Summary
多能O9-1神経堤細胞と様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用して 、インビトロで 機械的信号を研究するための詳細なステップバイステッププロトコルについて説明します。
Abstract
神経堤細胞(NCC)は、さまざまな臓器や組織を生み出す幅広い細胞型に移行し、分化することができる脊椎動物胚多能細胞です。組織の剛性は、機械的な力、NCC分化に重要な役割を果たす物理的な手がかりを生成します。しかし、メカニズムは不明のままです。ここで説明する方法は、様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルの最適化された生成、そのような剛性の正確な測定、 および生体NCCを 模倣するNCCラインであるO9-1細胞における機械的信号の影響の評価に関する詳細な情報を提供する。
ヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡(AFM)を用いて測定し、それに応じて異なる剛性レベルを示した。様々な剛性のヒドロゲルに培養されたO9-1 NCCは、ストレス線維の異なる細胞形態および遺伝子発現を示し、機械的シグナル変化によって引き起こされる生物学的効果が異なっている。さらに、ヒドロゲル剛性を変化させることで、ゲル剛性を変化させ、NCCの分子および遺伝的調節を分析することによって機械的シグナル伝達を操作する効率的な インビトロ システムをもたらしたことが確立 された。したがって、この in vitro システムは、NCCにおける機械的シグナル伝達の役割と化学シグナルとの相互作用を研究するための強力なツールであり、研究者は神経堤の発達と疾患の分子および遺伝的メカニズムをよりよく理解するのに役立ちます。
Introduction
神経堤細胞(NCC)は、脊椎動物胚発生時の幹細胞群であり、様々な臓器や組織の発達に寄与する著しい能力を有する。NCCは、NCC1,2の軸方向起点の位置や局所的環境誘導に応じて、感覚ニューロン、軟骨、骨、メラノサイト、平滑筋細胞を含む異なる細胞タイプに分化することができる。広範囲の細胞型に分化する能力を持つ、神経堤(NC)の発達の任意の段階で調節不全を引き起こす遺伝的異常は、多数の先天性疾患に至る可能性がある2。例えば、NCCの形成、移動、および発達中の摂動は、神経経皮症1,3として総称して知られる発達障害につながる。これらの疾患は、NCC形成における障害による頭蓋顔面欠損(トレチャー・コリンズ症候群など)から、黒色腫3、4、5、6に見られるようにNCC転移性回遊能力に起因する様々な癌の発症まで多岐にわたる。過去数十年にわたり、研究者は開発および疾患におけるNCCの役割とメカニズムについて顕著な発見を行い、その大半は化学信号7,8に焦点を当てています。最近では、機械的信号は、NCC開発9、10において重要だが十分に理解されていない役割を果たしていることが示されている。
NCCの環境的な手掛かりは、NCC分化を様々な細胞タイプに規制するなど、開発中に重要な役割を果たします。環境の手掛かり、例えば、物理的な手がかりは、機能多様化などの極めて重要な行動および細胞応答に影響を与える。メカノトランスダクションは、細胞が様々な生物学的プロセスを維持するためにそれらの手がかりを感知し、応答することを可能にする2.NCCは、隣接する細胞および細胞外マトリックス(ECM)のような異なる基質に囲まれており、恒常性を維持し、運命決定、増殖、およびアポトーシス11を通じて変化に適応するために機械的刺激を生じさせることができる。メカノトランスダクションは、機械的細胞外刺激の感覚成分が生じる形質膜から始まり、細胞12の細胞内調節をもたらす。インテグリン、焦点接着、および、剪断力、応力、および周囲の基質の剛性などの機械的信号を、細胞応答12を生成する化学信号に、プラズマ膜リレーの接合部。細胞膜から最終的な細胞調節への化学信号の中継は、分化などの生物の重要なプロセスを確定するために異なるシグナル伝達経路を介して行われます。
いくつかの研究は、基質剛性からの機械的シグナル伝達が細胞分化13、14に役割を果たしていることを示唆している。例えば、これまでの研究では、脳組織と同様の硬直性を有する軟質基質上で成長した間葉系幹細胞(MCC)(0.1〜1.0kPa)が神経細胞分化15,16を生じることが示されている。しかし、筋肉の剛性を模倣した8-17 kPa基質上で増殖するとより多くのMSCが筋細胞様細胞に分化し、一方、MSCを硬質基質上で培養した際に骨芽細胞様分化が観察された(25-40kPa)15,16。メカノトランスダクションの意義は、癌、心血管疾患、骨粗鬆症17、18、19を含む重篤な発達上の欠陥および疾患につながる可能性のある機械的シグナル伝達経路の不規則性および異常によって強調される。癌では、正常な乳房組織は軟らかく、乳房癌のリスクは、硬く、密な乳房組織、乳房腫瘍15に似た環境において増加する。この知見により、生体信号がNCC開発に及ぼす影響を、in vitroシステムを通じて基質剛性を簡単に操作することで研究することができ、NC関連疾患の進行と病因の基礎を理解する上でさらなる利点と可能性を提供します。
NCCにおける機械的信号の影響を調べ、従来公表された方法の最適化と異なる機械的信号20,21に対するNCCの応答評価に基づくNCCの効率的なインビトロシステムを確立した。ヒドロゲルの剛性の調製とNCCにおける機械的シグナリングの影響の評価を行うための詳細なプロトコルが提供されました。これを達成するために、O9-1 NCCは、硬い対ソフトヒドロゲルに応答して効果と変化を研究するためにNCモデルとして利用されています。O9-1 NCCは、8.5日目にマウス胚(E)から分離された安定したNC細胞株です。O9-1 NCC は、定義された分化メディア22の各種 NC 由来細胞タイプに分化できるため、インビボで NCC を模倣しています。NCCの機械的シグナル伝達を研究するために、マトリックス基質を、所望の剛性を達成するために、所望の剛性を達成するために、アクリルアミドおよびビスアクリルアミド溶液の様々な濃度から調整可能な弾性で作製した、生物学的基質剛性20、21、23と相関する。NCC用マトリックス基板の条件を最適化するために、具体的にはO9-1細胞は、以前に公開されたプロトコル20から改変を行った。このプロトコルで行われた1つの変更は、コラーゲンIのヒドロゲルをインキュベートし、50mM HEPESの代わりに0.2%の酢酸に希釈し、一晩で37°Cで行った。酢酸の低pHは均質な分布と高いコラーゲンIの組み込みをもたらし、したがってECMタンパク質24のより均一な付着を可能にする。また、ウシ胎児血清(FBS)との組み合わせは、インキュベーターにヒドロゲルを貯蔵する前に、それぞれリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で10%および5%の濃度で使用した。10%25の濃度で細胞増殖および分化を促進する能力のために、FBSへの追加サプリメントとして馬血清を使用した。
この方法により、生物環境をECMタンパク質コーティング(例えば、コラーゲンI)によって模倣し、NCCが成長し、20,21を生き残るための正確なインビトロ環境を作り出した。調製されたヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡(AFM)を介して定量的に分析した、弾性率26を描写するよく知られた技術である。NCCに対する異なる剛性レベルの影響を研究するために、野生型O9-1細胞を培養し、フィラメントアクチン(F-アクチン)に対する免疫蛍光(IF)染色用のヒドロゲルに調製し、基質剛性の変化に応じて細胞接着および形態の違いを示した。このインビトロシステムを利用して、NCCにおける機械的シグナル伝達の役割と他の化学信号との相互作用を研究し、NCCと機械的シグナル伝達の関係を深く理解することができます。
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Protocol
1. ヒドロゲル調製物
注:すべてのステップは、無菌を維持するために使用する前にエタノールと紫外線(UV)滅菌で消毒された細胞培養フードで行う必要があります。ピンセットやピペットなどの工具にはエタノールを散布する必要があります。緩衝液はまた無菌濾過されなければならない。
- アミノシランコーティングガラスカバーリップの調製
- 所望の数のガラスカバーリップを実験室のワイプの上に置きます。
注:3~4カバーリップを追加準備して、バックアップ用品が壊れやすいように十分なバックアップを確保してください。ガラスカバーリップの異なる材料は、細胞の播種と取り付けの異なる互換性をもたらすでしょう。実験を開始する前に、どのタイプが実験に最も適しているかを判断することをお 勧めします(材料表を参照)。 - アルコールバーナーまたはブンゼンバーナーを使用して、各カバースリップを炎を通して行ったり来たりして滅菌します(タンパク質アッセイ実験では30s)。各ガラスカバースリップを実験室のワイプに置いて冷まします。
- ガラスカバーリップが冷却されたら、滑りを防ぐためにパラフィルムが並ぶペトリ皿に移します。
注: カバーリップが十分に冷え込んでいない場合、残熱はパラフィルムをスリップに溶かし、使用できなくなります。 - カバーリップを約200 μL、800 μLの0.1 M NaOHをそれぞれ12 mmと25mmのカバースリップで覆い、5分間座らせます。その後、0.1 M NaOHを吸引し、カバーリップをさらに5分間空気乾燥させて均一なフィルムを形成します。
- カバーリップを乾燥させた後、ピペットは3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)の約80 μLと150 μLをそれぞれ12mmおよび25mmのカバーリップに対して行います。パラフィルムに溶液をこぼさないように注意してください。ソリューションを5分間座ります。
- できるだけ過剰なAPTSを吸引し、残留APTSを5分間乾燥させます。カバーリップを滅菌、脱イオン化(DI)H2 Oに3回、毎回5分間に沈めることで十分にリンスします。
注:ガラスカバーリップがうまくすすい込まない場合、残留APTSはグルタルアルデヒドとの望ましくない反応を引き起こし、白い沈殿物を形成し、使用できないカバーリップを生じさせる。 - 反応性の側面を上に向けた新しいペトリ皿にカバーリップを移動します。ペトリ皿に0.5%のグルタルアルデヒドを加えてカバーリップを完全に覆い、カバーリップを30分間座させます。
- 0.5%グルタルアルデヒドを吸引し、3分間DI H2Oで再度カバーリップをすすいします。使用する前に、実験室のワイプまたはきれいなペトリ皿にカバーリップ反応性の側面を完全に空気乾燥するように設定します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。カバーリップは、使用するまで生殖不能DI H2Oに配置する必要があります。
- 所望の数のガラスカバーリップを実験室のワイプの上に置きます。
- シリコン化カバーリップの調製
- パラフィルムが並ぶペトリ皿に、アミノシランコーティングされたカバーリップ(ステップ1.1.1)と同じ数のカバーリップを入れます。
- ピペット40 μLまたは150 μLは、それぞれ12mmおよび25mmのカバーリップをカバースリップの片側にジクロロメチルシラン(DCMS)し、溶液を5分間座らせる。
- 残りの溶液をカバースリップから吸引し、滅菌DI H2Oで1分間洗浄し、反応性カバーリップを実験室のワイプの上に置いて完全に空気乾燥してから次のステップに進みます。
- ヒドロゲルの準備
- アクリルアミド、ビスアクリルアミド、およびDIH2Oを1.5 mL遠心分離チューブに混合し、様々な剛性を有する500μLの溶液を調製する( 表1参照)。30 sの溶液を完全に混合するボルテックス。
- 迅速に作業し、10%過硫酸アンモニウム溶液(APS)とテトラメチルエチレンアミン(TEMED)をチューブに加え、溶液を再び渦液に添加して溶液を混合します。
注:新鮮な10%APSを準備し、氷の上に残すか、その敏感な凍結/解凍サイクルのために単独使用のアリコートに凍結します。 - ピペットは、乾燥した12mmまたは25mmのアミノシランコーティングカバーリップ(セクション1.1)に溶液の約33μLまたは100 μLをそれぞれ塗布した。
- 湾曲したピンセットを使用して、処理側がゲル溶液に触れるゲル溶液の上にDCMS処理カバースリップを直ちに置き、DCMS処理カバースリップとアミノシランコーティングカバースリップの間にゲル溶液を挟みます。
- ゲル溶液を5~15分間重合させ、チューブ内の残った溶液のゲル重合を積極的にモニタリングします。
- ゲルを重合したら、曲面ピンセットまたはカミソリの刃でDCMS処理カバースリップを分離し、ゲルを元のアミノシランコーティングカバースリップに取り付けたままにします。
- 500 μL と 2 mL の無菌 PBS または DI H2O で覆われた所定の 4 ウェル/24 ウェルプレートと 6 ウェル プレートに、取り付けられたヒドロゲルを付けたカバースリップを 12 mm および 25 mm のカバーリップに対して、それぞれ 12 mm および 25 mm のカバーリップでカバースリップし、ゲルが乾燥するのを防ぎます。
- すべてのカバーリップについて、手順 1.3.4 ~ 1.3.7 を繰り返します。
- ヒドロゲルを30分間無菌PBSまたはDIH2Oに沈水し、過剰なアクリルアミド溶液を除去する。ヒドロゲルを滅菌PBSまたはDI H2Oで4°Cで保管し、ここで手続き停止を行います。
- 暗い部屋で、スルフォスハチニミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(スルフォ-SANPAH)混合物を50mM 2-[4-2の2.5 mL混合して準備する (2-ヒドロキイェチン-1-イル)エタンスルホン酸(HEPES)(pH=8.5)の25 μLを円錐形チューブに50 μg/mLスルフォ-SANPAH、 光から保護するためにアルミ箔で包みます。使用する前に、溶液をよく混ぜるためにピペットを使用してください。
注:スルフォ-SANPAH溶液の容積は約25の12のmmヒドロゲルか5つの25のmmヒドロゲルのために十分である。 - ウェルプレートからPBSまたはDIH2Oを吸引する。スルフォ-SANPAH溶液(ステップ1.3.10)のカバーリップを12mmと25mmに約100μLまたは500 μLずつ加え、ゲルを覆います。溶液がゲル全体を覆っていることを確認してください。
注: 吸引力が強くてヒドロゲルを引き裂いたり、邪魔したりしないように真空吸引強度を調整します。 - 15 W、365 nmのUV光の下にゲルを10分間、スルフォ-SANPAHと反応するUV光の干渉を最小限に抑えるように覆い隠します。
- 余分なスルホ-SANPAHを、できるだけ多くの溶液を集めるためにプレートを傾けて吸引する。ゲルを50 mM HEPESで2~3回洗浄します。
- 500 μL と 2 mL を 12 mm と 25 mm のゲルにそれぞれ加え、50 mg/mL のコラーゲン I を 0.2% 酢酸で希釈し、ヒドロゲルを含む各ウェルにします。ゲルを37°C、5%CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。
注:50 mM HEPESの代わりに0.2%の酢酸でコラーゲンIを希釈し、均質な分布とコラーゲンIの付着を促進します。 - コラーゲンIを吸引し、滅菌PBSでゲルを3回洗浄し、1回5分間余分なコラーゲンIを除去する。ヒドロゲルを10%馬血清でPBSにインキュベートし、37°Cで2時間5%FBS、5%CO2インキュベーターでインキュベートします。
注:10%馬の血清を添加すると、前の出版物で行われたFBSのみを使用するのと比較して、より高い増殖を促進します。 - 培地を吸引する。10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシン(P/S)を備えた無菌フィルターのDulbeccoの修正イーグルミディアム(DMEM)を500 mLずつ加えます。ゲルを37°C、5%CO2インキュベーターに保存し、細胞培養の準備が整うまで保管します。
- 準備ができたら、約1.5×104 O9-1細胞/cm2を培養皿の基底培地に入れる。37°C、5%CO2でインキュベーターに2日間細胞をインキュベートする。細胞が合流していることを確認し、細胞がゲルに十分に結合していること、および細胞の数が分析のために収集される前に十分であることを確認します。
注: O9-1 セル20の回復、通過、および収集の手順については、以前に公開されたプロトコルを参照してください。 - ヒドロゲルのさらなる分析のためにセクション2、3、または4に進みます。
2. AFMによる剛性の定量的分析
- AFM システム コンピュータを起動し、AFM コントローラを起動します ( 資料一覧を参照)。
- AFMプローブホルダーにAFMカンチレバーを取り付けます。カンチレバーの端部に0.5 μmのシリカビーズを取り付けた球形の片持ち体(球形ビーズ付き片持ちレバー)を使用してください。
注: 10 kPa、20 kPa、40 kPa などの硬質ヒドロゲルの場合、スプリング定数 0.24 N/m の硬いプローブが使用されました。より柔らかいプローブは、0.5 kPaや1 kPaなどの柔らかいヒドロゲルに使用され、ばね定数は0.059 N/mでした。 - AFM ソフトウェアを 接触モードで設定します。
- シリコンウェーハをAFMサンプルステージに取り付け、カンチレバーがシリコン基板に触れる 際にEngage をクリックして力曲線を収集し、力曲線を生成します。
- キャリブレーションには上記の力曲線(2.4)を使用し、制御ソフトウェアで [較正] をクリックして、熱調整条件下でカンチレバーの平均ばね定数を取得し、校正された値を制御ソフトウェアに保存します。
- 60 mm ペトリ皿に取り付けたヒドロゲルを含むカバースリップを AFM スキャンステージに取り付けて、サンプルを取り付けます。測定を行う前にPBSを3 mL加えて、ゲルが乾燥するのを防ぎます。
- AFMを 接触モード (流体)で動作するように設定して、測定を開始します。球形のビーズを引き付けて、ゲルサンプルに連続的に触れて持ち上げます。
- 片持ちのしきい値が 10 nm に保たるように設定します。プローブのランプサイズを10μmに保ちます。次に、ステップ 2.4 のように力のカーブを記録します。
- ヒドロゲルの表面を横切る少なくとも3〜10の異なるスポットから少なくとも20の力曲線を獲得する。
- AFMイメージングおよび解析ソフトウェアを使用して、各スポットの平均ヤング率〜20フォース曲線を計算します。拡張ランプフォースカーブと線形化モデル(球面)を使用します。各サンプルのすべてのスポットの平均を計算して、最終的な剛性を得る。
注: ヤング率と関連データ(標準偏差 )は、自動的にスプレッドシートとして保存されます。 - すべてのサンプルについて、手順 2.6 ~ 2.10 を繰り返します。
免疫蛍光染色による剛性の分子解析
- ピンセットを使用してカバースリップを新しいプレートに輸送し、プレート上で直接成長した細胞からの偽信号を最小限に抑えます。500 μLの無菌PBSで細胞を3回洗浄し、死んだ細胞および残った培養培地を除去します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500 μLを室温で10分間、邪魔されずに500 μLで固定します。次いで、500μLのPBS/ウェルをそれぞれ2分間使用して細胞を3回再洗浄します。
注意:手続き停止のために4°Cで保管してください。 - 500 μLのトリトン X-100 を室温で 15 分間処理します。その後、500μLのPBS/ウェルで細胞を3回洗浄します。
- 250 μLのロバ血清(PBSで希釈し、Tween 20)を1ウェルあたり30分間、室温で30分間ブロックします。
- 250 μLの一次抗体を室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 その後、500 μLのPBS/ウェルで細胞を5分間3回洗浄します。
注:抗ビンクリン(Vcl)(1:250)および抗AP2アルファ(1:250)は、この実験で使用され、10%ロバ血清に希釈されました。 - 20%ロバ血清10%の10%の10%のmlの150 μLの1:400の希釈でFアクチン染色に使用される対応する二次抗体および/またはファロインと共に細胞を室温で30分間インキュベートする。次いで、細胞をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄する。
注:568 nmファロイジンは、488 nmまたは647 nmの二次抗体またはそれ自身で共インキュベートすることができます。 - PBSの250 μLで4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI、1:1000希釈)で細胞を10分間インキュベートし、最後にPBSを2分間洗浄します。
- 取り付け媒体を3~4滴ずつ取り付けます。サンプルを4°Cに保存して、イメージングの前に少なくとも2時間セットし、取り付け媒体が正しく設定されていることを確認します。
- 蛍光顕微鏡でヒドロゲルサンプルあたり少なくとも3つのランダムフレームの画像をキャプチャし、個々のチャネルと結合されたチャネルを生成します。
4. 定量リアルタイム PCR (RT-qPCR)
- RNA採取用の付着細胞を含むヒドロゲルを新しいプレートに移し、細胞プレートに結合した細胞からの不要なRNAを最小限に抑えます。細胞をPBSで3回洗浄し、死細胞や培養培地を除去します。
- RNA抽出キットを使用して合計mRNAを抽出します。メーカーの指示に従って逆転写スーパーミックスを使用してRNAからcDNAへの逆転写を行います。
- 選択した剛性マーカーとして Vcl のプライマーでRT-qPCRを行い、2-ΔΔCT 法を用いて分析します。
注:Vclのプライマーシーケンス:フォワード5' GCTTCAGTCAGACCCATCG 3';逆 5' AGGTAAGCAGTCAATGT 3' .
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Representative Results
AFMとヘルツモデルによるヒドロゲル調製と剛性評価
ここでは、アクリルアミドとビスアクリルアミドの比率を調節することによって、様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを生成するための詳細なプロトコルが提供される。しかし、ポリアクリルアミドヒドロゲルは、ECMタンパク質の不足のために細胞の接着の準備ができていません。このように、スルホ-SANPAHは、リンカーとして作用し、ECMタンパク質の一次アミンと共有結合し、ECMタンパク質の一次アミンと反応して、ECMタンパク質の接着を可能にし、UV活性化後のスルフォ-SANPAHの N-ヒドロキシシムチイドエステルを介してヒドロゲルの表面に接着することを可能にする。コラーゲンタイプは、O9-1細胞の付着を効果的に促進するために選択したECMタンパク質として使用された。異なるヒドロゲルの正確な剛性値を確保するために、弾性率を描写する既知の技術であるAFMを使用して剛性評価を行った。
ポリアクリルアミドヒドロゲルをガラスカバースリップにうまく形成し、付着すると、ゲルは表面が均一で最小限の引き裂きでカバースリップに付着したままであった。この剛性は、インデント技術の原理に基づいてAFMによって測定され、硬いインダンターを、インデント深度26に到達するために必要な力を有するサンプルに適用された。この測定により、ヤングの弾性率は、Hertzのモデルにおける深さと力のインデント、弾性理論26に基づいて計算された。しかし、AFMによる結果の大きなばらつきのため、ゲル溶液26の不均一な表面及び不完全な均質性の影響を最小限に抑えて定量的結果を得るために追加の統計的方法を適用した。AFMを用いて定量的測定を行うために、ゲルサンプル上の各位置から少なくとも50の力と距離曲線を集集して、平均サンプル剛性を求めて採取した。高剛性ゲルに適用される力は、より柔らかいゲルに適用されるよりも高く、硬い基質がフォース対Zグラフで急な斜面を生み出したことを示し、その力はnNで測定され、Zはインデンターとサンプルの間のインデント深さを示す。
ソフトヒドロゲルでは、AFMプローブからの必要な力が少なくなるほど、発生した力曲線の傾きが緩やかであった(図1A)。しかし、40kPaの弾性率を有するような硬質ヒドロゲルでは、適用力がより柔らかいゲルよりも高かったので、生成された斜面ははるかに急であった(図1B)。プローブとヒドロゲルサンプルの分離が減少すると、プローブの先端がガラスカバースリップに触れるにつれて、曲線が大幅に増加します。ただし、分離距離が長くなるほど、適用力がないため曲線は 0 に近づくだけです。
図1Aに示すように、AFMプローブ上の片持ち線は、青色の線で示されるゲルに近づき、プローブはゲルサンプルに浸透し、最終的にガラスカバースリップに到達するために必要な加力を測定し、急激な力の増加を引き起こした。必要なソリューションの品質など、プロシージャエラーやインストゥルメンタルエラーが発生する可能性があるため、ヒドロゲルサンプルの真の剛性は、所望の剛性から大きく、遠く離れています。したがって、AFMは、さらなる実験で誤ったデータの提示を防ぎながら、方法論を検証し、確認するのに有用なツールです。
このAFM評価では、5つの調製されたヒドロゲルサンプルを定量的アプローチを通じて測定した。このプロトコルは、0.5 kPa、1kPa、10 kPa、20 kPa、および40 kPaのヒドロゲル剛性レベルに焦点を当て、様々な細胞タイプの分化について報告された生物学的基質剛性レベルの幅を模倣した。AFM測定から得られた力曲線を用いて、AFM解析アルゴリズムソフトウェアを用いてヤングの弾性率をキロパスカルで生成した(図2)。
ポリアクリルアミドヒドロゲル系と細胞型の比較
Tseたちの研究グループによる元のプロトコルのこの適応は、O9-1細胞20を用いてNCCのメカノイ感受性の側面を研究するための効率的かつ効果的なアプローチを提供する。前のプロトコルの変更には、ECMタンパク質インキュベーションの改変が含まれます:50 mM HEPESを0.2%の酢酸に置き換え、細胞培養用の10%の馬血清とFBSを添加します(ステップ1.3.14-1.3.15)。これらの変更は、この改変ゲル系のO9-1 NCCの成長と維持を元の(制御)プロトコルの成長と維持と比較することによって検証された。ここでは、基底培地で各系に対して1kPa及び40kPaの弾性率を有する両方のヒドロゲル系で野生型O9-1細胞を培養した。全体的な細胞成長状態と開発は、アポトーシス特性、強調された形態、およびヒドロゲルへの細胞の付着のための明視野光顕微鏡を使用して可視化された。元のゲル系で成長したO9-1細胞は、1kPaおよび40kPaヒドロゲルの両方に対して過剰な丸い細胞(図3E,F)によって示される死細胞の数が多くなった。
これに対し、改変ゲル系上で増殖したO9-1細胞は、ヒドロゲル基材への健康な細胞増殖および十分な付着性を示した(図3G、H)。また、NCCマーカーTcfap2α(AP-2)のIF染色を行うことにより、修飾ヒドロゲル系とのNCCの相溶性を評価した。AP-2は、マウス胚の発達を調節するためにNC系統で発現される転写因子であり、したがって、適合性27を評価するのに適している。制御および修飾ヒドロゲル系で成長したO9-1細胞はともにAP-2を発現したが、より強い蛍光シグナルおよび対応する定量化によって示されるように、改変ヒドロゲル系上でめっきされたO9-1細胞におけるAP-2発現の有意な増加があった(図4A、B)。
さらに、P19細胞は、細胞の増殖に対する改変ヒドロゲル系の利点をさらに検証するために使用した。P19は、マウス28における胚由来の奇形癌に由来した胚癌細胞株である。対応する培養プロトコルを用いて、P19細胞を制御および改変ヒドロゲル系の両方で増殖させ、生存および増殖特性を監視した。ブライトフィールドイメージングは、両方のヒドロゲル系にメッキされたP19細胞が、過剰な丸い浮遊細胞と細胞基板の添付ファイルの欠如を示していることを明らかにした(図3A-D)。この観察は、O9-1 NCCがNCCで機械的なシグナリングを研究するのに、変更されたプロトコルがより適していることを示唆した。
硬質基質に対する高ストレス繊維発現の可視化
修飾ヒドロゲルは、異なる剛性レベルおよび他のエフェクターのゲル上で培養された細胞の形態の違いを定量的および定性的に分析することを可能にした。ヒドロゲルが細胞播種の準備ができたら、野生型O9-1細胞を異なる剛性レベルのヒドロゲルに継代した。細胞は、その形状、空間的広がり、さらには最小限の死んだ細胞でヒドロゲル上の付着を観察することによって、その健康と成長を監視した。いくつかの研究は、高剛性基質上のMSCのストレス繊維および細胞接着の増加を示しており、より硬い基質上で成長したNCCは、より柔らかい基板29、30で成長したNCCと同様の知見を示すことを示唆している。
F-アクチンはミオシンIIと共に、α−アクチニン、および他の細胞骨格タンパク質は、ストレス繊維31として総称して知られている。これまでの研究では、機械的な力の増加に応答してストレス繊維アセンブリの増加が観察されました 31.応力繊維の一端または両端で、焦点接着複合体へのアタッチメントにより、細胞がECM31に移行および付着することを可能にする。F-アクチンの発現と組織を可視化するファロイジン染色は、機械的シグナル伝達に応答して健全な細胞増殖を示した(図5)。さらに、低剛性または高剛性ヒドロゲルで増殖したO9-1細胞は、様々な量のストレス繊維を通じて異なる形態を示した(図5)。MSCを用いて行われた報告された研究からの観察と同様に、より硬い基質上で成長したO9-1細胞、40kPaは、より多くのストレス繊維を示し、より柔らかいヒドロゲルで成長した細胞と比較して十分に広がったことが観察された。
細胞接着の評価
基質剛性の変化がNCC接着に影響を及ぼすという仮説をさらに確認するために、Vcl発現の変化は、異なるヒドロゲル剛性レベルに応答するNCCのRT-qPCRを介して定量的に測定した。Vclは、細胞が基板との接触を確立し、ECM特性32を感知する過程で焦点接着複合体に存在する多数の細胞骨格タンパク質の一つである。焦点付着は、細胞質アクタルジン細胞骨格に固定するインテグリン受容体を介したECMへの細胞の接触点であり、F-アクチン33Vcl遺伝子発現レベルは、基質剛性に応答してO9-1細胞の焦点付着および細胞接着の変化を示唆している。
これまでの研究では、その発現の違いによる胚性幹細胞および線維芽細胞における細胞接着に対するVclの効果が示された。 Vclの高発現に対して、焦点接着の数とサイズも増加したが 、Vcl が34を倒すと減少した。一貫して 、Vcl-欠損細胞はまた、細胞接着および広がりに有意な減少を示した35。また、Vclは、焦点接着性36を安定化させることにより細胞接着を調節する役割を果たす。焦点接着の大きさ、成熟レベル、および組成物は、基質の剛性に応じて変化し、したがって、信号を細胞内に伝達させ、細胞がそれらの環境キュー37に応答することを可能にする。このように、Vclは、硬質基質上で増殖した細胞における焦点接着複合体に対して高くリクルートされ、RT-qPCR(図6C)によって検出されたより高いmRNAレベルによって反映される。
より柔らかい基質上で増殖した細胞は、細胞15内のVclの低いmRNAレベルによって反映されるように、最小限の焦点接着複合体を形成する。図6Cにおいて、O9-1細胞は軟質基材上よりも硬質基材上のVclの発現が高い。これらの結果は、軟質基質上のO9-1細胞よりも硬質基質上のO9-1細胞の細胞基質接着のレベルが高いことを示唆している。さらに、Vcl発現は、抗Vcl抗体によるIF染色を通じて定性的に可視化し、RT-qPCRの発見をさらに補完し、支持した。硬質基質上で増殖したO9-1細胞のVcl発現は、より柔らかい基質(図6A,B)で増殖したものよりも高く、高細胞接着の初期発見をさらに支持し、40kPaヒドロゲルに広がった1kPaヒドロゲルと比較して、RT-qPCRを介してF-アクチンファロイジン染色およびVcl発現レベルで観察された。
図1:AFMプローブのインデントから生成された力の曲線。 力(y軸)はnNで適用される必要な力を示し、Z(x軸)はサンプルからのブルカーAFMプローブ距離をμmで示す。1 kPa ヒドロゲル(A)の場合、生成された傾斜は、40 kPa ヒドロゲル(B)に対して観測される急斜面に対して緩やかである。色付きの曲線は、AFMプローブがヒドロゲルサンプルから近づくと(青)、引き込み(赤)に対するカンチレバーの動きを表します。曲線の最も高い開始点は、ガラスカバースリップの剛体接触を示します。(B)40 kPaヒドロゲルの引き込み曲線の大きなディップは、ビーズとサンプルとの間の接着を示す。略語: AFM = 原子間力顕微鏡. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヤングの弾性率から計算したヒドロゲルの平均剛性(kPa単位)。 ヤング率は 、図1の力曲線から生成された。ヒドロゲルの参照弾性率は、0.5kPa、1kPa、10 kPa、20kPa、および40kPaであった。誤差範囲は標準偏差を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:P19およびO9-1細胞の明視野画像は、細胞増殖特性を検出するために制御およびゲル系の1kPaおよび40kPaヒドロゲルにメッキされた。死んだ細胞は赤い矢印で示されます。スケールバー= 25 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:NCC適合性を可視化するO9-1 NCCにおけるNCCマーカーAP-2の蛍光染色を有する。(A)40kPa変性ヒドロゲル系(B)と比較した40kPa制御AP-2 (緑);核はDAPI(青色)で染色した。スケールバー= 25 μm(C) 棒グラフは、有意性を示す AP-2 式レベルの定量化を提供します(p-value= 0.003) (n = 3)。データは、指定された標準偏差誤差範囲を持つ相対式を示します。略語: NCC = 神経堤細胞;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:40kPaヒドロゲル上のO9-1細胞に十分に広がったストレス繊維を示すF-アクチンの蛍光ファロイドン染色。O9-1細胞を1kPa(A)及び40kPaヒドロゲル(B)で培養した。O9-1細胞をアレクサフルオール488ファロイン(緑色)を用いて染色し、核をDAPI(青)で染色した。スケールバー= 25 μm略語: DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:O9-1細胞におけるビンクリンの免疫蛍光画像O9-1細胞を1kPa(A)及び40kPa(B)ヒドロゲルにメッキした。核はDAPI(青色)で染色した。スケールバー=25μm(C)1kPaおよび40kPaヒドロゲルで培養されたO9-1細胞におけるVclの全mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析。1kPaヒドロゲル上のVcl発現量は、40kPaヒドロゲル(p−値=0.02)上のそれよりも有意に低い。データは、提供された標準偏差誤差範囲を持つ平均を示します。略語: DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 500 μL の総容積 | 0.5キロパ | 1 kPa | 10キロパ | 20キロパ | 40キロパ | ||
| 40% アクリルアミド (μL) | 37.5 | 62.5 | 125 | 100 | 100 | ||
| ビスアクリルアミド(μL) | 15 | 7.5 | 25 | 66 | 120 | ||
| H2O (μL) | 447.5 | 430 | 350 | 334 | 280 | ||
| 10% APS (μL) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | ||
| テムド(μL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
表1:必要な剛性レベルを得るために、対応するソリューションの量。
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Discussion
現在の研究の目的は、NCCにおける機械的信号の影響をよりよく理解するための効果的かつ効率的な インビトロ システムを提供することです。上記のステップバイステップのプロトコルに従うだけでなく、研究者はO9-1 NCCの細胞培養がヒドロゲルの調製に使用されるガラスカバーリップの種類によって影響を受けることを覚えておいてください。例えば、特定のタイプのガラスカバースリップに播種された細胞( 材料表を参照)は生き残り、増殖が良好であり、他のタイプのガラスカバーリップに播種された培養細胞はより多くの細胞死を示した。さらに、O9-1 NCC38の正しい細胞培養条件に厳密に従うことが重要です。細胞培養の品質は、ヒドロゲルをできるだけ早く使用する場合、または滅菌37°Cインキュベーターに最大2日間保存する場合に最適です。
プロトコルの各コンポーネントの感度により、弾性率は実験によって異なる可能性があります。10% APS に関するプロトコル(ステップ 1.3.2)に記載されている点に加えて、考慮すべき他の重要な要因も変動に影響を与えます。AFM測定で大きな変動を引き起こすと疑われたもう一つの要因は、ヒドロゲルの厚さであった。以前の研究では、15〜1000 μmの範囲のヤングのモジュライに対する厚さの影響を調査し、厚さの違いがヤングのモジュライを有意に39に変えないことがわかった。しかし、基質の厚さは、細胞が感知できる機械的特性にも影響を及ぼし、異なる形態40、41、42を導く。様々な研究は、ヒドロゲルの厚さの有意な増加が、細胞領域の減少、広がり、およびヒドロゲル40、41、42の効果的な剛性を導くことを示した。しかし、細胞のフェノタイプもまた、有意に薄いヒドロゲルに応答して変化し、例えば、低剛性ヒドロゲル40、41、42でも高い広がりをする。ポリアクリルアミドゲルの一貫した体積を使用すると、わずかな偏差がAFM測定で弾性率に大きな影響を与えないように、ヒドロゲルの厚さが均一でなければなりません。
他の滅菌方法がより複雑になり、ガラスカバーリップに潜在的な損傷を引き起こす可能性があるため、アルコールバーナーを使用して炎の中で前後に通過させることによって、カバーリップを殺菌する方が良いです。ガラスカバーリップの異なるサイズは、実験要件に基づいて使用することができます。このプロトコルは、それぞれ免疫検査とRT-qPCR用に12mmおよび25mmのカバーリップを利用した。実験に適したサイズのゲルを使用することで、効率が高まり、無駄を最小限に抑えることができます。これらの改変は、元の(制御)ハイドロゲルシステム20と比較してO9-1 NCCの最適化を確実にするために定性的および定量的に検証された。O9-1 NCCの全体的な健康と成長は、細胞および基質の取り付け特性のための明視野顕微鏡の下で評価された。
さらに、O9-1細胞の相溶性を制御と修飾されたヒドロゲル系の両方と比較し、IF染色を用いてAP-2式を定性的に可視化することによって、このプロトコルの改変をさらに検証した。シグナルの強度を定量化し、制御と修飾されたヒドロゲル系の間のO9-1細胞におけるAP-2発現の代表的な画像をさらに支持した。AP-2は一般的なNCCマーカーであるが、多能性および生存期間28のNCC維持に対する意義のために、Sox10やPax3のような検証のために他のよく知られたマーカーを考慮しなければならない。さらに、このプロトコルの最適化は、O9-1 NC細胞を別の細胞株P19と比較することによってさらに確認され、このヒドロゲル系がNC細胞にとって効率的かつ信頼性が高いものであることを保証した。P19細胞は不滅の特徴を持ち、容易に培養されるが、いずれのヒドロゲル系でもうまく繁栄しなかった。
細胞が付着する基質または組織の剛性から発生する伸長力に対する抵抗は、しばしばヤングの弾性率45として表される。AFMを使用すると、ヤングの弾性率は、加えた垂直力26から生成された力曲線から得られる。AFM測定中、硬いヒドロゲルの測定値が不正確につながる測定の間に大きな変動が生じる可能性があります。不整合は、測定に使用される不適切なプローブによって引き起こされる可能性があります。例えば、20 kPaおよび40 kPaヒドロゲルの測定では、より高いばね定数(k = 0.24 N/m)の硬いプローブを使用する必要があります。より硬いプローブは、より柔らかいプローブに比べて低い解像度を可能にします。しかし、柔らかすぎる片持ちレバーがサンプル46に付着する可能性があるので、より硬いプローブの選択を好む理由があります。また、あまりにも柔らかいプローブは非常に感度が高く、不要な粒子からの偽の信号に寄与し、真の剛性46よりも人為的に低いまたは高い剛性値を生じる。さらに、ポアソン比の正確な入力は、測定材料に応じて注意する必要があります。これはデータ出力に大きく影響するため、標準化された研究で見つけることができます。
また、AFMは、細胞が環境47、42を感知する方法に影響を与える別の機械的特性である厚みとして、ヒドロゲルの厚さを測定するために利用した。様々な報告された研究では、軟質ヒドロゲルで増殖した細胞は、細胞タイプ47、42、48に応じて、〜2〜5μmで報告される「臨界厚」で、かつ超えた形状で丸い形状であることが観察される。しかし、細胞が「臨界厚」42,48よりも厚みが低い同じ剛体のヒドロゲル上で細胞をめっきした場合、はるかに高い広がりを観察した。この興味深い発見の潜在的な説明は、ヒドロゲルのサブクリティカルな厚さは、細胞が横変位47のための牽引力を発揮するように、細胞が硬い下層ガラスカバーリップを感知することを可能にするということです。全剛性ヒドロゲル全体の平均厚さは342 μmで、標準偏差は27 μmでした。ヒドロゲルの厚さは、提案された「臨界厚」よりも高く、また、400μm未満の試験範囲内で、研究および製造されたプレメイドヒドロゲルで報告された範囲内で、細胞がヒドロゲルの異なる剛性を感知し、基礎となる硬質ガラスカバーリップ42,48を感知することができなかった。
また、AFM定量分析法に加えて、ヒドロゲルを免疫染色により定性的に分析し、O9-1細胞の様々な剛性の影響を受けるマーカーの発現を研究し、細胞の健全な成長を可視化した。細胞質中のF−アクチンは、タリンやVclなどの細胞骨格タンパク質のセットを介して膜結合インテグリンに接続され、焦点接着複合体33を形成する。細胞内のストレス線維の発現は、タリンやインテグリンなどの細胞内の他の細胞骨格遺伝子の発現を測定することによっても分析することができ、焦点接着染色キットを用いて一緒に可視化することができた。
機械的なシグナル伝達による細胞接着およびストレス繊維の変化に見られるように、NCCの形態および応答に影響を与えるヒドロゲル剛性の度合いはさまざまであった。このプロトコルは、インビトロで対応する培養条件を変更することによって、様々な細胞タイプへの細胞分化に影響を与える能力を提供し、NCCの機械的信号および化学信号の操作の便利な方法を提供する。前述のように、NCC分化の運命は、その剛性2、3を含む周囲の組織に存在する機械的な力によって主に導かれる。本論文の当面の目標は、NCC培養のためのヒドロゲルを調製するためのステップバイステップのプロトコルを開発することであったが、このプロトコルの潜在的な利点は、方法論を超えて広がり、NCCにおける機械的シグナル伝達のさらなる知識を追求する。また、このin vitroシステムにはいくつかの制限があることも注目に値します。ヒドロゲルを製造するこの技術は、異質性、不均一な表面、不正確な剛性を含む、途中で技術的なバリエーションを潜在的に導入することができる複数のステップを含む。したがって、ユーザーは、実験中の技術的な変動を最小限に抑えるために、これらの手順を慎重に実行する必要があります。また、この系におけるポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドの毒性による2D培養に限定された研究を行い、NCCが生息する正確な3D生物学的環境を無視して50に居住する。
これらの制約にもかかわらず、このin vitroシステムは、あらゆるレベルの研究に利益をもたらし、研究者が十分で機能的な下流テストを行うことを可能にする安価で簡単な方法を可能にします。最近の知見に見られるように、NCCは、剪断力や基質剛性などの機械的シグナル伝達と、Wntや線維芽細胞成長因子シグナル伝達などの化学シグナル伝達、頭蓋顔面における化学シグナル伝達、ならびに脊椎動物6、15の心臓発達の両方に大きく依存している。このプロトコルを使用すると、in vitro実験のための局所的な微小環境は、分化、移動、細胞応答、および有害疾患の進行の可能性を含むNCCに関する将来の研究のために容易に模倣することができる。したがって、このインビトロシステムは、Nccにおける機械的シグナル伝達の役割と他のシグナル伝達経路との相互作用を研究するための強力なツールとなり、NCCの開発および関連疾患の分子および遺伝的メカニズムの理解を深める。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
テキサス大学ヘルスサイエンスセンターの原子間力顕微鏡-UTコア施設の運営者であるアナ・マリア・ザスケ博士は、このプロジェクトでAFMに貢献した専門知識を持ってくれたことに感謝します。また、国立衛生研究所(K01DE026561、R03DE025873、R01DE029014、R56HL142704、R01HL142704)からJ.Wangへの資金源に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-012 | |
| 2% Bis-Acrylamide | Sigma Aldrich | M1533 | |
| 24-well plate | Greiner Bio-one | 662165 | |
| 25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip | Chemglass Life Sciences | CLS-1763-025 | |
| 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS) | Sigma Aldrich | A3648 | |
| 4-well cell culture plate | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% Acrylamide | Sigma Aldrich | A4058 | |
| 50% glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G7651 | |
| 6-well cell culture plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| AFM cantilever (spherical bead) | Novascan | ||
| AFM software | Catalyst NanoScope | Model: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 248614 | Powder |
| anti-AP-2α Antibody | Santa Cruz | sc-12726 | |
| anti-Vinculin antibody | Abcam | ab129002 | |
| Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope Catalyst | Bruker Corporation | ||
| Collagen type I (100mg) | Corning | 354236 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dichloromethylsilane (DCMS) | Sigma Aldrich | 440272 | |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fluorescence microscope | Leica | Model DMi8 | |
| Fluoromount-G mounting medium | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Powder |
| Horse serum | Corning | 35-030-CI | |
| iScript Reverse Transcription Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| Penicillin-Streptomycin antibiotic | Thermo Fisher | 15140148 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| Sterile 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| Sterile deionized water | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR green | Applied Biosystems | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 |
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