Summary
Detta protokoll visar en ny metod för att tillämpa genterapier på subpopulationer av celler hos neonatala råttor i postnatala åldrar 5-10 dagar genom att injicera en anterograd kemogenetisk modifierare i den somatomotoriska cortexen och ett retrogradt transportabelt Cre-rekombinas i livmoderhalsen.
Abstract
Att framgångsrikt ta itu med de hinder som begränsar forskning på neonatala råttor är viktigt för att studera skillnaderna i resultat som ses vid pediatriska ryggmärgsskador (SCI) jämfört med vuxna SCIs. Dessutom kan det vara utmanande att på ett tillförlitligt sätt införa terapier i målcellerna i centrala nervsystemet (CNS), och felaktigheter kan äventyra effekten av studien eller terapin. Detta protokoll kombinerar viral vektorteknik med en ny kirurgisk teknik för att exakt introducera genterapier i neonatala råttor vid postnatal dag 5. Här introduceras ett virus konstruerat för retrograd transport (retroAAV2) av Cre vid axonterminalerna hos kortikospinalneuroner i ryggmärgen, där det därefter transporteras till cellkropparna. En dubbelfloxad inverterad orienteringsreceptor (DIO) som uteslutande aktiveras av designerläkemedel (DREADD) -virus injiceras sedan i hjärnans somatomotoriska cortex. Denna dubbelinfektionsteknik främjar uttrycket av DREADDs endast i de saminfekterade kortikospinalkanalerna (CST). Således är samtidig saminjektion av de somatomotoriska cortex- och cervikala CST-terminalerna en giltig metod för att studera den kemogenetiska moduleringen av återhämtning efter cervikala SCI-modeller hos neonatala råttor.
Introduction
Även om SCI är en relativt sällsynt förekomst i den pediatriska befolkningen, är den särskilt traumatisk och orsakar en permanent funktionsnedsättning som kräver enorm logistisk framsynthet. Dessutom klassificeras en högre andel av pediatriska områden av gemenskapsintresse som livmoderhalscancer och fullständiga jämfört med den vuxna befolkningen 1,2. Ett kännetecken för däggdjursarter är att nyfödda återhämtar sig betydligt bättre från SCI än vuxna, och detta ger en möjlighet att bedöma de drivande mekanismerna för återhämtning i yngre populationer 3,4,5. Trots detta finns det färre multimodala studier som behandlar forskning om nyfödda och nyfödda gnagare, delvis på grund av den extra svårigheten att exakt rikta in sig på utvalda populationer av neuroner i de mycket snävare anatomiska landmärkena hos yngre djur6. Denna artikel fokuserar på direkt injektion av högeffektiva anterograd och retrograd adenoassocierade vektorer i råttans ryggmärg för att modulera stora motorvägar med tillämpning av Cre-dependent-DREADDs, vilket utökar räckvidden för multimodala regenereringsstudier.
Virala vektorer är viktiga biologiska verktyg med en bredd av applikationer, inklusive introduktion av genetiskt material för att ersätta målgener, uppreglera tillväxtproteiner och spåra det anatomiska landskapet i CNS 7,8,9. Många av de anatomiska detaljerna i ryggradsmotoriska vägar har studerats med klassiska spårämnen, dvs biotinylerad dextranamin. Medan traditionella spårämnen har varit avgörande för att avslöja neuroanatomi, är de inte utan nackdelar: de märker urskillningslöst vägar även om de injiceras korrekt, och studier har visat att de tas upp av skadade axoner10,11,12. Följaktligen kan detta leda till felaktiga tolkningar i regenereringsstudier där avskurna axoner kan misstas för regenererande fibrer.
Följande metod använder det tvåvirala vektorsystemet som nyligen populariserats i moduleringsstudier, med två olika virala vektorer i två separata områden av samma neuron13,14. Den första är en vektor som lokalt infekterar cellkropparna i projektionsneuroner. Den andra är en retrograd vektor som transporteras från axonterminalerna i projektionsneuronerna (figur 1). Den retrograda vektorn bär Cre-rekombinas, och den lokala vektorn innehåller "Cre-On" dubbelfloxad sekvens där ett fluorescerande protein (mCherry) kodas. Den ursprungliga transgenen som uttrycker både hM3Dq och mCherry är inverterad i förhållande till promotorn och flankeras av två LoxP-platser (figur 2). Således uttrycks mCherry endast i de dubbelt transducerade projektionsneuronerna där Cre-rekombinas inducerar en rekombinationshändelse mellan LoxP-platserna, vänder transgenens orientering till lämplig läsram och tillåter uttryck av både DREADD och det fluorescerande proteinet. När virustransgenen är i rätt riktning, och i förekommande fall, kan DREADD: erna tillfälligt inducera neuromodulering genom en separat injicerad ligand, dvs klozapin-N-oxid. Protokollet utformades för att autentisera inducerbar neuromoduleringsforskning hos nyfödda, där DREADDS injiceras för att modulera CST: erna selektivt. Det tvåvirala systemet fungerar som en försäkring och säkerställer att varje DREADD-positiv cell kan spåras under fluorescens med hög trohet för att validera injektionerna.
Denna metod hjälper också till att överbrygga klyftan i neonatalforskning. Pediatrisk SCI presenterar sina utmaningar, och forskning som analyserar regenerering, spridning eller plasticitet bör betona skillnaderna mellan nyfödda och vuxna 3,15,16,17. Genom att optimera det kirurgiska ingreppet och utföra tidigare anatomiska studier med Nisselfärgning validerades koordinaterna för både kranial- och ryggradsinjektionerna. Syftet var att tillhandahålla en metod för dubbla injektioner i en neonatal råtta med ökad trohet och överlevnadsförmåga.
För den nuvarande modellen injicerades anterogradvektorn i cellkropparna i den somatomotoriska cortexen med bregma som referens18,19. När det gäller ryggradsinjektionerna injicerades den retrograda vektorn i laminae V-VII, där CST-axonterminalerna finns20,21. Det finns många grundläggande frågor bakom hur vissa lesionsmodeller påverkar yngre djur annorlunda, och hur den efterföljande återhämtningen avviker från ett äldre djur. Denna studie visar ett robust sätt att studera livmoderhalsskador och återhämtningsförmågan hos frambensfunktionen hos nyfödda gnagare. Däremot har majoriteten av tidigare studier behandlat återhämtningsrörelse efter ländryggs- eller bröstskador 5,22,23,24. Genom att para ihop den dubbelvirala vektorn med den nya injektionstekniken som beskrivs här hjälper detta protokoll till att mildra vissa problem (dvs. överlevnadsförmåga) som kan plåga neonatala gnagareundersökningar. Denna metod är robust, praktisk och mångsidig: små variationer i tekniken gör det möjligt att rikta in sig på olika vägar, dvs ventral CST, dorsal CST och de stigande dorsala vägarna.
För detta system injiceras ett lokalt verkande virus (t.ex. AAV2) i regionen av de neuronala cellkropparna av intresse. Ett andra retrogradt transporterat virus som styr uttrycket av det lokala viruset injiceras vid axonterminalerna för den neuronala befolkningen. Således är per definition endast kortikospinala neuroner märkta. RetroAAV-Cre-viruset valdes med en konstitutivt aktiv CMV-promotor eftersom skyttelplasmiden används för att generera flera AAV-serotyper för Cre-beroende uttryck i flera celltyper. För kortikala injektioner valdes AAV2 med transgenen som drivs av synapsin-1-promotorn för att begränsa något uttryck till neuroner. Eftersom 2-virussystemet förlitar sig mer på ursprunget och avslutningen av den neuronala populationen av intresse, kan flera olika promotorer användas, om de kan driva uttrycket av generna av intresse inom den neuronala populationen av intresse. Till exempel kan den excitatoriska neuronala promotorn, CamKII, ersättas med synapsin-1. Förutom användningen av dessa AAV-serotyper kan retrograd transport till omogna och i mycket mindre utsträckning kan vuxna kortikospinalmotorneuroner också uppnås med hjälp av det höga retrograda transportabla lentiviruset (HiRet)25. HiRet lentivirus använder ett chimärt rabies/VSV-glykoprotein för att rikta in sig på upptaget vid synapsen för retrograd transport. I kombination med en Tet-On-promotor stöder detta 2-virala system inducerbart uttryck på ett retrogradberoende sätt26,27.
Retrograda virus sätter in vektorer i det synaptiska rummet hos en målneuron, så att den kan tas upp av cellens axon och transporteras till cellkroppen. Medan lentivirala vektorer tidigare har haft enorm framgång och gett långsiktigt uttryck i genterapistudier, svängde denna metod mot adenoassocierade virusvektorer av några enkla skäl26,28: AAV är mer ekonomiskt, lika effektivt och presenterar mindre av en logistisk börda, med tanke på att den har en lägre biosäkerhetsnivåbeteckning29,30,31,32 . Medan AAV2, den mest använda serotypen, visar robust transfektion av CST-axoner, kan framtida forskare notera att AAV1 erbjuder viss mångsidighet eftersom den märker transynaptiskt och därmed lägger fram flera möjliga iterationer i framtida studier33. Den slutliga anpassningen är att koda retrogradviruset med Cre-rekombinas så att flera anterogradvektorer kan införas samtidigt, vilket minskar onödigt internt virusavfall och maximerar sannolikheten för att DREADDs uttrycker sig i rätt riktning.
I slutändan visar detta protokoll samtidig injektion i cortex och cervikal ryggrad, specifikt inriktad på cellkropparna respektive axonterminalerna i kortikospinalkanalen. High-fidelity transfection ses i hjärnbarken och ryggmärgen. Medan det beskrivna protokollet var perfekt för Sprague Dawley-råttor 5 dagar, är det lämpligt för postnatala dagar 4-10 med mindre justeringar av anestesi och stereotaktiska koordinater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla följande kirurgiska och djurvårdsprocedurer har godkänts av djurvårds- och användningskommittén vid Temple University. Protokollet som beskrivs är en överlevnadsoperation, och djuren avlivades så småningom genom intraperitoneal injektion av 100 mg/kg natriumpentobarbital när deras tidpunkter var klara.
1. Pre-kirurgisk förberedelse
- Förbered minst två dragna glasnålar för viral injektion med 3,5 nL glaskapillärpipetter; en nål för DREADD och en nål för rCre. Som en försiktighetsåtgärd, förbered 4-5 nålar om de går sönder intraoperativt.
- Skär av 1-2 mm överflödigt glas från nålen med hjälp av mikrosaxar.
- För varje nål, placera den vid 30 °, använd en mikropipettbeveller för att skapa en spets med en öppning på 30-40 μm och en 45 ° avfasad vinkel.
- Förvara nålarna i en täckt petriskål och sterilisera dem sedan genom att placera petriskålen i en biosäkerhetshuv under UV-ljus i 15 minuter.
- Förbered de nödvändiga virusen genom att ta bort en lämplig volym från frysen -80 °C före proceduren, med tanke på att varje djur kommer att kräva 3 μl av varje virus.
OBS: Transportera och förvara viruset på is när det inte används. Detta protokoll utvecklades med AAV2-hM3Dq-mCherry och AAV2-retroCre för att injicera 3 μL av varje virus per djur. DREADD-plasmiden, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (se materialtabellen), användes för att göra anterograd AAV2 med en viral titer på 1,54 × 1012 genomkopior (GC) / ml. Cre-plasmiden, pAAV-CMV-scCre, användes för att göra den retrograda AAV2 med en viral titer på 4,27 × 1012 GC / ml. - Anslut injektorn till mikropumpen och placera den i en mikromanipulator med en Vernier-skala.
- För att visuellt bekräfta närvaron eller frånvaron av virus i nålen, ladda färgämne, dvs röd olja, i nålen. Undvik bubblor i nålen.
- Sätt in glasnålen i injektorn och se till att nålen sitter korrekt.
- Om tillgängligt, upprepa hela processen med en separat injektionspump för varje virus. Om det bara finns en tillgänglig injektionspump, förbered två separata nålar och byt ut den använda nålen när det är dags att byta virus.
2. Anestesi och förberedelse av operationsplatsen
- Väg djuret på en digital skala. Registrera den preoperativa vikten för att bestämma volymen av bedövningsmedel som krävs.
OBS: Detta protokoll fann att den mest tillförlitliga bedövningstekniken för att säkerställa ett tillfredsställande bedövningsplan under hela den operativa tiden är en kombination av ketamin och hypotermi. Ketamin är otillräckligt för att säkerställa anestesi på egen hand, och att komplettera det med xylazin har en smal tröskel innan den ökar intraoperativ dödlighet. Hypotermi i sig är inte tillräckligt för långvariga operationer (dubbel ryggrads- och hjärnkirurgi kräver sannolikt >1 h stadig anestesi). - Bedöva ungen genom att injicera utspädd ketamin (10 mg/ml) subkutant mellan skulderbladen så att djuret får en dos på 100 mg/kg ketamin. vänta i 5 min.
OBS: Till exempel, vid postnatal dag 5, väger en råtta valp 10 g och får 0,1 ml av den utspädda ketaminlösningen (10 mg / ml). - Placera valpen på krossad is i 6-8 min. Skydda den mot frostskador genom att placera djuret i en latexhandske eller parafilm för att undvika direktkontakt med is.
- Nyp fast foten med pincett för att bekräfta ett lämpligt bedövningsplan. Om reflexivt tillbakadragande inträffar, låt stå i ytterligare 2 minuter på is innan du fortsätter.
- Applicera i stort sett antiseptisk på djurets huvud och ryggområde med steril gasbindning som blötläggs med en 5% jodlösning. Sterilisera sedan med gasväv blöt i 70% etanol. Applicera de antiseptiska våtservetterna tre gånger vardera, alternerande mellan jod och etanol för att suga gasbindningen.
OBS: Det finns inget behov av ögonvård eftersom unga valpar bara öppnar ögonen vid 14 års ålder. - Om ett djur ska få dubbelkirurgi (hjärna + ryggrad), ge en normal saltlösning bolus före operationen (0,02 ml / g) subkutant mellan axelbladen.
OBS: om djuret blir lyhört under operationen och ytterligare anestesi krävs, byt sedan ut djuret på is i 5 min.
3. Kirurgiskt fält och instrumentberedning
- Autoklavera de kirurgiska verktygen som inkluderar en skalpellhållare, rongeurs, hemostater, medelpunktskrökta pincett och retraktorer
- Förbered mikroskopet och installera stereotaxadaptern för nyfödda råttor för att placera den ordentligt i den vuxna stereotaxiska hållaren.
- Utför operationen med steriliserade handskar. Öppna ett paket med färdigförpackade sterila kirurgiska handskar och placera den sterila handskförpackningen på bordet, använd omslaget som ett extra område för att placera använda verktyg.
OBS: Det är viktigt att följa god kirurgisk praxis och upprätthålla sterilitet under hela proceduren. - Säkra ett 11- blad i skalpellhållaren. Placera steril saltlösning, 4,0 krom katgutsutur, 4,0 silkessutur och material för att kontrollera blödning, t.ex. steril gasväv, sterila bomullsspetsapplikatorer och trianglar.
- Ställ in två kirurgiska fält enligt beskrivningen ovan, med en plats tilldelad för kraniotomi och den andra platsen tilldelad för cervikal laminektomi.
- Hämta djuret och säkra det i den stereotaxiska adaptern: eftersom nyfödda är mycket broskiga, fixa dem försiktigt genom att rikta öronstängerna brett mot de mandibulära lederna. När det är horisontellt stabiliserat, introducera försiktigt det främre munstycket.
OBS: En icke-bindande regel som används för att ge ett "platt" kirurgiskt område är att fixera öronstängerna i samma höjd och munstycket på cirka 2-3 nivåer lägre.
4. Utföra kraniotomi och exponera den somatomotoriska cortexen
- Identifiera det område där snittet kommer att göras genom att trycka på pincetten i mittlinjen på toppen av hårbotten och känna för sagittal sutur. Gör ett snitt på 1 cm längs sagittal suturplan, som börjar omedelbart ovanför ögonlinjen. Håll huden spänd för att säkerställa ett rent, rakt och exakt snitt.
- Identifiera bregma (konvergensen av koronala och sagittala suturer) genom att försiktigt undersöka tången längs skallens yta och ägna stor uppmärksamhet åt suturlinjerna samt eventuell indragning orsakad av pincetten som löper längs parietal- och frontbenen.
- Behåll öppningen med applicering av viktade krokar på sidan av intresse. Observera att ryggradsinjektionen är gjord på höger sida, kranialinjektionen är på vänster sida.
- Rensa aponeurosen med en kombination av bomullsspetsarna och mikrosaxen för att maximera exponeringen av bregma för ökad noggrannhet. Se till att koronasuturen är i fri sikt tillräckligt långt i sidled för att ge en grov mall för efterföljande injektioner.
- Skär med hjälp av mikrosaxen ut ungefär en 3 x 2 mm sektion av det vänstra främre skallbenet omedelbart intill bregma.
OBS: När benfliken har tagits bort försiktigt bör det finnas ett tydligt fönster med exponerat hjärnmaterial redo för injektion. De återstående suturlinjerna på den kontralaterala sidan av hjärnan kommer att fungera som en visuell guide för att upprätthålla noggrannhet längs den främre-bakre (AP) axeln. - Rensa upp skräp, cerebrospinalvätska (CSF) och blod med bomullsspetsar.
OBS: Det är normalt att blod eller CSF döljer den visuella linjen något, så det är lämpligt att rensa området med bomullsspetsar regelbundet.
Figur 3: En schematisk illustration av kranialinjektionskoordinaterna (mm) i förhållande till bregma. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Ladda viruset och placera injektorn
- Ladda viruset i injektorn genom att pipettera ~ 5 μL på en bit parafilm och placera nålen så att spetsen vilar ovanpå virusdroppen.
- Se till att extra virus laddas i injektorn för att säkerställa smidig injektion. När du till exempel injicerar totalt 3 μl (1 μl för varje injektionsställe), dra upp 4 μl av viruset med en hastighet av 250 nL/s med hjälp av mikropumpen.
- Ta bort överskottet av virus med en laboratorieservett.
- Placera mikromanipulatorn så att Vernier-skalan är synlig och placera nålen ovanför sagittal suturen.
- Sänk nålen till strax ovanför området som representerar bregma (figur 3) och anteckna koordinaterna för AP och medial-lateral (ML).
- Med tanke på att injektionerna kommer att vara på vänster sida, generera målkoordinater genom att subtrahera 1, 1,5 och 2,0 mm (ML: -1,0, -1,5, -2,0) från ML-koordinaterna för bregma.
OBS: AP-positionen kommer att vara +0,5 mm från bregma för alla tre injektionerna. - Flytta nålen på plats för den första injektionen. AP: +0,5, ML: -1,0
- Sänk nålen till den exponerade hjärnan tills den drar in den yttre cortexen. Notera nålens höjd och för nålen ner på plats genom att subtrahera 0,6 mm från höjden på hjärnans yta. Injektionsdjup: kortikal yta -0,6 mm.
OBS: Det är viktigt att notera djupet på ytan för varje injektion eftersom små störningar i råttans positionering kan uppstå.
6. Injicera virus i den somatomotoriska cortexen
- När nålen är på plats, programmera injektorn att injicera 1 μl med en hastighet av 250 nL/min.
- När injektionen är klar, låt nålen vila i cortex i 3 min.
- Upprepa injektionerna för de andra koordinaterna: totalt 3 injektioner längs cortex i förhållande till bregma, alla på ett djup av -0,6 mm: 1) AP: +0,5 mm, ML: -1,0 mm 2) AP: +0,5 mm, ML: -1,5 mm 3) AP: +0,5 mm, ML: -2,0 mm.
- Efter avslutad injektion, se avsnitt 9 till suturen och överför djuret till det andra operationsbordet för cervikal laminektomi.
7. Skapa ett ryggradsfönster för exakta ryggmärgsinjektioner
- Identifiera snittstället genom att använda fingrarna för att palpera basen av skallen. Vid mittlinjen börjar du snittet 1-2 mm bakåt till skallbasen med ett #11-blad och förlänger snittet 1 cm bakåt för att exponera den ytliga muskeln. Håll huden spänd genom att applicera spänning med tummen och pekfingret för att säkerställa ett rent snitt.
- Använd bladets skarpa punkt, gör försiktigt en serie snitt längs mittlinjen i den ytliga muskeln för att exponera ryggradshålan och djupa ryggradsmuskler. Använd ett par pincett för att sprida upp muskeln och visualisera det kirurgiska fönstret.
OBS: Den ytliga muskeln kommer att se ljusrosa ut, medan de djupa ryggmusklerna kommer att se ljust vitgrå ut. - När de djupa ryggmusklerna har exponerats, sätt in retraktorer i operationsfönstret. Använd vid behov pincett för att ta tag i sidohuden och musklerna för att sträcka dem runt tänderna på retraktorerna. Dra tillbaka operationsfönstret till 7-8 mm i bredd, vilket möjliggör en fri utsikt över ryggraden.
- Identifiera den andra cervikala (C2 eller axel) kotan genom dess framträdande spinösa process som projicerar dorsalt och inkapsling i en stor kupolformad muskel. Använd pincett eller en trubbig sond för att känna efter och identifiera denna process, eftersom detta kommer att vara det vägledande landmärket.
OBS: Den intilliggande C3-kotan är ofta något ockluderad av den stora C2-muskeln; Därför hjälper mild dissektion av muskler vid C3 med pincett eller en benskrapa att definiera ryggkotan och hjälpa till vid ryggradsräkning. - Använd den plana kanten på en benskrapa, exponera C3-C7-ryggkotorna genom att försiktigt skrapa bort den djupa ryggmärgsmuskeln åt sidorna. Börja medialt och skrapa i sidled längs riktningen parallellt med vertebrala laminae för att säkerställa korrekt exponering, vilket möjliggör tydlig skillnad mellan vertebrala laminae. Kontrollera eventuell blödning med bomullsspetsar.
- Skär försiktigt sidokanterna på brosken vid C6 och C7 med hjälp av en mikrosax. Använd C2 som vägledning när du räknar ryggradsnivåer.
- Använd ett par fina pincett, ta försiktigt bort den dissekerade delen av lamina för att exponera ryggmärgen. Se till att ryggradsfönstret är tillräckligt stort för att rymma önskat injektionsställe. Ta bort alla vassa eller taggiga delar av benet som kan punktera ryggmärgen med mikrosax och pincett enligt beskrivningen ovan.
- Ställ in djuret i stereotaxisk kranialhållare enligt beskrivningen i avsnitt 3.6. Placera dessutom en upprullad bit gasväv under djurets bagageutrymme för att höja bakkvartsparter.
OBS: Höjning av djurets bakkvartsparter lyfter effektivt bröstkorgen från hållarens yta för att förhindra att andningsrörelser påverkar nålens position under injektionen. - Innan du börjar injektioner, rensa ryggradsfönstret från blod eller cerebrospinalvätska genom att försiktigt applicera bomullsspetsar och Sugi-trianglar på området utan att förolämpa ryggmärgen. Skapa vidare en barriär runt fönstrets omkrets för att förhindra ocklusion av injektionsstället genom kontinuerlig blödning eller CSF-läckage. För att göra detta, placera en liten bit absorberbar bomull i sidodelarna av ryggradsfönstret.
8. Direkta injektioner i ryggmärgen riktade mot axonterminaler
- Använd spetsen på glasinjektionsnålen, approximera ryggmärgens mittlinje genom att identifiera ryggradsartären. Men om ryggradsartären är märkbart utanför centrum eller avviker på något sätt, approximera mittlinjen genom att använda positionen för C2-spinous process och extrapolera detta längs ryggraden.
OBS: Se avsnitt 5.1 för instruktioner om hur du laddar viruset. - När nålen har identifierats, placera nålen strax bakom C5-lamina vid den ungefärliga mittlinjen och använd den som referenspunkt. Flytta sedan nålen i sidled åt höger med 0,3 mm med hjälp av mikromanipulatorn. Sänk nålen tills den bara vidrör ryggmärgens yta; Från detta djup, kasta nålen 0,6 mm i ryggmärgen. Om det behövs, fortsätt att kasta nålen tills den punkterar ryggmärgen; Dra sedan tillbaka eller sänk nålen till lämpligt djup.
- Injicera 1 μL retroAAV2-scCre vid 250 nL/min. När injektionen är klar, vänta 2 minuter tills viruset diffunderar in i ryggmärgen innan du långsamt drar tillbaka nålen. Upprepa injektionerna med samma laterala och djupa koordinater på ytterligare två platser i ryggradsfönstret, en vid mittpunkten och den sista bara främre till T1-lamina.
9. Sårförslutning och postoperativ vård
- Ta bort djuret från stereotaxhållaren och ta ut retraktorerna eller krokarna. Rensa ut sårområdet med några droppar steril normal saltlösning.
- Suturera hårbotten med 4,0 silkesutur, totalt två eller 3 suturer.
- Vid suturering av livmoderhalsöppningen, använd 4,0 krom tarm för att tätt fästa muskelskikten (2 suturer ska räcka). Suturera livmoderhalshudöppningen med 4,0 siden (4 suturer förväntas).
- När djuret är stängt, applicera klokt flytande bandage över suturerna.
- Placera djuret under en värmelampa och övervaka det noggrant tills det är helt uppvaknat. När djuret är vaken, rör sig och torkar, rengör såren försiktigt med steril gasbindning. Lämna inte djuret obevakat förrän det har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
- Återlämna djuret till homecage med sin mamma. Var noga med att förhindra försummelse och spädbarnskannibalisering från moderen mot valparna:
- Bekanta utredarna med mamman i väntan på operation genom skonsam hantering (5-10 min) två gånger dagligen, med början en vecka före operationen.
- Återför valparna till homecage tillsammans för att begränsa störningar för mamman.
- Injicera modern med acepromazin 1,5 mg/kg q12 h subkutant på operationsdagen.
OBS: Smärtlindring tjänar det dubbla syftet att ge analgesi för valparna och uppmuntra tidigare återgång till aktivitet, vilket främjar återintegrering med mamman. - Injicera buprenorfin 0,05 mg/kg subkutant q8 h med start efter operation i totalt 3 dagar (postoperativa dagar 0, 1, 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgångsrik injektion och transport av virusvektorn bör resultera i transduktion av ensidiga neuroner i ryggmärgen och motorcortexen. Figur 4 visar märkningen av lager V CST-neuroner i motorcortexen i en hjärnkoronal sektion som uttrycker Cre-dependent-DREADDs-mCherry injicerad tillsammans med en kontralateral ryggradsinjektion av rCre. Sektionerna färgades med dsRed antikropp.
Figur 1: En illustration som visar de tvåvirala injektionsmetoderna som används i detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Illustration av de virala konstruktionerna som används i detta protokoll, tillsammans med den dubbelfloxade inverterade orienteringen som korrigeras av retroAAV2-scCRE. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Transduktion av neuroner i motorcortexen. (A) Förstoring av 5x. dsRöd immunohistokemi som visar mCherry-uttryck i lager V-neuroner i djurets vänstra motorcortex. Skalstång = 500 μm.(B) Förstoring av 10x. dsRöd immunohistokemi som visar mCherry-uttryck i lager V-neuroner i djurets vänstra motorcortex. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inducerbar genetisk modulering av hjärnaktivitet med injicerbara kemogenetiska modifierare är ett kraftfullt verktyg för att studera de olika mekanismerna som ligger till grund för återhämtningen från SCI. Noggrannheten i inriktningen för de inducerbara G-proteinkopplade receptorerna (DREADDs) ökar ytterligare när man överväger att fluorescensspårning validerar den anatomiska precisionen i histologi. Denna uppsats diskuterar en tillförlitlig metod för att utforska huruvida hämmande eller stimulerande utvalda neuronala vägar (med antingen excitatoriska eller hämmande DREADDS) resulterar i förbättrad axonregenerering eller spridning34,35. Injektion av en retrograd transportabel vektor i ryggmärgen kan uppmärksamma utvalda neuronala populationer, antingen direkt eller via deras synaptiska anslutning, vilket gör denna metod till ett utmärkt val för att bedöma det neurobiologiska svaret på skada.
Som illustrerat, att studera SCI i neonatala modeller för att belysa eventuella tidigare okända skillnader mellan pediatriska populationer och vuxna populationer tjänar bara till att komplicera forskningen ytterligare. Som sådan är studiedesignerna smalare. Konsensus inom neonatal forskning är att de förbättrade resultaten som ses efter SCI beror på ökad axonal regenerering och ökad spridning fram till omkring postnatal dag 7 hos gnagare 3,4,5,36. Denna förstärkta plasticitet ses dock inte bortom postnatal dag 10 och återhämtningsplatåer förrän den representerar vuxna gnagarskademodeller för37,38,40. De underliggande mekanismerna för ökad plasticitet hos nyfödda är svårfångade och förblir debatterade, vilket belyser vikten av att utveckla lätt replikerade, överlevande och effektiva kirurgiska modeller för att underlätta fokuserad forskning om neonatal SCI.
Till exempel har vissa hävdat att den oproportionerliga spridningsnivån som ses hos yngre djur förnekar vissa aspekter av funktionell återhämtning från CST-förolämpning19. I slutändan kvarstår frågor om den spontana återhämtningen beror på organisk regenerering eller helt enkelt ökad spridning av avvikande vägar som bekvämt kringgår lesionen. Det beskrivna protokollet är en relativt enkel och modulär teknik som kan användas för att studera kortikospinalkanalregenerering eller spridning genom artificiell hämning eller stimulering av återhämtningsprocesser med tillkomsten av inducerbara vektorer.
De virus som användes i denna studie valdes för att ge en ritning för framtida forskning som undersöker rimligheten i att påverka återhämtningen från SCI hos yngre gnagare. Genom design skulle transgenen som uttrycker mCherry endast märka positivt under fluorescens om DREADD (hM3Dq) uttryckte samtidigt, eftersom de båda är närvarande på samma transgen. Även om det nuvarande protokollet inte innehåller beteendemässiga och fenotypiska bedömningar, har det lagt grunden för att framgångsrikt undersöka DREADD-aktivitet i framtida studier.
De mest kritiska elementen för framgångsrika injektioner av virala vektorer är att känna till rätt anatomi och säkerställa tillräcklig diffusion av virus. När det gäller att injicera anterogradvektorn i den sensorimotoriska cortexen finns det många metoder som beskrivs i litteraturen, inklusive tre injektioner i närheten av bregma på ett grunt djup (0,5-0,7 mm). Att rikta in sig på rätt område för retrograd injektion av en vektor i ryggmärgen kräver precision och en skicklig förståelse för neurobiologin hos neuronerna av intresse. Majoriteten av CST-terminalerna är lokaliserade till laminae V-VII i hela ryggmärgsgrå substansen, och framgångsrik transfektion kan kräva injektioner vid flera livmoderhalsnivåer41. Till exempel kan segment C4-C7 lokaliseras med distinkta landmärken, vilket grundar det kirurgiska fönstret för rutinmässiga laminektomier och efterföljande injektioner. Att säkerställa adekvat diffusion av det injicerade materialet är beroende av vektorns egenskaper, injektionsvolymen och densiteten hos neuronvävnaden.
Lyckligtvis är neonatalhjärnan mycket mottaglig för transfektion eftersom den lägre densiteten möjliggör en snabbare och spridd spridning av det injicerade materialet. Ryggmärgskomponenten är mer komplex, med ett betydligt tätare injektionsfönster. Ändå är retroAAV effektivt för att transducera målsynapserna. Det är viktigt att notera att den retrograda vektorn tar tid att nå cellkroppen och vända DREADD-vektorn i rätt sekvens, så den rekommenderade tiden innan beteendebedömningar eller histologiska studier utförs är ± 4 veckor från injektionsdatumet. Sammanfattningsvis är den retrograda AAV lämplig, med tanke på att den har flera omedelbara fördelar, och med tanke på att det dubbelfloxade systemet endast fluorescerande uttrycker målneuronala populationer. Trots det smala operativa fönstret är neonatal ryggmärg på samma sätt mottaglig för transfektion och visar floriduttryck42.
Barn- och ryggmärgsforskning är en nisch inom ett område som har många hinder för flerskiktade undersökningar. Med varje ny iteration och kirurgiskt genombrott i metodiken blir själva forskningen enklare, och i sin tur ökar sannolikheten för att avslöja deterministiska resultat. Att noggrant injicera en viral vektor i en ryggmärgsväg är användbart av en mängd undersökningsskäl, och att utöka virusvektortekniken till att omfatta DREADDs är användbart för att selektivt förbättra eller dämpa målproteiner. Förhoppningen är att den förbättrade noggrannheten från det dubbelfloxade injektionssystemet i kombination med det nya kirurgiska protokollet kommer att främja en mängd liknande forskningsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av ett stipendiebidrag från Shriners sjukhus för barn SHC-84706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blades | Roboz | RS-9801-11 | For use with the scalpel. |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic SC injection and fluid bolus |
| 4.0 silk suture | Ethicon | 771-683G | For skin closure |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation |
| Ketamine (Ketaset) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | To hold the neonatal sterotaxic holder in place |
| Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor | 51615 | For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections | |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre plasmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361) | Bryan Roth’s lab through Addgene | DREADD plasmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
| Liquid bandage | NewSkin | 985838 | To apply along sutures following surgery and encourage wound healing |
| Wire Cage Lamp | ZooMed | LF10EC | To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally |
References
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000. Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).
- Bregman, B. S., Goldberger, M. E. Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats. Science. 217 (4559), 553-555 (1982).
- Castro, A. J. Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats. Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).
- Commissiong, J. W., Toffano, G. Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines. Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).
- Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats. Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).
- Kim, J., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo. The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Atasoy, D., Sternson, S. M. Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology. Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Reiner, A., et al. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Oguchi, M., et al. Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain. PloS One. 10 (7), 0132825 (2015).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat. The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).
- Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats. Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).
- Tillakaratne, N. J. K., et al. Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site. Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).
- Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats. Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).
- Gennaro, M., et al. Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system. Frontiers in Neural Circuits. 11, 47 (2017).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Paxinos, G. 2, Academic Press. New York. 294-309 (1985).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Takeoka, A., Arber, S. Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury. Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).
- Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury. Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).
- Ohne, H., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation. IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Sheikh, I. S., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487, 235-238 (2012).
- Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160 (2019).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yáñez-Muñoz, R. J., Moon, L. D. F. Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. Plos One. 9 (2), 87447 (2014).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).
- Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry. The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Hasegawa, A., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults. Behavioural Neurology. 2016, 1035473 (2016).
- Alstermark, B., Isa, T. Circuits for skilled reaching and grasping. Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).
- García-Alías, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries. Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion. Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).
- Ueno, M., et al. Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons. Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).
- Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
