Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Kvantitativ 31P NMR-analyse af ligniner og tanniner

Published: August 2, 2021 doi: 10.3791/62696
Automatic Translation
2, 1, 1
1Department of Molecular Sciences and Nanosystems, Ca’ Foscari University of Venezia, 2Departments of Chemistry and Forest Biomaterials, North Carolina State University

Summary

31 P NMR er et kraftfuldt værktøj til strukturel udredning af polyfenoler. Denne hurtige, nemme, præcise, kvantitative og meget reproducerbare analyseprocedure, der giver mulighed for kvantificering og differentiering af de forskellige typer af hydroxy, phenol og carboxylic grupper i ligniner og tanniner er nu blevet et rutinemæssigt analytisk værktøj.

Abstract

Udviklingen af bæredygtige bioraffinaderiprodukter står bl.a. over for udfordringen med brunin og tannin valorisering. Disse rigelige, vedvarende aromatiske biopolymers er ikke blevet udnyttet bredt på grund af deres iboende strukturelle kompleksitet og høje grader af variation og artsdiversitet. Manglen på en defineret primær struktur for disse polyfenoler forværres yderligere med komplekse kemiske ændringer, der induceres under forarbejdningen, hvilket i sidste ende giver en lang række strukturelle træk af ekstrem betydning for enhver yderligere udnyttelsesindsats.

Derfor er en protokol for hurtig, enkel og utvetydig identifikation og kvantificering af de forskellige funktionelle grupper, der findes i naturlige polyfenoler, en grundlæggende forudsætning for forståelse og dermed skræddersy deres reaktivitet og eventuelle nytteværdi.

Kvantitative 31P NMR giver mulighed for hurtigt og pålideligt at identificere usubstitueret, o-mono erstattet, og o-disubstituted phenoler, alifatiske OH'er, og carboxylic syre moieties i ligniner og tanniner med bredt anvendelsespotentiale.

Metoden består af en in situ kvantitativ lignin- eller tanninmærkningsprocedure ved hjælp af en passende 31P-indeholdende sonde efterfulgt af erhvervelse af et kvantitativt NMR-spektrum på 31P i nærværelse af en intern standard. Den høje naturlige overflod af 31P kernen giver mulighed for små mængder af prøven (~ 30 mg) og korte NMR erhvervelse gange (~ 30-120 min) med velafsluttede 31P signaler, der er meget afhængige af det omgivende kemiske miljø af mærket OH grupper.

Introduction

Denne procedure, som for nylig blev offentliggjort i Naturprotokol1 er blevet citeret over 3.000 gange i arkivlitteraturen og er blevet en rutinemæssig måling for lignin og tanninkarakterisering, da det giver væsentlige, hurtige og reproducerbare strukturelle oplysninger.

Lignin og tanniner
Når Grøn Kemi blev indført ved Paul T. Anastas og John C. Werner2,3, det drastisk ændret den generelle opfattelse af kemi. Især fremhæves betydningen af at anvende bæredygtige materialer i stedet for fossile råmaterialer som olie og kul som udgangspunkt som et afgørende aspekt2,3. Blandt de forskellige typer biomasse er lignin den mest rigelige aromatiske biopolymer og kan ses som en potentiel kilde til industrivarer og produkter med høj merværdi4.

Lignin er den næstmest rigelige træbestanddel (med cellulose er først og hemicellulose tredje). Dens indhold i planter varierer afhængigt af plantetypen: for eksempel hårdttræ karakteriseret ved en lavere mængde lignin sammenlignet med nåletræ (20% ± 4% vs. 28% ± 4%). Derudover er ligninfordelingen i vegetabilsk væv ikke homogen: det højere ligninindhold findes i cellevæggen5,6. Lignin er et polyphenolic materiale, der industrielt fremstilles som biprodukt fra papir-/celluloseindustrien7. Det genvindes fra træmasseprocessen, hvor træflis primært forarbejdes i nærværelse af OH- og / eller OH- + HS- ionforhold for at adskille cellulose fra hemicellulose og lignin (Soda- og / eller Kraft-processer)8,9.

De første forsøg på at studere lignin blev foretaget af Payen og Schultze, henholdsvis i 1838 og 186510. I 1977 opsummerede Adler al den relevante tilgængelige viden om den tid11. Det er i øjeblikket anerkendt, at lignin byggesten er tre phenyl-propanoid enheder: p-coumaryl, nåletræ, og sinapyl alkoholer. Disse monomerer, takket være en fri radikal polymeriseringsproces, giver anledning til p-hydroxyphenyl, guaiacyl og sinapylenheder, der i sidste ende stort set udgør lignin (Figur 1)12. Manglen på en primær struktur i ligniner indebærer en iboende vanskelighed for dens strukturelle karakterisering. Derfor har evalueringen af fordelingen af molekylvægt altid været noget kontroversiel. Lignin, der er isoleret under milde forhold, der tilnærmer sig det meste protolignin10, består af oligomerer13 , som i høj grad interagerer via supramolekulære aggregeringsprocesser14,15.

Figure 1
Figur 1: En repræsentativ model af nåletræ lignin, hvor de forskellige typer obligationer er fremhævet.

Ligniner klassificeres almindeligvis afhængigt af: a) den type træ, de er afledt af (f.eks. hårdttræ og nåletræ), b) den proces, der anvendes til at isolere det. De mest afgørende industrielle lignintyper er Kraft, Lignosulfonatter og Organosolv.

Lignins struktur er meget afhængig af dens oprindelse og forarbejdning af kemi. Mere specifikt, når den ret komplekse og uregelmæssige struktur af lignin forværres med sin naturlige mangfoldighed og de komplekse forarbejdningskemikalier, opstår et materiale af ekstrem variation, mangfoldighed og heterogenitet, hvilket begrænser brugen til applikationer af lav værdi16. Mens bruniner af nåletræ hovedsagelig indeholder guaiacylenheder (G) med ubetydelige mængder p-hydroxyphenylgrupper (G lignin), består bruniner af hårdttræ af guaiacyl- og syringyl-underenheder (GS lignin) i forskellige forhold, og græs ligniner udgøres af guaiacyl, syringyl og p-hydroxyphenyl (GSH lignin) subenheder. Den udvindingsmetode , der anvendes til isolation , påvirker dramatisk strukturen af den nye lignin17. Figur 2 viser tre ligninstrukturer, der adskiller sig efter den anvendte isolationsmetode. Nogle overvejelser vedrørende virkningen af ekstraktionsmetoden kunne fremhæves. For det første er Kraft lignin en dealkyleret, stærkt fragmenteret og kondenseret lignin, mens Organosolv lignin har en struktur svarende til fræset træ lignin (isoleret ved hjælp af Bjorkman-tilgangen)18,19,20. Endelig er lignosulfonatter karakteriseret ved en høj grad af sulfonation, afhængigt af intensiteten og betingelserne for den ekstraherive sulfoneringsproces.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative konstruktioner for tekniske ligniner. I dette tal kan forskellene mellem de forskellige typer lignin ses. (A) Nåletræ Kraft lignin er stærkt kondenseret, (B) lignosulfonater er karakteriseret ved suldoniske grupper på mættede kulstof, og (C) organosolv lignin har en struktur svarende til den af fræset træ lignin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Svarende til ligniner er tanniner polyphenolicforbindelser, der findes i planter. En nylig og opdateret gennemgang af tanninernes udvindingsmetoder og applikationer blev for nylig udgivet af Das et al.21. Tanninernes betydning i hverdagen kan fremhæves under hensyntagen til to eksempler: de giver smag og farve til vine22; desuden deres poly-phenolstruktur tilbyder antioxidant egenskaber og gør dem ideelle til anvendelse i garvning industrien23. Tanniner er opdelt i to klasser: hydrolyserbare og ikke-hydrolyzable. Hydrolyzable tanniner kan betragtes som en polymer af galliske, di-galliske og ellagsyreestere (Figur 3). Disse estere skyldes esterificering af phenolsyrer med sukkermolekyler (f.eks. glukose, rhamnose og arabinose).

Figure 3
Figur 3: Typisk hydrolyserbare tanniner: garvesyre, vescalgin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Ikke-hydrolyzable tanniner, også kendt som kondenserede tanniner, er polymerer og oligomerer, der stammer fra flavan-3-ols. Blandt flavan-3-ols, katekiner og gallocatechin er de hyppigste. De er farveløse krystallinske forbindelser (Figur 4). Polymeriseringen skaber en polymer karakteriseret ved en helicoidal struktur. De aromatiske hydroxy grupper er rettet på ydersiden af helixen, mens pyranens ilt er i det indre.

Figure 4
Figur 4: Proantocyanidinstrukturer: R =H, OH, OCH3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Karakterisering af ligniner og tanniner ved hjælp af NMR
To typer oplysninger er afgørende for lignin- eller tanninkarakterisering: a) kemisk struktur (f.eks. hydroxygruppeindhold, natur og hyppighed af interunitforbindelser) og b) molekylvægt og polydispersitet. Siden de tidlige undersøgelser af lignin er der blevet anvendt forskellige teknikker til at nå disse mål, og der er opstået to klasser af metoder: kemiske og fysiske metoder.

I ligninkemi har kemiske metoder, såsom alkalisk nitrobenzeneoxidation, derivatisering efterfulgt af reduktiv kavalergang, permanganatoxidation og thioacidolyse, været historisk udbredt24,25,26,27,28,29. Men selvom de analytiske protokoller er blevet implementeret og optimeret, er de tidskrævende, besværlige og kræver omfattende eksperimentelle færdigheder30. Alternativt, fra begyndelsen af den instrumentale analyse, fysiske metoder er blevet brugt til at udføre lignin og tannin karakteriseringer31. Disse teknikker gør det muligt at overvinde problemerne med klassiske metoder, hvilket gør det nemt at karakterisere ligninstruktur.

Nuklear magnetisk resonans (NMR) gør det muligt at få oplysninger om lignin struktur og kemisk sammensætning blandt de instrumentale teknikker. Navnlig kan data fra kvantitative monodimensionale NMR-spektrepå 1 H og kvantitative NMR-spektre på 13C give oplysninger om forskellige typer lignin-interunitbindinger32,33,34,35. Desværre lider monodimensionalt spektre under signaloverlapning, hvilket i alvorlig grad kan underminere signalintegrationsindsatsen. Kvantitative versioner af HSQC (Heteronuklear Single Quantum Sammenhæng), Q-HSQC (Kvantitativ - Heteronuklear Single Quantum Sammenhæng), er blevet brugt til at forstå lignin struktur bedre, giver nyttige oplysninger om interne forbindelser. De kan dog ikke udnyttes fuldt ud til at bestemme de forskellige bygningers enheder13,36,37 kvantitativt.

For at overvinde de problemer, der er forbundet med mono- og todimensionel NMR, substrat derivatization er blevet overvejet. Blandt fordelene ved denne tilgang er, at specifikke etiketter kan indføres inden for den komplekse makromolekyle, og der ikke opnås spektral interferens fra det opløsningsmiddel, hvor de mærkede substrater opløses1. Verkade var pioner på dette område, udfører 31P NMR analyse af fosfor derivater, kul derivater, og relaterede forbindelser38. I publikationen blev der foretaget en screening af forskellige fosforholdige reagenser (fosfolaner), og den kemiske forskydning af andre mærkede forbindelser blev registreret. Argyropoulos' team indførte først derivatisering med henblik på kvantitativ og kvalitativ analyse af hydroxygrupper i lignin i 1991. Efter at have studeret derivatisering af lignin model forbindelser ved hjælp af fosfor-holdige reagenser, hans gruppe banede vejen for en af de mest daglige anvendte teknikker i lignin kemi, 31P NMR analyse39,40,41,42,43. Blandt de forskellige undersøgte fosfolaner ankom Argyropoulos til brugen af 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane (TMDP) som den mest egnede til at udføre ligninanalyse44. TMDP reagerer selektivt med hydroxygrupper, der forårsager kvantitativ dannelse af fosforholdige derivater, der er karakteriseret ved specifikke 31P NMR-kemiske skift (figur 5).

Figure 5
Figur 5: Lignin og tannin fosphytilation kemi. Mærkning lignin og tannin labile H grupper opnås ved in situ reaktion. De mærkede polyfenoler er karakteriseret ved specifikke 31P NMR-bånd svarende til de forskellige typer hydroxy grupper. Klik her for at se en større version af dette tal.

Prøvederivatisering udføres i en pyridin/chloroform (1.6:1) blanding; dette valg er et resultat af en nøjagtig evaluering. Pyridine har to fordele. For det første forenkler og forstærker og forstærker lignin-solubilisering 45 at vælge et opløsningsmiddel, der er karakteriseret ved en Hildebrand-parameter på ca.22,1MPa1/2. Derfor er tilsætningen af pyridin som opløsningsmiddel, hvis Hildebrand parameter er lig med 21,7, således optimal. For det andet ledsages TMDP's reaktion med hydroxygrupper af dannelsen af saltsyre (HCl) som et biprodukt med samtidige negative konsekvenser for den letkøbte dannelse af lignin-fosfolanederivater. Af denne grund skal den resulterende HCl neutraliseres. Når det er til stede i betydeligt overskud, giver pyridinens grundlighed i forhold til TMDP mulighed for neutralisering af HCl (via dannelsen af pyridinhydrochlorid).

Brugen af det anbefalede pyridin/deuterated binære opløsningsmiddelsystem er baseret på tre grunde. For det første favoriserer det prøveopløsning. For det andet kan det forhindre nedbør og forringelse af det endelige spektrum, da pyrididrchlorid er opløseligt i kloroform. For det tredje vælges deuteret kloroform til sit unikke singlet-signal, hvilket gør det muligt at låse NMR-spektrometeret under erhvervelsesprocessen. Prøvederivatisering udføres i nærværelse af en intern standard. På denne måde gør sammenligningen af integralerne af prøvens toppe og standarden det muligt at kvantificere mængden for hver type hydroxygruppe, der er til stede, når prøven og standarden er derivatiseret. Forskellige forbindelser er blevet betragtet som interne standarder. Disse forbindelser er karakteriseret ved en enkelt hydroxy gruppe pr molekyle, tilbyder et enkelt skarpt signal i 31P NMR spektrum efter derivatization. Valget af standarden skal foretages omhyggeligt. Dens signal må ikke overlappe med signalerne i den derivatiserede prøve. Kolesterol blev meget udbredt i de tidlige dage. En delvis overlapning med signaler, der opstår som følge af alifattisk hydroxy-gruppe, begrænser imidlertid brugen af den. Til rutinemæssig analyse foretrækkes interne standardløsninger af N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximid (NHND). På grund af NHND ustabilitet kan dets standardløsninger dog kun opbevares i et par dage46.

Protocol

Følgende rutediagram (Figur 6) skitserer hele forsøgsprotokollen til at udføre en 31P NMR-analyse af ligniner og tanniner.

Figure 6
Figur 6: Procedure for 31P NMR analyse af ligniner og tanniner. Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Prøveforbehandling

  1. Analysanden (lignin- eller tanninprøven) tørres natten over i en vakuumovn, der er indstillet til 40 °C.
    BEMÆRK: Der er behov for særlig opmærksomhed på temperaturvalget, da temperaturer over 40 °C kemisk kan ændre den følsomme struktur af de undersøgte polyfenoler.
  2. Efter tørring overføres prøven hurtigt til en vandfri calciumsulfatdesikkator, indtil den når stuetemperatur. Dette trin er obligatorisk for at undgå, at prøven absorberer fugtighed fra miljøet.

2. Opløsningsmiddelopløsning

  1. Der fremstilles en pyridin/deuteret blanding af chloroformopløsningsmiddel i et 20 mL prøveglas ved at blande vandfri pyridin og deuteret chloroform i et forhold på 1,6/1 (v/v).
    FORSIGTIG: Vær opmærksom, mens du manipulerer pyridin og deuteret kloroform. Disse forbindelser er brandfarlige, skadelige og giftige. Forbered og brug opløsningen i en godt ventileret røghætte ved hjælp af passende handsker.
  2. Tilsæt 5-8 g godt vasket og tørret aktiveret 5A molekylær sigte i 3,2 mm pellets for at fjerne vandspor. Derudover anbefales det stærkt at bruge en septumhætte for at forhindre luftkontakt og fugtforurening af opløsningsmiddelsystemet. Opbevar den forberedte opløsning i mørke.

3. Intern standardløsning (IS) forberedelse

  1. I en 2 ml Erlenmeyer kolbe, forberede en 0,1 M opløsning af krom (III) acetylacetonat (ca. 10 mg) og intern standard (ca. 35,8 mg NHND eller 77,3 mg kolesterol) i opløsningsmiddelopløsningen tidligere forberedt.
    FORSIGTIG: Chrom (III) acetylacetonat er skadeligt; under manipulationen skal du bære passende handsker.
  2. Registrer den nøjagtige vægt af IS tilføjet i IS-løsningen.
  3. IS-opløsningen overføres i et hætteglas, der er udstyret med en forseglet hætte, der indeholder aktiverede molekylære sigte (se punkt 2.2), og den opbevares i mørke ved 40 °C.

4. NMR prøveopløsningspræparat

  1. Nøjagtigt vejer ~ 30 mg prøve i en 2 mL hætteglas udstyret med en omrøring bar. Forsegl hætteglasset med en septumhætte.
  2. Opløsningsopløsningen tilsættes 0,5 mL af opløsningsmiddelsystemet til prøveglasset.
  3. 100 μL af IS-opløsningen i prøveglasset via en mikropipette. Magnetisk rør den resulterende spredning (500 rpm), indtil alle lignin eller tannin er opløst, hvilket resulterer i en klar opløsning.
    BEMÆRK: Da komplet prøve solubilisering er bydende nødvendigt, kan dette trin tage op til 12 timer.
  4. Overfør 0,1 mL TMDP til prøveopløsningen. Prøven anbringes under kraftig magnetisk omrøring. Hold prøveopløsningen forseglet. Brug TMDP i en godt ventileret røghætte, mens du bærer passende handsker.
    FORSIGTIG: TMDP og dets dampe er ætsende, skadelige og interagerer hurtigt med vand.
    BEMÆRK: Dannelsen af et gult bundfald skyldes vandspor i prøven eller pyridin/chloroformopløsningen. I så fald skal proceduren gentages ved at sikre, at al mulig fugtforurening undgås.
  5. Prøveopløsningen overføres til et NMR-rør ved hjælp af en Pasteur-pipette.

5. NMR-analyse

  1. Læg røret i NMR-instrumentet. Det spektrometer, der bruges til at udføre denne analyse, har brug for en bredbåndssonde.
  2. Ret forsøgsparametrene i overensstemmelse med den indstilling, der er vist i tabel 11.
PULS PROGRAM Omvendt indhegnet afkoblingspuls (zgig)
NUKLEOUS 31P
SPEKTRAL BREDDE Klokken 22.00.m.
ANSKAFFELSESTID - 0,8 s
FORSINKELSE AF AFSLAPNING ≥ 10 s
SCANNER NUMMER 64 eller mere
SPECTRUM CENTER Klokken 14.00.m.

Tabel 1: Eksperimentelle parametre til registrering af 31P NMR-spektre af derivatiserede ligniner eller tanniner.

  1. Indstil spektrometerfrekvensen ved hjælp af resonansfrekvensen for deutereret kloroform, shim prøven og tune spektrometeret. Start derefter købet.

6. Spektrumbehandling og -analyse

  1. Behandl 31P NMR-rådata med en passende standardsoftware i henhold til følgende trin.
    1. Udfør Fourier transformation.
    2. Juster fase efter manuel fasekorrektion (Behandling | Fasekorrektion | Manuel rettelse).
    3. Ret oprindelig plan manuelt, og angiv forsigtigt nulpunkter (Behandling | Oprindelig | Oprindelig rettelse af flerepunkter).
  2. Signalkalibrering.
    1. Indstil signalet for fossphitetslammet vand ved den kemiske skiftværdi på 132,2 ppm (Analyse | Reference | Reference).
      BEMÆRK: Tilstedeværelsen af et skarpt 31P-signal ved 175 ppm skyldes overskridelsen af TMDP. Dens tilstedeværelse sikrer fuldstændig derivatisering af prøven. Hvis denne top er fraværende, er man nødt til at revidere hele proceduren ved at give en grundig prøve og opløsningsmiddel tørring og tilføje mere TMDP. Når dette er garanteret, zoomes spektret i spektralområdet 132 til omkring 150 ppm (Figur 7).

Figure 7
Figur 7: Kontroller tilstedeværelsen af et overskud af TMDP: Hvis det kan ses, er derivatiseringen af prøven fuldstændig. Spektret kan derefter analyseres. For at gøre det zoome i spektralområdet mellem 155 og 132 ppm. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Integration
    1. Normaliser integrationen ved at indstille den interne standard til 1,0 (klik på peak | Rediger integreret | Normaliseret: 1,00). Udfør frekvensintegration i henhold til de kemiske skift, der er rapporteret i følgende tabeller. Brug tabel 2 til ligniner og tabel 3 til tanniner.
FUNKTIONEL GRUPPE CHEMICAL SHIFT (ppm)
Alifattisk OH 149.0-146.0
Phenol OH 144.0-137.4
C5 erstattet phenol OH 143.0-140.2
5-5' phenol OH 141.7-140.2
Syringyl OH 143.2-142.7
4-O-5' OH 142.8-141.7
Guaiacyl OH 140.2-138.8
p-hydroxyphenyl OH 138.8-137.4
COOH 136.0-133.6
Tricin 137.0-136.0

Tabel 2: 31P NMR kemiske skift for lignin fosphitylated OH-grupper.

FUNKTIONEL GRUPPE CHEMICAL SHIFT (ppm)
Ring A
o-unsubstituted phenol 137.9–137.4
o-erstattet PHENOLIC 138.8–137.9
Ring B
Katekin OH 140.2–138.8
Pyrogallol OH 144.0–140.2
Ring C
AliphatiC OH 146.0–145.0

Tabel 3: 31P NMR kemisk skift for tannin fosfitetslamsterede OH-grupper.

BEMÆRK: Ved hjælp af standardspektralbehandlingssoftware er det muligt at indstille foruddefinerede områder af det kemiske skift, der skal integreres. Denne mulighed er fordelagtig, når flere spektre skal behandles.

7. Kvantificering af funktionelle grupper

  1. Beregn koncentrationen af IS-opløsningen.
    Equation 1
  2. Beregn den tilsvarende mængde af det specifikke signal:
    Equation 2
    Equation 3

Representative Results

Den beskrevne protokol kan anvendes både til analyse af ligniner og tanniner. I ligninkemi er denne metode grundlæggende, fordi den gør det muligt at opdage og kvantificere de forskellige typer hydroxygrupper. Figur 8A-D viser eksempler på 31P NMR-spektre af ligniner og tanniner erhvervet med spektrometre, der arbejder ved forskellige frekvenser. Det spektrum, der er vist i figur 8A, blev registreret ved hjælp af et 300 MHz NMR-spektrometer, mens figur 8D blev registreret med et 700 MHz NMR-instrument.

Figure 8
Figur 8: Kvantitativt NMR-spektrumpå (A) nåletræssyre lignin (spektrum registreret med et 300 MHz spektrometer på 30,8 mg lignin), B) brunkulsulfonsyre (spektrum registreret med et 300 MHz spektrometer på 30,1 mg lignin efter bevarelse af lignosulfonat til lignosulfonsyre), C) Akacie tannin (spektrum registreret med et 300 MHz spektrometer på en prøve på 30,3 mg) og (D) nåletræssyre lignin (spektrum registreret med et 700 MHz spektrometer på 7,2 mg lignin). Klik her for at se en større version af dette tal.

Disse spektre blev omhyggeligt registreret og behandlet manuelt. De typiske signaler for alifatiske (150-145 ppm), aromatiske (145-137 ppm), og carboxylic (136-134 ppm) hydroxy grupper er meget godt løst og som sådan let integreret. Hvis spektralvinduet åbnes (fra 95 til 190 sider pr. minut, figur 8), vises tre skarpe, stærke toppe (175, 144 og 132 sider pr. minut). Disse skyldes overskuddet af TMDP, den interne standard (kolesterol eller NHND), og hydroxylated-TMDP (forårsaget af vand spor), henholdsvis.

I modsætning til kraft og organosolv lignin er lignosulfonater uopløselige i pyridin/chloroformblandingen. For at opnå et pålideligt 31P NMR-spektrum er opløselighed obligatorisk. For at løse dette problem kan lignosulfonater omdannes til de tilsvarende lignosulfonsyrer før derivatisering. Behandling af lignosulfonatopløsninger med stærke syrer (dvs. svovlsyre) eller syrebytterharpikser (f.eks. Dowex 1H, en stærk syre cation veksler) driver omdannelsen af alle sulfonatgrupperne i deres sure former. De resulterende produkter kan fjernes fra den sure opløsning ved hjælp af selektive adsorptive harpikser (XAD-7, en polar adsorbent, der bruges til at isolere forbindelser karakteriseret ved molekylvægte op til 60.000 u.m.a) analyseret ved hjælp af denne protokol. Figur 8B viser det kvantitative 31P NMR-spektrum af et TMDP-derivatiseret lignosulfonsyre. Selv i dette tilfælde er de forskellige signaler fra hydroxy-grupperne tydelige. Figur 8C viser et typisk kvantitativt 31P NMR spektrum af en tanninprøve, derivatiseres ved hjælp af TMDP. Et karakteristisk signal fra de forskellige alifatiske OH (Ring C), pyrogallol og katekinenheder i ring B og enheder i ring A er godt synlige.

Discussion

Den beskrevne metode repræsenterer gennemførelsen og optimeringen af den analytiske protokol , der tager sigte på kvalitativ og kvantitativ karakterisering af ligniner som udviklet af Argyropoulos37,38,39,40,41,42. Sammenlignet med mange andre teknikker til rådighed for lignin strukturel udredning, metoden er blevet bredt accepteret som værende blandt de mest letkøbte, hurtig, og reproducerbare. Gyldigheden af de våde kemiske metoder (f.eks. nitrobenzene, permanganatoxidationer osv.) afhænger af operatørens gode eksperimentelle færdigheder, hvilket effektivt begrænser metoden til begrænsede operatører. Desuden er det ikke ualmindeligt at støde på korrektion faktorer i litteraturen for våde kemiske metoder til at tegne sig for flere ulemper. Den beskrevne 31P NMR-protokol kræver ikke avancerede eksperimentelle færdigheder, der gør dette let anvendeligt, brugervenligt og bredt tilgængeligt. Sammenlignet med andre instrumentale analysemetoder er 31P NMR den eneste teknik, der er i stand til præcist at detektere og kvantificere de forskellige hydroxygrupper i ligniner. For eksempel kan FTIR bruges til at identificere forskellige hydroxy grupper såsom 1H NMR. Begge teknikker lider imidlertid, da de ikke kan tilbyde pålidelige kvantitative data på grund af omfattende problemer med signaloverlapning. En anden udbredt teknik er UV-Vis spektroskopi, først rapporteret af Goldschmid. Tilgangen er imidlertid begrænset til en generel generel bestemmelse af hydroxy grupper, da den ikke effektivt kan skelne mellem alifatisk, aromatisk og carboxylic OHs47.

Fra et økonomisk synspunkt er den eneste begrænsning af 31P NMR-teknikken prisen på TMDP, som er et relativt dyrt reagens. Det koster omkring 190 USD pr. gram; Hvis analyseomkostningerne derfor kun ville blive tilnærmet til prisen på TMDP, bortset fra dem, der stammer fra pyridin/chloroformblandingen og omkostningerne på driftstiden, ville det beløbe sig til ca. 24 USD pr. analyse. For at løse dette problem tyer mange laboratorier til at syntetisere TMDP og dermed reducere reagensomkostningerne. For at gøre dette reagerer pinacol og fosfor trichlorid i nærværelse af triethylamin44. Teknisk set er denne reaktion relativt let; der kræves dog forsigtighed ved anvendelsen af fosfortrichlorid og oparbejdet heraf, herunder velkontrolleret vakuumdestillation. Flere oplysninger om syntesen af TMDP kan gives efter anmodning.

Selv om denne protokol er blandt de bedste med hensyn til lethed, reproducerbarhed og præcision, nogle kritiske punkter skal fremhæves. For det første skal prøven være fuldt opløselig i den identificerede pyridin/chloroformblanding. Denne overvejelse er grundlæggende, fordi hydroxylgruppernes kvantitative fosfitetsreaktion skal finde sted under helt homogene forhold. Hvis kun en del af prøven opløses, vil den resulterende analyse være unøjagtig. For det andet skal den prøve, der skal undersøges, være fugt- og opløsningsmiddelfri, da disse variabler vil påvirke analysens præcision og samlede succes negativt. Spor af fugtighed vil reagere med TMDP giver 2-hydroxy-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane. Denne forbindelse er en lysegul flocculating salt, uopløselig i pyridin / chloroform opløsningsmiddel blanding, forårsager utilstrækkelig NMR signal erhvervelse. Da kun en lille vægt (~ 30 mg) af en prøve er påkrævet, det skal være fri for flygtige stoffer for sin præcise vægt, der skal være præcist kendt før analysen.

Nogle gange kan prøvesolvationsproblemer fremmes (især for stærkt oxiderede prøver) ved at tilføje små mængder af et co-opløsningsmiddel (dvs. dimethylformamid), der hjælper prøveopløsning. I princippet kan alle opløsningsmidler, der ikke interagerer med TMDP, bruges til at hjælpe med at prøve opløsning. Valget af et co-opløsningsmiddel kan ikke omfatte co-opløsningsmidler, der indeholder labile hydroxy eller aminogrupper, da de reagerer med reagenset, hvilket forårsager vildledende endelige spektre. Især, dimethylsulfoxid reagerer også med TMDP udelukker dets anvendelse som et co-opløsningsmiddel. Pyridinebaserede ioniske væsker, såsom 1-allyl-3-butylpyridiniumchlorid, kan anvendes, når der opstår problemer med opløselighed; den ioniske væske skal dog igen være tør48. For at opløse lignosulfonatter (en lignintype karakteriseret ved en høj sulfoneringsgrad) viste en forbehandling, der involverede omdannelse af neutraliserede grupper til deres sure form, at være nyttig. Lignosulfonatter kan nemt omdannes til deres sure forhold ved hjælp af sure udvekslingsharpikser i vandige medier. De resulterende lignosulfonsyrer isoleres fra opløsningen ved deres adsorption på specifikke harpikser (f.eks. XAD-7) og desorption i ethanol. Fordampning af ethanolopløsningerne over reduceret tryk ved 40 °C gør det muligt at isolere lignosulfonsyrer. Disse ligniner kan derefter karakteriseres ved 31P NMR, fordi de er opløselige i den pyridin/chloroformblanding, der foreslås i protokollen.

Langvarig vakuumtørring ved milde temperaturer reducerer effektivt mængden af fugt og andre flygtige stoffer i hver prøve. Især påvirker små mængder vand ikke det endelige spektrum, fordi TMDP tilsættes for meget. Desuden kan der i nogle tilfælde opstå en lille mængde 2-hydroxy-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane som følge af den luftfugtighed, der er til stede i NMR-røret eller prøveglasset. I disse tilfælde er omrøring tilstrækkelig til at opløse mængden af det dannede bundfald helt. Hvis der dannes en høj mængde 2-hydroxy-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, foreslås det at gentage prøvepræparatet, hvilket forbedrer tørringsbehandlingen. For eksempel, før brug, kan alt glasvarer kortvarigt opvarmes med en varmepistol.

Det spektralområde, der bruges til at registrere spektret, er bredt sammenlignet med interesseområdet for signalet vedrørende de forskellige hydroxylgrupper. Dette er dog obligatorisk at forstå, om prøveforvirringsafledningen fandt sted med succes. Bekræftelsen af komplet prøvederivatisering gives ved tilstedeværelsen af et stærkt signal omkring 174 ppm. Denne skarpe top skyldes den ureakterede TMDP, og dens eksistens sikrer, at reagenset var til stede i overskud, og derfor er alle hydroxylgrupper blevet derivatiseret. Hvis denne top er fraværende, er de to mest sandsynlige årsager: (1) den anvendte mængde TMDP er utilstrækkelig til at udføre fuldstændig derivatisering af prøven, eller (2) der er en høj mængde vand til stede i prøven. I det første tilfælde vil brugen af en højere mængde TMDP sandsynligvis sikre stikprøvens fuldstændige derivatisering, og signalet ved 174 ppm vises. I det andet tilfælde skal prøven tørres mere indgående. Når et overskud af TMDP er sikret, kan peak integration udføres. Før denne handling skal du zoome til et smallere vindue (150 til 132 sider pr. minut), der begrænser interessesignalerne.

Mængden af prøve (~ 30 mg), der skal analyseres, rapporteret i ovenstående eksperimentelle protokol, er blevet udvalgt til at indsamle spektre af god kvalitet til en 300 MHz NMR spektrometer eller mere. Ikke desto mindre har vi observeret, at det er muligt at reducere prøvemængden, hvis der anvendes en 500 MHz eller højere feltmagnet. I figur 8Dvises nmr-spektret (som følge af et 700 MHz-instrument) af en prøve, der er fremstillet med 7,2 mg lignin. Signalintegration af dette spektrum giver de samme resultater som dem, der opnås ved brug af større mængder lignin. Denne kendsgerning forstærker anvendelsen af denne protokol for al den forskning, hvor der findes små mængder produkter.

Samlet set kan denne eksperimentelle protokol anvendes på mange forsknings- og udviklingsapplikationer, når det er nødvendigt at forstå oprindelsen og skæbnen for de forskellige hydroxygrupper, der findes i ligniner og tanniner. Især når de kombineres med GPC- og HSQC-data, giver de resulterende data mulighed for yderligere at uddybe og spekulere over strukturen af lignin eller en tannin. I mange tilfælde, hvor kemiske modifikationer anvendes på hydroxy grupper af lignin eller en tannin, kvantitative 31P NMR analyser kan være yderst værdifuldt at opdage, om disse ændringer fandt sted, og i hvilken grad. For eksempel viser figur 9 to NMR-spektre af samme lignin før og efter oxidationen. En simpel kvalitativ evaluering viser reduktionen af både alifatiske og aromatiske hydroxy grupper ved oxidation, hvilket giver værdifuld information og vejledning.

Figure 9
Figur 9: Kvantitativt 31P NMR-spektre af samme Organosolv lignin derivatiseret ved hjælp af TMDP (A) Før og (B) efter oxidationen. Spektret blev registreret ved hjælp af et 300 NMR-spektrometer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Afslutningsvis har denne teknik alle egenskaber ved at være blandt de mest væsentlige og kraftfulde værktøjer, når undersøgelser, der beskæftiger sig med polyphenolic, OH-bærende ligniner og tanniner (og endda syntetiske polymerer)49,50,51 skal foretages inden for en række områder, lige fra kemi til teknik, fra biologi til polymer og farmaceutiske applikationer.

Disclosures

Claudia Crestini og Dimitris S Argyropoulos sikre, at alle forfattere (C.C., N.P., og D.S.A.) har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde i årenes løb er blevet støttet af forskellige finansielle priser, der omfattede organisationer som Pulp and Paper Research Institute of Canada, McGill University Montreal, Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, National Science Foundation USA, United States Department of Agriculture og Solvay-virksomheden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 - 1000 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0866
20 - 200 µl Eppendorf micropipette VWR 613-0865
2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphospholane, 95% Sigma-Aldrich 447536
Analytical balance (sensibility ± 0.1 mg) Precisa LX220 A
Binder Vacuum Oven Binder VD53
Certified Vial Kit, Low Adsorption (LA), 2 mL, pk of 100 Sigma-Aldrich 29651-U
Chloroform-d Sigma-Aldrich 151823
Cholesterol, Sigma-grade Sigma-Aldrich C8667
Molecular sieves, 4A Sigma-Aldrich 208604
N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide, 97% Sigma-Aldrich 226378
NMR spectrometer, 300 MHz Bruker
Norell natural quartz 3 mm NMR tubes Sigma-Aldrich NORS33007
Pipette tips, 100-1000 µL UltraFine (blue) VWR 613-0342
Pipette tips, 20-200 µL Bevel Point (yellow) VWR 613-0239
Pyridine, anhydrous, 99.8% Sigma-Aldrich 270970
Stirring bars,micro, 3 mm lenght VWR 442-0360
Stirring bars,micro, 6 mm lenght VWR 442-0362
Triphenylphospine oxide, 97% Sigma-Aldrich T84603
Vials for environmental analysis, WHEATON,  20.00 mL DWK Life Sciences WHEAW224609
Weighing paper, grade 531 VWR 516-0318P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, X., et al. Determination of hydroxyl groups in biorefinery resources via quantitative 31 P NMR spectroscopy. Nature Protocols. 14 (9), 2627-2647 (2019).
  2. Anastas, P. T., Williamson, T. C. Green chemistry: An overview. Green Chemistry. 626, 1-17 (1996).
  3. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: Principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
  4. Collins, M. N., et al. Valorization of lignin in polymer and composite systems for advanced engineering applications - A review. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 828-849 (2019).
  5. De Gruyter. Biorefinery: From Biomass to Chemicals and Fuels. , (2012).
  6. Sannigrahi, P., Pu, Y., Ragauskas, A. Cellulosic biorefineries-unleashing lignin opportunities. Current Opinion in Environmental Sustainability. 2 (5), 383-393 (2010).
  7. Lange, H., Decina, S., Crestini, C. Oxidative upgrade of lignin - Recent routes reviewed. European Polymer Journal. 49 (6), 1151-1173 (2013).
  8. Glasser, W. G. Classification of lignin according to chemical and molecular structure. Lignin: Historical, Biological, and Materials Perspectives. 742, 216-238 (1999).
  9. Wiley. Kirk-Othmer Concise Encyclopedia of Chemical Technology, 2 Volume Set, 5th Edition. , Wiley. (2004).
  10. Lewis, N. G., Sarkanen, S. Preface. Lignin and Lignan Biosynthesis. 697, 9-11 (1998).
  11. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11 (3), 169-218 (1977).
  12. Ragauskas, A. J., et al. Lignin valorization: Improving lignin processing in the biorefinery. Science. 344 (6185), (2014).
  13. Crestini, C., Melone, F., Sette, M., Saladino, R. Milled wood lignin: A linear oligomer. Biomacromolecules. 12 (11), 3928-3935 (2011).
  14. Guerra, A., et al. On the propensity of lignin to associate: A size exclusion chromatography study with lignin derivatives isolated from different plant species. Phytochemistry. 68 (20), 2570-2583 (2007).
  15. Contreras, S., Gaspar, A. R., Guerra, A., Lucia, L. A., Argyropoulos, D. S. Propensity of lignin to associate: Light scattering photometry study with native lignins. Biomacromolecules. 9 (12), 3362-3369 (2008).
  16. Gigli, M., Crestini, C. Fractionation of industrial lignins: opportunities and challenges. Green Chemistry. 22 (15), 4722-4746 (2020).
  17. Adler, E. Structural elements of lignin. Industrial & Engineering Chemistry. 49 (9), 1377-1383 (1957).
  18. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 1. Extraction of lignin with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 477-485 (1956).
  19. Bjorkman, A. Studies on finely divided wood. Part 2. Extraction of lignin-carbohydrate compelexes with neutral solvents. Svensk Pappersit. , 243-251 (1957).
  20. Bjorkman, A. Studied on finely divided wood. Part 5. The effect of milling. Svensk Pappersit. , 329-335 (1957).
  21. Das, A. K., Islam, N., Ashaduzzaman, F. O., Dungani, R. Review on tannins: Extraction processes, applications and possibilities. South African Journal of Botany. 135, 58-70 (2020).
  22. Laitila, J. E. Composition and evolution of oligomeric proanthocyanidin-malvidin glycoside adducts in commercial red wines. Food Chemistry. 340, 127905 (2021).
  23. Covington, A. D., Wise, W. R. Tanning Chemistry. , RSC Publishing. (2019).
  24. Tarabanko, V. E., Tarabanko, N. Catalytic oxidation of lignins into the aromatic aldehydes: General process trends and development prospects. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2421 (2017).
  25. Guerra, A., Mendonça, R., Ferraz, A., Lu, F., Ralph, J. Structural characterization of lignin during pinus taeda wood treatment with ceriporiopsis subvermispora. Applied and Environmental Microbiology. 70 (7), 4073-4078 (2004).
  26. Faix, O., Andersons, B., Zakis, G. Determination of carbonyl groups of six round robin lignins by modified oximation and FTIR spectroscopy. Holzforschung. 52 (3), 268-274 (1998).
  27. Santos, R. B., Capanema, E. A., Balakshin, M. Y., Chang, H., Jameel, H. Lignin structural variation in hardwood species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 60 (19), 4923-4930 (2012).
  28. Bose, S. K., Wilson, K. L., Hausch, D. L., Francis, R. C. Lignin analysis by permanganate oxidation. II. Lignins in Acidic Organosolv Pulps. Holzforschung. 53 (6), 603-610 (1999).
  29. Harman-Ware, A. E., et al. A thioacidolysis method tailored for higher-throughput quantitative analysis of lignin monomers. Biotechnology Journal. 11 (10), 1268-1273 (2016).
  30. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  31. Lin, S. Y., Carlton, W. D. Methods in Lignin Chemistry. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1992).
  32. Lundquist, K. Proton (1H) NMR Spectroscopy. Methods in Lignin Chemistry. , 242-249 (1992).
  33. Robert, D. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrometry. Methods in Lignin Chemistry. , 250-273 (1992).
  34. Li, S., Lundquist, K. A new method for the analysis of phenolic groups in lignins by 1H NMR spectrometry. Nordic Pulp & Paper Research Journal. 9 (3), 191-195 (1994).
  35. Hallac, B. B., Pu, Y., Ragauskas, A. J. Chemical transformations of buddleja davidii lignin during ethanol organosolv pretreatment. Energy & Fuels. 24 (4), 2723-2732 (2010).
  36. Sette, M., Wechselberger, R., Crestini, C. Elucidation of lignin structure by quantitative 2D NMR. Chemistry - A European Journal. 17 (34), 9529-9535 (2011).
  37. Sette, M., Lange, H., Crestini, C. Quantitative HSQC analyses of lignin: A practcal comparison. Computational and Structural Biotechnology Journal. 6 (7), 201303016 (2013).
  38. Wroblewski, A. E., Lensink, C., Markuszewski, R., Verkade, J. G. Phosphorus-31 NMR spectroscopic analysis of coal pyrolysis condensates and extracts for heteroatom functionalities possessing labile hydrogen. Energy & Fuels. 2 (6), 765-774 (1988).
  39. Archipov, Y., Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part I. Model compounds. Journal of Wood Chemistry and Technology. 11 (2), 137-157 (1991).
  40. Argyropoulos, D. S., Heitner, C., Morin, F. G. P. NMR spectroscopy in wood chemistry - Part III. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores in mechanical pulp. Holzforschung - International Journal of the Biology, Chemistry, Physics and Technology of. 46 (3), 211-218 (2009).
  41. Argyropoulos, D. S., Heitner, C. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part VI. Solid state 31P NMR of trimethyl phosphite derivatives of chromophores and carboxylic acids present in mechanical pulps; a method for the quantitative determination of ortho-quinones. Holzforschung. 48 (1), 112-116 (1994).
  42. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry part V. Qualitative analysis of lignin functional groups. Journal of Wood Chemistry and Technology. 13 (2), 187-212 (1993).
  43. Argyropoulos, D. S., Bolker, H. I., Heitner, C., Archipov, Y. 31P NMR spectroscopy in wood chemistry. Part IV. Lignin models: Spin lattice relaxation times and solvent effects in 31P NMR. Holzforschung. 47 (1), 50-56 (1993).
  44. Granata, A., Argyropoulos, D. S. 2-Chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane, a reagent for the accurate determination of the uncondensed and condensed phenolic moieties in lignins. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 43 (6), 1538-1544 (1995).
  45. Duval, A., Vilaplana, F., Crestini, C., Lawoko, M. Solvent screening for the fractionation of industrial kraft lignin. Holzforschung. 70 (1), 11-20 (2016).
  46. Ben, H., Farrell, J. R. In-depth investigation on quantitative characterization of pyrolysis oil by 31P NMR. RSC Advances. 6 (21), 17567-17573 (2016).
  47. Goldschmid, O. Determination of phenolic hydroxyl content of lignin preparations by ultraviolet spectrophotometry. Analytical Chemistry. 26 (9), 1421-1423 (1954).
  48. Ben, H., et al. Characterization of whole biomasses in pyridine based ionic liquid at low temperature by 31P NMR: An approach to quantitatively measure hydroxyl groups in biomass as their original structures. Frontiers in Energy Research. 6, (2018).
  49. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis of potentially biobased copolyesters based on adipic acid and butanediols: Kinetic study between 1,4- and 2,3-butanediol and their influence on crystallization and thermal properties. Polymer. 99, 204-213 (2016).
  50. Debuissy, T., Pollet, E., Avérous, L. Synthesis and characterization of biobased poly(butylene succinate-ran-butylene adipate). Analysis of the composition-dependent physicochemical properties. European Polymer Journal. 87, 84-98 (2017).
  51. Chan, K. P., Argyropoulos, D. S., White, D. M., Yeager, G. W., Hay, A. S. Facile quantitative analysis of hydroxyl end groups of Poly(2,6-dimethyl-1,4-phenylene oxide)s by 31P NMR spectroscopy. Macromolecules. 27 (22), 6371-6375 (1994).

Tags

Kemi udgave 174
Kvantitativ <sup>31</sup>P NMR-analyse af ligniner og tanniner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Argyropoulos, D. S., Pajer, N.,… More

Argyropoulos, D. S., Pajer, N., Crestini, C. Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins. J. Vis. Exp. (174), e62696, doi:10.3791/62696 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter