Figur 6A,B), som ytterligere støttet det første funnet av høycellet vedheft og spredning på 40 kPa hydrogel i forhold til 1 kPa hydrogel observert med F-aktin falloidinfarging og Vcl-uttrykksnivåer via RT-qPCR.

Figure 1
Figur 1: Fremtving kurver generert fra innrykket til AFM-sonden. Kraft (y-akse) angir den nødvendige kraften som brukes i nN, og Z (x-aksen) angir Bruker AFM-sondeavstanden fra prøven i μm. For 1 kPa hydrogel (A)er den genererte skråningen skånsom mot den brattere skråningen som observeres for 40 kPa hydrogel (B). De fargede kurvene representerer bevegelsen av cantilever på AFM-sonden når den nærmer seg (blå) og trekker seg tilbake (rød) fra hydrogelprøven. Det høyeste utgangspunktet for kurven indikerer den stive kontakten til glassdekslene. (B) Den store dukkerten i den tilbaketrukne kurven i hydrogelen på 40 kPa indikerer vedheft mellom perlen og prøven. Forkortelse: AFM = mikroskopi av atomkraft. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Gjennomsnittlig stivhet av hydrogeler (i kPa) beregnet fra Youngs elastiske modulus. Youngs modulus ble generert fra kraftkurvene fra figur 1. Hydrogelenes elastiske moduli var 0,5 kPa, 1 kPa, 10 kPa, 20 kPa og 40 kPa. Feilfelt angir standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Lysfeltbilder av P19- og O9-1-celler belagt på 1 kPa og 40 kPa hydrogeler av kontroll- og modifiserte gelsystemer for å oppdage cellevekstegenskaper. (A-D) P19 og (E-H) O9-1 celler; døde celler er indikert med røde piler. Skalastenger = 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Immunfluorescensfarging av NCC-merket AP-2 i O9-1 NCCer for å visualisere NCC-kompatibilitet. (A) A 40 kPa modifisert hydrogelsystem sammenlignet med (B) en 40 kPa-kontroll. AP-2 (grønn); kjerner ble farget med DAPI (blå). Skalastolper = 25 μm. (C) Stolpediagram gir kvantifisering av AP-2-uttrykksnivået som viser signifikans (p-verdi = 0,003) (n = 3). Data viser det relative uttrykket med angitte feilfelt for standardavvik. Forkortelser: NCC = nevral kamcelle; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Fluorescerende falloidinfarging av F-aktin som viser stressfibre som er godt spredt ut i O9-1 celler på 40 kPa hydrogel. O9-1 celler ble dyrket på 1 kPa (A) og 40 kPa hydrogeler (B). O9-1 celler ble farget ved hjelp av Alexa Fluor 488 Phalloidin (grønn), og kjernene ble farget med DAPI (blå). Skalastenger = 25 μm. Forkortelse: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Immunfluorescence bilder av vinculin i O9-1 celler. O9-1 celler ble belagt på 1 kPa (A) og 40 kPa (B) hydrogeler. Nuclei ble farget med DAPI (blå). Skalastenger = 25 μm. (C) Sanntids kvantitativ PCR-analyse av det totale mRNA-nivået av Vcl i O9-1 celler dyrket på 1 kPa og 40 kPa hydrogeler. Vcl uttrykksnivå på 1 kPa hydrogel er betydelig lavere enn på 40 kPa hydrogel (p-verdi = 0,02). Data viser gjennomsnittet med angitte feilfelt for standardavvik. Forkortelse: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

500 μL totalt volum 0,5 kPa 1 kPa 10 kPa 20 kPa 40 kPa
40% akrylamid (μL) 37.5 62.5 125 100 100
20% Bis-akrylamid (μL) 15 7.5 25 66 120
H2O (μL) 447.5 430 350 334 280
10% APS (μL) 5 5 5 5 5
TEMED (μL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Tabell 1: Tilsvarende mengder løsninger for å oppnå ønsket stivhetsnivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med den nåværende studien er å gi et effektivt in vitro-system for bedre å forstå effekten av mekaniske signaler i NCC. I tillegg til å følge den trinnvise protokollen nevnt ovenfor, må forskerne huske på at cellekulturen til O9-1 NCCs påvirkes av typen glassdeksler som brukes til å forberede hydrogeler. For eksempel ble det bemerket at celler frøet på en bestemt type glassdekslerlip (se materialtabellen) overlevde og spredte seg godt, mens dyrkede celler frøet på andre typer glassdeksler viste mer celledød. Videre er det viktig å følge de riktige cellekulturforholdene for O9-1 NCCs38. Kvaliteten på cellekulturen er optimal når hydrogelene brukes så snart som mulig eller lagres i en steril 37 ° C inkubator i opptil to dager.

På grunn av følsomheten til hver komponent i protokollen, kan den elastiske modulen variere på tvers av eksperimenter. I tillegg til punktene som er nevnt i protokollen (trinn 1.3.2) angående 10% APS, påvirker også andre kritiske faktorer å huske på variasjonen. En annen faktor som var mistenkt for å forårsake store variasjoner i AFM-målinger var tykkelsen på hydrogelene. En tidligere studie hadde undersøkt effekten av tykkelse på Youngs moduli, alt fra 15 til 1000 μm, og hadde funnet ut at forskjeller i tykkelse ikke endret Youngs moduli betydelig39. Tykkelsen på substratene påvirker imidlertid også de mekaniske egenskapene som cellene kan føle, noe som fører til forskjellige morfologier40,41,42. Ulike studier viste at en betydelig økning i tykkelsen på hydrogeler førte til en nedgang i celleområdet, spredning og effektiv stivhet av hydrogeler40,41,42. Imidlertid endres fenotypene av celler også som svar på betydelig tynne hydrogeler, for eksempel høyere spredning selv på lavstivhet hydrogeler40,41,42. Med et konsistent volum polyakrylamidgeler bør tykkelsen på hydrogeler være jevn slik at små avvik ikke vil påvirke den elastiske modulen i AFM-målinger betydelig.

Det er bedre å sterilisere deksler ved å sende dem frem og tilbake i flammen ved hjelp av en alkoholbrenner fordi andre steriliseringsmetoder kan være mer kompliserte og forårsake potensiell skade på glassdekslene. Ulike størrelser av glassdeksler kan brukes basert på eksperimentelle krav. Denne protokollen benyttet henholdsvis 12 mm og 25 mm deksler for henholdsvis immunhiistokjemi og RT-qPCR. Bruk av geler i riktig størrelse som passer til eksperimentene, oppmuntrer til effektivitet og minimerer avfall. Disse modifikasjonene ble validert kvalitativt og kvantitativt for å sikre optimalisering for O9-1 NCCer sammenlignet med det opprinnelige (kontroll) hydrogelsystemet20. Den generelle helsen og veksten av O9-1 NCCer ble vurdert under et brightfield mikroskop for cellulære og substrat vedlegg egenskaper.

I tillegg ble kompatibiliteten til O9-1-celler sammenlignet mellom både kontroll- og de modifiserte hydrogelsystemene for å validere modifikasjonene i denne protokollen ytterligere ved å kvalitativt visualisere AP-2-uttrykket ved hjelp av IF-farging. Signalenes intensitet ble kvantifisert for ytterligere å støtte de representative bildene av AP-2-uttrykket i O9-1-celler mellom kontroll kontra de modifiserte hydrogelsystemene. Mens AP-2 er en vanlig NCC-markør, må andre kjente markører vurderes for validering, for eksempel Sox10 og Pax3, på grunn av deres betydning for NCC-vedlikehold av pluripotens og overlevelse28. I tillegg ble optimaliseringen i denne protokollen ytterligere bekreftet ved å sammenligne O9-1 NC-cellene med en annen cellelinje, P19, for å sikre at dette hydrogelsystemet er effektivt og pålitelig for NC-celler. Selv om P19-celler har udødelige egenskaper og lett dyrkes, trives de ikke godt på noen av hydrogelsystemene.

Motstanden mot den forlengelseskraften som genereres fra substratet eller vevsstivheten der cellene festes, uttrykkes ofte som Youngs elastiske modulus45. Med AFM er Youngs elastiske modulus hentet fra kraftkurven generert fra den påførte vertikale kraften26. Store variasjoner kan forekomme under AFM-måling, mellom målinger som kan føre til unøyaktige avlesninger for de stivere hydrogelene. Inkonsekvensen kan skyldes feil sonder som brukes til måling. For eksempel krever måling av 20 kPa og 40 kPa hydrogeler bruk av en stivere sonde med høyere fjærkonstant (k = 0,24 N/m). En stivere sonde gir en lavere oppløsning sammenlignet med en mykere sonde; Det er imidlertid grunner til å favorisere valget av en stivere sonde, da for myke cantilevers kan følge prøvene46. I tillegg er for myke sonder svært følsomme, noe som bidrar til falske signaler fra uønskede partikler og resulterer i kunstig lavere eller høyere stivhetsverdier enn den sanne stivheten46. Videre må nøyaktig inngang av Poissons forhold noteres, avhengig av målematerialet; Dette kan finnes i standardiserte studier, da dette påvirker datautgangen betydelig.

I tillegg ble AFM brukt til å måle tykkelsen på hydrogelene, da tykkelse er en annen mekanisk egenskap som påvirker hvordan cellene føler miljøet47,42. I ulike rapporterte studier observeres celler som dyrkes på myke hydrogeler å være runde i form ved og utover "kritisk tykkelse", som rapporteres ved ~ 2-5 μm, avhengig av celletype47,42,48. Imidlertid ble mye høyere spredning observert når celler ble belagt på hydrogeler av samme stivhet, men lavere tykkelse enn den "kritisketykkelsen" 42,48. En potensiell forklaring på dette interessante funnet er at den subkritiske tykkelsen på hydrogeler gjør det mulig for cellene å føle de stive underliggende glassdekslene når cellene utøver trekkraft for lateralforskyvning 47. Gjennomsnittlig tykkelse på tvers av all-stivhet hydrogeler var 342 μm med et standardavvik på 27 μm. Tykkelsen på hydrogelene var høyere enn den foreslåtte "kritiske tykkelsen", og innenfor testområdet under 400 μm, som ble rapportert i studier og de produserte forhåndslagde hydrogelene, slik at cellene kunne føle hydrogelenes forskjellige stivhet og ikke de underliggende stive glassdekslene42,48.

I tillegg til AFMs kvantitative analysemetode ble hydrogelene også kvalitativt analysert gjennom immunhiistokjemi for å studere uttrykket av markørene som påvirkes av den varierende stivheten i O9-1-celler og for å visualisere sunn vekst av cellene. F-aktin i cytoplasma er koblet til membranbundne integriner via et sett med cytoskeletale proteiner, som talin og Vcl, som danner fokusadhesjonskomplekset33. Uttrykk for stressfibre i celler kan også analyseres ved å måle uttrykket av andre cytoskeletale gener i celler, som talin og integrin, som kan visualiseres sammen ved hjelp av fokal adhesjonsflekkesett.

Det var varierende grad av hydrogelstivhet som påvirket NCC-morfologi og respons, sett i endringen i celleadhesjon og stressfibre gjennom mekanisk signalering. Denne protokollen gir muligheten til å påvirke celledifferensiering i ulike celletyper ved å endre de tilsvarende kulturforholdene in vitro, og gir dermed en praktisk metode for manipulering av mekaniske signaler og kjemiske signaler i NCCer. Som nevnt tidligere, er skjebnen til NCC-differensiering i stor grad styrt av mekaniske krefter som er tilstede i det omkringliggende vevet, inkludert stivheten2,3. Mens det umiddelbare målet med dette dokumentet var å utvikle en trinnvis protokoll for å forberede hydrogeler for NCC-kultur, strekker de potensielle fordelene ved denne protokollen seg utover metodikken, og forfølger ytterligere kunnskap om mekanisk signalering i NCCer. Det er også verdt å merke seg at dette in vitro-systemet har noen begrensninger. Denne teknikken for fremstilling av hydrogeler består av flere trinn som potensielt kan introdusere tekniske variasjoner underveis, inkludert heterogenitet, ujevn overflate og unøyaktig stivhet. Derfor må brukerne utføre disse trinnene nøye for å minimere tekniske variasjoner under eksperimenter. I tillegg begrenset polyakrylamidgeler i dette systemet studier til 2D-kultur på grunn av akrylamidtoksisiteten, og ignorerte det nøyaktige 3D-biologiske miljøet som NCCer bor i50.

Til tross for disse begrensningene gir dette in vitro-systemet en billig og enkel metode som drar nytte av alle nivåer av forskning og gjør det mulig for forskere å utføre tilstrekkelige og funksjonelle nedstrømstester. Som det fremgår av nyere funn, er NCCer avhengige av både mekanisk signalering, for eksempel skjærkraft og substratstivhet, og kjemisk signalisering, som Wnt og fibroblast vekstfaktorsignalering, i kraniofacial, samt hjerteutvikling i vertebrater6,15. Ved hjelp av denne protokollen kan de lokale mikromiljøene for in vitro-eksperimenter lett etterlignes for fremtidige studier på NCCer, inkludert differensiering, migrasjon, cellulære responser og potensialet for skadelig sykdomsprogresjon. Derfor vil dette in vitro-systemet være et kraftig verktøy for å studere rollene til mekanisk signalering i NCCer og deres interaksjoner med andre signalveier, noe som vil utdype forståelsen av de molekylære og genetiske mekanismene for NCC-utvikling og relaterte sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Ana-Maria Zaske, operatør for Atomic Force Microscope-UT Core-anlegget ved University of Texas Health Sciences Center, for den medvirkende ekspertisen i AFM i dette prosjektet. Vi takker også finansieringskildene fra National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 og R01HL142704 til J. Wang).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-012
2% Bis-Acrylamide Sigma Aldrich M1533
24-well plate Greiner Bio-one 662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip Chemglass Life Sciences CLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) Sigma Aldrich A3648
4-well cell culture plate Thermo Scientific 179830
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich J61899-AP
40% Acrylamide Sigma Aldrich A4058
50% glutaraldehyde Sigma Aldrich G7651
6-well cell culture plate Greiner Bio-one 657160
AFM cantilever (spherical bead) Novascan
AFM software Catalyst NanoScope Model: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher A12379
Ammonium Persulfate (APS) Sigma Aldrich 248614 Powder
anti-AP-2α Antibody Santa Cruz sc-12726
anti-Vinculin antibody Abcam ab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst Bruker Corporation
Collagen type I (100mg) Corning 354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher D1306
Dichloromethylsilane (DCMS) Sigma Aldrich 440272
Donkey serum Sigma Aldrich D9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV
Fluorescence microscope Leica Model DMi8
Fluoromount-G mounting medium SouthernBiotech 0100-35
HEPES Sigma Aldrich H3375 Powder
Horse serum Corning 35-030-CI
iScript Reverse Transcription Supermix Bio-Rad 1708841
Penicillin-Streptomycin antibiotic Thermo Fisher 15140148
RNeasy micro kit Qiagen 74004
Sterile 1x PBS Hyclone SH30256.02
Sterile deionized water Hardy Diagnostics U284
sulfo-SANPAH Thermo Fisher 22589
SYBR green Applied Biosystems 4472908
TEMED Sigma Aldrich T9281
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335 (2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089 (2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108 (2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281 (2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257 (2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346 (2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918 (2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15 (2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 174 nevrale kamceller mekaniske signaler O9-1 celler atomkraftmikroskopi
Et optimalisert O9-1/Hydrogel-system for å studere mekaniske signaler i nevrale kamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S.,… More

Le, T. P., Zhao, X., Erhardt, S., Gu, J., Wang, H., Findley, T. O., Wang, J. An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells. J. Vis. Exp. (174), e62693, doi:10.3791/62693 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter