Summary
Este protocolo demuestra un método novedoso para aplicar terapias génicas a subpoblaciones de células en ratas neonatas a edades postnatales de 5 a 10 días mediante la inyección de un modificador quimiogenético anterógrado en la corteza somatomotora y una recombinasa Cre retrógradamente transportable en la médula espinal cervical.
Abstract
Abordar con éxito los obstáculos que limitan la investigación en ratas neonatales es importante para estudiar las diferencias en los resultados observados en las lesiones pediátricas de la médula espinal (LME) en comparación con las LME adultas. Además, la introducción confiable de terapias en las células diana del sistema nervioso central (SNC) puede ser un desafío, y las imprecisiones pueden comprometer la eficacia del estudio o la terapia. Este protocolo combina la tecnología de vectores virales con una novedosa técnica quirúrgica para introducir con precisión terapias génicas en ratas neonatas en el día postnatal 5. Aquí, un virus diseñado para el transporte retrógrado (retroAAV2) de Cre se introduce en los terminales axónicos de las neuronas corticoespinales en la médula espinal, donde posteriormente se transporta a los cuerpos celulares. Luego se inyecta un receptor de diseño de orientación invertida (DIO) de doble floxed activado exclusivamente por el virus DREADD (DREADD) en la corteza somatomotora del cerebro. Esta técnica de doble infección promueve la expresión de los DREADDs solo en las neuronas coinfectadas del tracto corticoespinal (CST). Por lo tanto, la coinyección simultánea de la corteza somatomotora y los terminales CST cervicales es un método válido para estudiar la modulación quimiogenética de la recuperación siguiendo modelos de LME cervical en ratas neonatales.
Introduction
Si bien la LME es una ocurrencia relativamente rara en la población pediátrica, es particularmente traumática y causa una discapacidad permanente que requiere una inmensa previsión logística. Además, una mayor proporción de LME pediátricas se clasifica como cervical y completa en comparación con la población adulta 1,2. Un sello distintivo entre las especies de mamíferos es que los recién nacidos se recuperan notablemente mejor de la LME que los adultos, y esto ofrece una oportunidad para evaluar los mecanismos impulsores de la recuperación en poblaciones más jóvenes 3,4,5. A pesar de esto, hay menos estudios multimodales que aborden la investigación de roedores neonatos y lactantes, en parte debido a la dificultad adicional de dirigirse con precisión a poblaciones seleccionadas de neuronas en los puntos de referencia anatómicos mucho más estrechos de animales más jóvenes6. Este artículo se centra en la inyección directa de vectores adenoasociados anterógrados y retrógrados altamente eficientes en la médula espinal de rata para modular las principales vías motoras con la aplicación de Cre-dependiente-DREADDs, ampliando el alcance de los estudios de regeneración multimodal.
Los vectores virales son herramientas biológicas importantes con una amplia gama de aplicaciones, incluida la introducción de material genético para sustituir genes diana, regular al alza las proteínas de crecimiento y trazar el paisaje anatómico del SNC 7,8,9. Muchos de los detalles anatómicos de las vías motoras espinales se han estudiado utilizando trazadores clásicos, es decir, amina dextrano biotinilada. Si bien los trazadores tradicionales han sido fundamentales para desenterrar la neuroanatomía, no están exentos de desventajas: etiquetan indiscriminadamente las vías incluso si se inyectan correctamente, y los estudios han encontrado que son absorbidos por axones dañados10,11,12. En consecuencia, esto podría llevar a interpretaciones incorrectas en estudios de regeneración donde los axones cortados podrían confundirse con fibras regeneradoras.
El siguiente método utiliza el sistema de vectores bivirales recientemente popularizado en estudios de modulación, con dos vectores virales diferentes en dos áreas separadas de la misma neurona13,14. El primero es un vector que infecta localmente los cuerpos celulares de las neuronas de proyección. El otro es un vector retrógrado que se transporta desde los terminales axónicos de las neuronas de proyección (Figura 1). El vector retrógrado lleva Cre recombinasa, y el vector local incorpora la secuencia de doble floxed "Cre-On" en la que se codifica una proteína fluorescente (mCherry). El transgén nativo que expresa tanto hM3Dq como mCherry está invertido en relación con el promotor y está flanqueado por dos sitios LoxP (Figura 2). Por lo tanto, mCherry solo se expresa en las neuronas de proyección doblemente transducidas donde Cre recombinase induce un evento de recombinación entre los sitios LoxP, volteando la orientación del transgén en el marco de lectura apropiado y permitiendo la expresión tanto del DREADD como de la proteína fluorescente. Una vez que el transgén viral está en la orientación correcta, y cuando corresponda, los DREADDs pueden inducir transitoriamente la neuromodulación a través de un ligando inyectado por separado, es decir, clozapina-N-óxido. El protocolo fue diseñado para autenticar la investigación de neuromodulación inducible en neonatos, en la que se inyectan DREADDS para modular los CST selectivamente. El sistema de dos virus actúa como una póliza de seguro, asegurando que cada célula DREADD positiva sea trazable bajo fluorescencia con alta fidelidad para validar las inyecciones.
Este método también ayuda a cerrar la brecha en la investigación neonatal. La LME pediátrica presenta sus desafíos, y la investigación que analiza la regeneración, la germinación o la plasticidad debe enfatizar las diferencias entre neonatos y adultos 3,15,16,17. Al optimizar el procedimiento quirúrgico y realizar estudios anatómicos previos con tinción de Nissl, se validaron las coordenadas para las inyecciones craneales y espinales. El objetivo era proporcionar un método para inyecciones duales en una rata neonatal con mayor fidelidad y capacidad de supervivencia.
Para el modelo actual, el vector anterógrado se inyectó en los cuerpos celulares de la corteza somatomotora utilizando bregma como referencia18,19. En cuanto a las inyecciones espinales, el vector retrógrado fue inyectado en láminas V-VII, donde residen los terminales axónicos CST20,21. Hay muchas preguntas fundamentales que subyacen a cómo ciertos modelos de lesiones afectan a los animales más jóvenes de manera diferente, y cómo la recuperación posterior diverge de un animal más viejo. Este estudio demuestra un medio robusto para estudiar las lesiones cervicales y la recuperabilidad de la función de las extremidades anteriores en roedores neonatales. En contraste, la mayoría de los estudios previos han abordado la locomoción de recuperación después de lesiones lumbares o torácicas 5,22,23,24. Al emparejar el vector doble viral con la nueva técnica de inyección descrita aquí, este protocolo ayuda a mitigar ciertos problemas (es decir, la capacidad de supervivencia) que pueden afectar las investigaciones de roedores neonatales. Este método es robusto, práctico y versátil: ligeras variaciones en la técnica permitirán dirigirse a diferentes vías, es decir, CST ventral, CST dorsal y las vías dorsales ascendentes.
Para este sistema, se inyecta un virus de acción local (por ejemplo, AAV2) en la región de los cuerpos celulares neuronales de interés. Un segundo virus transportado retrógradamente que controla la expresión del virus local se inyecta en los terminales axónicos para esa población neuronal. Por lo tanto, por definición, solo se etiquetan las neuronas corticoespinales. El virus retroAAV-Cre se eligió con un promotor CMV constitutivamente activo, ya que el plásmido lanzadera se utiliza para generar varios serotipos AAV para la expresión dependiente de Cre en varios tipos de células. Para las inyecciones corticales, se eligió AAV2 con el transgén impulsado por el promotor sinapsina-1 para limitar cualquier expresión a las neuronas. Debido a que el sistema 2-viral depende más del origen y la terminación de la población neuronal de interés, se podrían usar varios promotores diferentes, si pueden impulsar la expresión de los genes de interés dentro de la población neuronal de interés. Por ejemplo, el promotor neuronal excitatorio, CamKII, podría ser sustituido por la sinapsina-1. Además del uso de estos serotipos AAV, el transporte retrógrado en neuronas motoras corticoespinales adultas inmaduras y, en mucho menor medida, también se puede lograr utilizando el lentivirus transportable retrógrado (HiRet)25. Los lentivirus HiRet utilizan una glicoproteína quimérica de la rabia / VSV para apuntar a la absorción en la sinapsis para el transporte retrógrado. Combinado con un promotor Tet-On, este sistema 2-viral apoya la expresión inducible de una manera retrógrada dependiente26,27.
Los virus retrógrados insertan vectores en el espacio sináptico de una neurona objetivo, lo que permite que sea absorbida por el axón de esa célula y transportada al cuerpo celular. Si bien los vectores lentivirales han tenido un éxito tremendo anteriormente, proporcionando expresión a largo plazo en estudios de terapia génica, este método giró hacia vectores virales adenoasociados por algunas razones simples26,28: AAV es más económico, igualmente efectivo y presenta menos carga logística, dado que tiene una designación de nivel de bioseguridad más bajo 29,30,31,32 . Mientras que AAV2, el serotipo más utilizado, demuestra una transfección robusta de axones CST, futuros investigadores pueden notar que AAV1 ofrece cierta versatilidad ya que etiqueta transinápticamente, presentando así varias iteraciones posibles en estudios futuros33. La adaptación final es codificar el virus retrógrado con Cre-recombinasa para que se puedan introducir múltiples vectores anterógrados simultáneamente, reduciendo así el desperdicio innecesario de virus internos y maximizando la probabilidad de que los DREADDs se expresen en la orientación correcta.
En última instancia, este protocolo demuestra la inyección simultánea en la corteza y la columna cervical, dirigida específicamente a los cuerpos celulares y las terminales axónicas del tracto corticoespinal, respectivamente. La transfección de alta fidelidad se observa en la corteza cerebral y la médula espinal. Si bien el protocolo descrito se perfeccionó para ratas Sprague Dawley de 5 días de edad, es adecuado para los días postnatales 4-10 con ajustes menores a la anestesia y las coordenadas estereotácticas.
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Protocol
Todos los siguientes procedimientos quirúrgicos y de cuidado de animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Temple. El protocolo descrito es una cirugía de supervivencia, y los animales fueron finalmente sacrificados por inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al finalizar sus puntos temporales.
1. Preparación prequirúrgica
- Prepare al menos dos agujas de vidrio extraídas para la inyección viral con pipetas capilares de vidrio de 3,5 nL; una aguja para el DREADD y una aguja para el rCre. Como medida de precaución, prepare 4-5 agujas en caso de que se rompan intraoperatoriamente.
- Usando microtijeras, corte 1-2 mm de exceso de vidrio de la aguja.
- Para cada aguja, colóquela a 30°, use un biselado de micropipeta para crear una punta con una apertura de 30-40 μm y un ángulo biselado de 45°.
- Guarde las agujas en una placa de Petri cubierta y luego esterilícelas colocando la placa de Petri en una campana de bioseguridad bajo luz UV durante 15 minutos.
- Preparar los virus necesarios retirando un volumen adecuado del congelador a -80 °C antes del procedimiento, teniendo en cuenta que cada animal necesitará 3 μL de cada virus.
NOTA: Transporte y almacene el virus en hielo cuando no esté en uso. Este protocolo fue desarrollado usando AAV2-hM3Dq-mCherry y AAV2-retroCre para inyectar 3 μL de cada virus por animal. El plásmido DREADD, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (ver la Tabla de Materiales), se utilizó para hacer el AAV2 anterógrado con un título viral de 1,54 × 1012 copias del genoma (GC)/mL. El plásmido Cre, pAAV-CMV-scCre, se utilizó para hacer el AAV2 retrógrado con un título viral de 4,27 × 1012 GC/mL. - Enchufe el inyector en la microbomba y colóquelo en un micromanipulador con una báscula Vernier.
- Para ayudar a confirmar visualmente la presencia o ausencia de virus en la aguja, cargue un tinte de color, es decir, aceite rojo, en la aguja. Evite las burbujas en la aguja.
- Inserte la aguja de vidrio en el inyector, asegurándose de que la aguja se ajuste correctamente.
- Si está disponible, repita todo el proceso con una bomba de inyección separada para cada virus. Si solo hay una bomba de inyección disponible, prepare dos agujas separadas y reemplace la aguja usada cuando sea el momento de intercambiar los virus.
2. Anestesia y preparación del sitio quirúrgico
- Pesa al animal en una balanza digital. Registrar el peso preoperatorio para determinar el volumen de anestesia requerido.
NOTA: Este protocolo encontró que la técnica anestésica más confiable para asegurar un plano anestésico satisfactorio durante todo el tiempo operatorio es una combinación de ketamina e hipotermia. La ketamina es insuficiente para garantizar la anestesia por sí sola, y complementarla con xilazina tiene un umbral estrecho antes de aumentar la mortalidad intraoperatoria. La hipotermia por sí sola no es suficiente para cirugías prolongadas (la cirugía dual de columna y cerebro probablemente requiera >1 h de anestesia constante). - Anestesiar al cachorro inyectando ketamina diluida (10 mg/ml) por vía subcutánea entre los omóplatos para que el animal reciba una dosis de 100 mg/kg de ketamina; Espere 5 min.
NOTA: Por ejemplo, en el día postnatal 5, un cachorro de rata pesa 10 g y recibe 0,1 ml de la solución de ketamina diluida (10 mg / ml). - Coloque el cachorro sobre hielo picado durante 6-8 minutos. Protéjalo contra la congelación colocando al animal en un guante de látex o parafilm para evitar el contacto directo con el hielo.
- Pellizque el pie firmemente usando fórceps para confirmar un plano anestésico apropiado. Si se produce una abstinencia reflexiva, dejar actuar durante 2 minutos adicionales en hielo antes de continuar.
- Aplique ampliamente antiséptico en el área de la cabeza y la espalda del animal utilizando una gasa estéril empapada con una solución de yodo al 5%. Luego, esterilizar con una gasa empapada en etanol al 70%. Aplique las toallitas antisépticas tres veces cada una, alternando entre yodo y etanol para remojar la gasa.
NOTA: No hay necesidad de cuidado de los ojos ya que los cachorros jóvenes solo abren los ojos a los 14 días de edad. - Si un animal va a recibir cirugía dual (cerebro + columna vertebral), proporcione un bolo salino normal antes de la cirugía (0,02 ml / g) por vía subcutánea entre los omóplatos.
NOTA: si el animal responde durante la cirugía y se requiere anestesia adicional, reemplace el animal en hielo durante 5 minutos.
3. Campo quirúrgico y preparación de instrumentos
- Autoclave las herramientas quirúrgicas que incluyen un soporte de bisturí, rongeurs, hemostáticos, pinzas curvas de punto medio y retractores
- Prepare el microscopio e instale el adaptador estereotáxico neonatal para ratas para colocarlo firmemente dentro del soporte estereotáxico adulto.
- Realice la cirugía con guantes esterilizados. Abra un paquete de guantes quirúrgicos estériles preenvasados y coloque la envoltura de guante estéril sobre la mesa, utilizando la envoltura como un área adicional para colocar las herramientas usadas.
NOTA: Es importante seguir una buena práctica quirúrgica y mantener la esterilidad durante todo el procedimiento. - Asegure una hoja de 11 en el soporte del bisturí. Coloque solución salina estéril, sutura de catgut crómico 4.0, sutura de seda 4.0 y materiales para controlar el sangrado, por ejemplo, gasa estéril, aplicadores estériles con punta de algodón y triángulos.
- Establezca dos campos quirúrgicos como se describió anteriormente, con un sitio asignado para craneotomía y el otro sitio asignado para laminectomía cervical.
- Recupere al animal y asegúrelo en el adaptador estereotáxico: como los neonatos son muy cartilaginosos, fíjelos suavemente dirigiendo las barras auriculares ampliamente hacia las articulaciones mandibulares. Una vez estabilizado horizontalmente, introduzca suavemente la boquilla frontal.
NOTA: Una regla no vinculante utilizada para proporcionar un área quirúrgica "plana" es fijar las barras auriculares a la misma altura y la boquilla a aproximadamente 2-3 niveles más baja.
4. Realización de la craneotomía y exposición de la corteza somatomotora
- Identifique el área donde se realizará la incisión presionando los fórceps en la línea media en la parte superior del cuero cabelludo, sintiendo la sutura sagital. Haga una incisión de 1 cm a lo largo del plano de sutura sagital, comenzando inmediatamente por encima de la línea de los ojos. Mantenga la piel tensa para asegurar una incisión limpia, recta y precisa.
- Identifique bregma (la convergencia de las suturas coronal y sagital) sondeando suavemente los fórceps a lo largo de la superficie del cráneo y prestando mucha atención a las líneas de sutura, así como a cualquier hendidura causada por los fórceps que corren a lo largo de los huesos parietal y frontal.
- Mantener la abertura con la aplicación de ganchos contrapesados en el lado de interés. Tenga en cuenta que la inyección espinal se realiza en el lado derecho, la inyección craneal está en el lado izquierdo.
- Elimine la aponeurosis con una combinación de puntas de algodón y microtijeras para maximizar la exposición de bregma para una mayor precisión. Asegúrese de que la sutura coronal esté a la vista lo suficientemente lejos lateralmente para proporcionar una plantilla aproximada para inyecciones posteriores.
- Usando las microtijeras, corte aproximadamente una sección de 3 x 2 mm del hueso frontal izquierdo del cráneo inmediatamente adyacente al bregma.
NOTA: Una vez que el colgajo óseo se ha retirado cuidadosamente, debe haber una ventana clara con la materia cerebral expuesta lista para la inyección. Las líneas de sutura restantes en el lado contralateral del cerebro actuarán como una guía visual para mantener la precisión a lo largo del eje anterior-posterior (AP). - Limpie cualquier residuo, líquido cefalorraquídeo (LCR) y sangre con puntas de algodón.
NOTA: Es normal que la sangre o el LCR oscurezcan ligeramente la línea visual, por lo que es aconsejable limpiar el área con puntas de algodón regularmente.
Figura 3: Una ilustración esquemática de las coordenadas de inyección craneal (mm) relativas a bregma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Carga del virus y posicionamiento del inyector
- Cargue el virus en el inyector pipeteando ~ 5 μL en un trozo de parafilm y coloque la aguja de modo que la punta descanse sobre la gota del virus.
- Asegúrese de que el virus adicional se cargue en el inyector para garantizar una inyección sin problemas. Por ejemplo, al inyectar un total de 3 μL (1 μL para cada lugar de inyección), retire 4 μL del virus a una velocidad de 250 nL/s utilizando la microbomba.
- Elimine el exceso de virus con una toallita de laboratorio.
- Coloque el micromanipulador de modo que la escala Vernier sea visible y coloque la aguja por encima de la sutura sagital.
- Baje la aguja justo por encima del área que representa bregma (Figura 3) y anote las coordenadas AP y medial-lateral (ML).
- Dado que las inyecciones estarán en el lado izquierdo, genere coordenadas objetivo restando 1, 1.5 y 2.0 mm (ML: -1.0, -1.5, -2.0) de las coordenadas ML para bregma.
NOTA: La posición AP será de +0,5 mm de bregma para las tres inyecciones. - Mueva la aguja a su posición para la primera inyección. AP: +0.5, ML: -1.0
- Baje la aguja al cerebro expuesto hasta que esté sangrando la corteza externa. Anote la altura de la aguja y baje la aguja a su posición restando 0,6 mm de la altura de la superficie del cerebro. Profundidad de inyección: superficie cortical -0,6 mm.
NOTA: Es importante tener en cuenta la profundidad de la superficie para cada inyección, ya que pueden producirse ligeras interrupciones en el posicionamiento de la rata.
6. Inyectar virus en la corteza somatomotora
- Una vez que la aguja esté en su lugar, programe el inyector para inyectar 1 μL a una velocidad de 250 nL/min.
- Una vez completada la inyección, deje que la aguja descanse en la corteza durante 3 minutos.
- Repita las inyecciones para las otras coordenadas: un total de 3 inyecciones a lo largo de la corteza en relación con bregma, todas a una profundidad de -0.6 mm: 1) AP: +0.5 mm, ML: -1.0 mm 2) AP: +0.5 mm, ML: -1.5 mm 3) AP: +0.5 mm, ML: -2.0 mm.
- Una vez completadas las inyecciones, consultar la sección 9 para suturar y transferir al animal a la otra mesa de operaciones para la laminectomía cervical.
7. Creación de una ventana espinal para inyecciones precisas de la médula espinal
- Identifique el sitio de la incisión usando los dedos para palpar la base del cráneo. En la línea media, comience la incisión 1-2 mm posterior a la base del cráneo usando una cuchilla # 11 y extienda la incisión 1 cm posterior para exponer el músculo superficial. Mantenga la piel tensa aplicando tensión con el pulgar y el índice para asegurar una incisión limpia.
- Usando la punta afilada de la cuchilla, haga suavemente una serie de cortes a lo largo de la línea media del músculo superficial para exponer la cavidad espinal y los músculos espinales profundos. Use un par de fórceps para abrir el músculo y visualizar la ventana quirúrgica.
NOTA: El músculo superficial aparecerá de color rosa claro, mientras que los músculos espinales profundos aparecerán de un gris blanquecino claro. - Una vez que los músculos espinales profundos hayan sido expuestos, inserte retractores en la ventana quirúrgica. Si es necesario, use fórceps para agarrar la piel lateral y los músculos para estirarlos alrededor de los dientes de los retractores. Retraiga la ventana quirúrgica a 7-8 mm de ancho, lo que permite una vista sin obstáculos de la columna vertebral.
- Identificar la segunda vértebra cervical (C2 o eje) por su prominente proceso espinoso que se proyecta dorsalmente y encapsulación en un gran músculo en forma de cúpula. Use fórceps o una sonda contundente para sentir e identificar este proceso, ya que este será el punto de referencia guía.
NOTA: La vértebra C3 adyacente a menudo está ligeramente ocluida por el músculo C2 grande; por lo tanto, la disección suave del músculo en C3 con fórceps o un raspador óseo ayuda a definir la vértebra y ayuda en el conteo vertebral. - Usando el borde plano de un raspador de hueso, exponga las vértebras C3-C7 raspando suavemente el músculo espinal profundo hacia los lados. Comience medial y raspe lateralmente a lo largo de la dirección paralela a las láminas vertebrales para garantizar una exposición adecuada, lo que permitirá una clara distinción de las láminas vertebrales. Controle cualquier sangrado con puntas de algodón.
- Usando un par de microtijeras, corte cuidadosamente los bordes laterales de las láminas cartilaginosas en C6 y C7. Use C2 como guía al contar los niveles vertebrales.
- Con un par de pinzas finas, retire con cuidado la porción diseccionada de la lámina para exponer la médula espinal. Asegúrese de que la ventana espinal sea lo suficientemente grande como para acomodar el sitio de inyección deseado. Retire cualquier parte afilada o dentada del hueso que pueda perforar la médula espinal con microtijeras y fórceps como se describió anteriormente.
- Coloque al animal en el soporte craneal estereotáxico como se describe en la sección 3.6. Además, coloque un trozo de gasa enrollado debajo del tronco del animal para elevar sus cuartos traseros.
NOTA: La elevación de los cuartos traseros del animal levanta eficazmente el tórax de la superficie del soporte para evitar que los movimientos respiratorios afecten la posición de la aguja durante la inyección. - Antes de comenzar las inyecciones, limpie la ventana espinal de cualquier sangre o líquido cefalorraquídeo aplicando suavemente puntas de algodón y triángulos Sugi en el área sin insultar la médula espinal. Además, cree una barrera alrededor del perímetro de la ventana para evitar la oclusión del lugar de la inyección por sangrado continuo o fuga de LCR. Para hacer esto, coloque un pequeño trozo de algodón absorbible en las partes laterales de la ventana espinal.
8. Inyecciones directas en la médula espinal dirigidas a terminales axónicos
- Usando la punta de la aguja de inyección de vidrio, aproxime la línea media de la médula espinal identificando la arteria espinal. Sin embargo, si la arteria espinal está notablemente descentrada o se desvía de alguna manera, aproxime la línea media utilizando la posición del proceso espinoso C2 y extrapolando esto a lo largo de la columna vertebral.
NOTA: Consulte la sección 5.1 para obtener instrucciones sobre cómo cargar el virus. - Una vez identificada, sitúe la aguja justo detrás de la lámina C5 en la línea media aproximada y utilícela como punto de referencia. Luego, usando el micromanipulador, mueva la aguja lateralmente hacia la derecha en 0,3 mm. Baje la aguja hasta que solo toque la superficie de la médula espinal; Desde esta profundidad, sumerja la aguja 0,6 mm en la médula espinal. Si es necesario, continúe hundiendo la aguja hasta que perfore la médula espinal; Luego, retraiga o baje la aguja a la profundidad adecuada.
- Inyectar 1 μL de retroAAV2-scCre a 250 nL/min. Después de completar la inyección, espere 2 minutos para que el virus se difunda en la médula espinal antes de retirar lentamente la aguja. Repita las inyecciones utilizando las mismas coordenadas laterales y de profundidad en dos sitios más dentro de la ventana espinal, uno en el punto medio y el final justo antes de la lámina T1.
9. Cierre de heridas y cuidados postoperatorios
- Retire el animal del soporte estereotáxico y saque los retractores o ganchos. Limpie el área de la herida con unas gotas de solución salina normal estéril.
- Suturar el cuero cabelludo con sutura de seda 4.0, dos o 3 suturas en total.
- Al suturar la abertura cervical, use intestino crómico 4.0 para volver a unir firmemente las capas musculares (2 suturas deberían ser suficientes). Suturar la abertura de la piel cervical con seda 4.0 (se esperan 4 suturas).
- Una vez que el animal esté cerrado, aplique juiciosamente un vendaje líquido a través de las suturas.
- Coloque al animal bajo una lámpara de calefacción y monitoréelo de cerca hasta que se vuelva a despertar por completo. Una vez que el animal esté despierto, en movimiento y seco, limpie suavemente las heridas con una gasa estéril. No deje al animal desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
- Devuelva al animal a la jaula casera con su madre. Tenga cuidado de evitar la negligencia y la canibalización infantil de la madre hacia los cachorros:
- Familiarice a los investigadores con la madre en previsión de la cirugía mediante un manejo suave (5-10 min) dos veces al día, comenzando una semana antes de la cirugía.
- Devuelva a los cachorros a la jaula en casa juntos para limitar la interrupción de la madre.
- Inyectar a la madre con acepromazina 1,5 mg/kg cada 12 h por vía subcutánea el día de la cirugía.
NOTA: El manejo del dolor tiene el doble propósito de proporcionar analgesia para los cachorros y fomentar el regreso temprano a la actividad, promoviendo así la reintegración con la madre. - Inyectar buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea cada 8 h a partir de la cirugía durante 3 días en total (días postoperatorios 0, 1, 2).
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Representative Results
La inyección y el transporte exitosos del vector viral deben resultar en la transducción de neuronas unilaterales en la médula espinal y la corteza motora. La Figura 4 demuestra el etiquetado de las neuronas CST de capa V en la corteza motora de una sección coronal cerebral que expresa Cre-dependiente-DREADDs-mCherry co-inyectado con una inyección contralateral de rCre en la columna vertebral. Las secciones fueron teñidas con el anticuerpo dsRed.
Figura 1: Una ilustración que demuestra los métodos de inyección de dos virus utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración de las construcciones virales utilizadas en este protocolo, junto con la orientación invertida de doble floxed corregida por el retroAAV2-scCRE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Transducción de neuronas en la corteza motora. (A) Aumento de la inmunohistoquímica 5x. dsRed que demuestra la expresión de mCherry en las neuronas de la capa V de la corteza motora izquierda del animal. Barra de escala = 500 μm.(B) Aumento de 10x. dsRed inmunohistoquímica que demuestra la expresión de mCherry en neuronas de capa V de la corteza motora izquierda del animal. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La modulación genética inducible de la actividad cerebral con modificadores quimiogenéticos inyectables es una herramienta poderosa para estudiar los diversos mecanismos que subyacen a la recuperación de la LME. La precisión de la orientación para los receptores inducibles acoplados a proteínas G (DREADDs) aumenta aún más cuando se considera que el rastreo de fluorescencia valida la precisión anatómica en histología. Este artículo discute un método confiable para explorar si la inhibición o estimulación de vías neuronales seleccionadas (con DREADDS excitatorios o inhibitorios) da como resultado una mayor regeneración o brotación de axones34,35. La inyección de un vector retrógrado transportable en la médula espinal puede llamar la atención sobre poblaciones neuronales seleccionadas, ya sea directamente o a través de su conexión sináptica, lo que hace que este método sea una excelente opción para evaluar la respuesta neurobiológica a la lesión.
Como se ilustra, el estudio de LME en modelos neonatales para dilucidar cualquier discrepancia previamente desconocida entre las poblaciones pediátricas y las poblaciones adultas solo sirve para complicar aún más la investigación. Como tal, los diseños de estudio son más estrechos. El consenso en la investigación neonatal es que los mejores resultados observados después de la LME dependen del aumento de la regeneración axonal y el aumento de la brotación hasta alrededor del día postnatal 7 en roedores 3,4,5,36. Sin embargo, esta plasticidad amplificada no se ve más allá del día postnatal 10 y las mesetas de recuperación hasta que también representa modelos de lesiones de roedores adultos37,38,40. Los mecanismos subyacentes para la plasticidad mejorada en los recién nacidos son difíciles de alcanzar y siguen siendo debatidos, destacando la importancia de desarrollar modelos quirúrgicos fácilmente replicables, de supervivencia y eficientes para facilitar la investigación centrada en la LME neonatal.
Por ejemplo, algunos han postulado que el nivel desproporcionado de brotación observado en animales más jóvenes niega ciertos aspectos de la recuperación funcional del insulto CST19. En última instancia, quedan preguntas sobre si la recuperación espontánea se debe a la regeneración orgánica o simplemente al aumento de la brotación de vías aberrantes que evitan convenientemente la lesión. El protocolo descrito es una técnica relativamente sencilla y modular que se puede utilizar para estudiar la regeneración o brotación del tracto corticoespinal a través de la inhibición artificial o estimulación de procesos de recuperación con el advenimiento de vectores inducibles.
Los virus utilizados en este estudio fueron elegidos para proporcionar un modelo para futuras investigaciones que investiguen la plausibilidad de influir en la recuperación de la LME en roedores más jóvenes. Por diseño, el transgén que expresa mCherry solo marcaría positivamente bajo fluorescencia si el DREADD (hM3Dq) se expresara simultáneamente, ya que ambos están presentes en el mismo transgén. Si bien el protocolo actual no incluye evaluaciones conductuales y fenotípicas, ha sentado las bases para investigar con éxito la actividad de DREADD en estudios futuros.
Los elementos más críticos para las inyecciones exitosas de vectores virales son conocer la anatomía correcta y garantizar una difusión suficiente del virus. Con respecto a la inyección del vector anterógrado en la corteza sensoriomotora, existen numerosos métodos descritos en la literatura, incluidas tres inyecciones en las proximidades de bregma a poca profundidad (0,5-0,7 mm). Apuntar al área correcta para la inyección retrógrada de un vector en la médula espinal requiere precisión y una comprensión hábil de la neurobiología de las neuronas de interés. La mayoría de los terminales CST están localizados en las láminas V-VII a lo largo de la sustancia gris de la médula espinal, y la transfección exitosa puede requerir inyecciones en múltiples niveles cervicales41. Por ejemplo, los segmentos C4-C7 se pueden ubicar con puntos de referencia distintos, preparando así la ventana quirúrgica para laminectomías de rutina e inyecciones posteriores. Asegurar una difusión adecuada del material inyectado depende de las propiedades del vector, el volumen de la inyección y la densidad del tejido neuronal.
Afortunadamente, el cerebro neonatal es muy receptivo a la transfección, ya que la menor densidad permite una propagación más rápida y diseminada del material inyectado. El componente espinal es más complejo, con una ventana de inyección significativamente más estrecha. Sin embargo, retroAAV es eficiente en la transducción de las sinapsis objetivo. Es importante tener en cuenta que el vector retrógrado tarda en llegar al cuerpo celular y voltear el vector DREADD en la secuencia correcta, por lo que el tiempo recomendado antes de realizar evaluaciones de comportamiento o estudios histológicos es de ± 4 semanas a partir de la fecha de inyección. En resumen, el AAV retrógrado es apropiado, dado que tiene varias ventajas inmediatas, y dado que el sistema de doble floxed solo expresa fluorescentemente poblaciones neuronales objetivo. A pesar de la estrecha ventana operatoria, la médula espinal neonatal es igualmente receptiva a la transfección y demuestra expresión florida42.
La investigación pediátrica de la médula espinal es un nicho dentro de un campo que tiene muchas barreras para las investigaciones de múltiples capas. Con cada nueva iteración y avance quirúrgico en la metodología, la investigación en sí misma se vuelve más fácil y, a su vez, aumenta la probabilidad de descubrir resultados deterministas. La inyección precisa de un vector viral en una vía de la médula espinal es útil por una serie de razones de investigación, y la expansión de la tecnología de vectores virales para incluir DREADDs es útil para mejorar o atenuar selectivamente las proteínas diana. La esperanza es que la precisión mejorada del sistema de inyección de doble floxed junto con el nuevo protocolo quirúrgico fomente una multitud de objetivos de investigación similares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca de los Hospitales Shriners para Niños SHC-84706.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blades | Roboz | RS-9801-11 | For use with the scalpel. |
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic SC injection and fluid bolus |
| 4.0 silk suture | Ethicon | 771-683G | For skin closure |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation |
| Ketamine (Ketaset) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles - should be designed for nanoliter injectors. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51600 | To hold the neonatal sterotaxic holder in place |
| Lab Standard with Mouse & Neonates Adaptor | 51615 | For neonatal skull fixation during cranial surgery and spinal injections | |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre plasmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plasmid #44361) | Bryan Roth’s lab through Addgene | DREADD plasmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
| Liquid bandage | NewSkin | 985838 | To apply along sutures following surgery and encourage wound healing |
| Wire Cage Lamp | ZooMed | LF10EC | To help animals recover from anesthesia and retain warm body temperature naturally |
References
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