Summary
हम एक उच्च दबाव सेल को इकट्ठा करने, उच्च दबाव वाले एनएमआर प्रयोगों को स्थापित करने और रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं, और अंत में दबाव में पीक तीव्रता और रासायनिक बदलाव परिवर्तन दोनों का विश्लेषण करते हैं। ये प्रयोग प्रोटीन के तह रास्तों और संरचनात्मक स्थिरता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।
Abstract
उच्च दबाव एक प्रसिद्ध क्षोभ विधि है जिसका उपयोग गोलाकार प्रोटीन को अस्थिर करने और प्रोटीन परिसरों को प्रतिवर्ती तरीके से अलग करने के लिए किया जा सकता है। हाइड्रोस्टैटिक दबाव कम मोलर मात्रा के साथ राज्य (ओं) की ओर थर्मोडायनामिकल संतुलन चलाता है। दबाव में वृद्धि की पेशकश, इसलिए, गोलाकार प्रोटीन की स्थिरता और प्रोटीन परिसरों के अल्पाधिकार संतुलन को बारीक ट्यून करने के अवसर। उच्च दबाव एनएमआर प्रयोग गोलाकार प्रोटीन की स्थिरता को नियंत्रित करने वाले कारकों के विस्तृत लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं, उनके तह तंत्र, और ओलिगोमेराइजेशन तंत्र दबाव क्षोभ की ठीक स्थिरता ट्यूनिंग क्षमता और समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा पेश किए गए साइट संकल्प के संयोजन से। यहां हम 1 बार से 2.5 कबर तक दर्ज 2D 1H-15N प्रयोगों के एक सेट के माध्यम से प्रोटीन की स्थानीय तह स्थिरता की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस तरह के प्रयोगों के अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए आवश्यक कदम hnRNPA1 के RRM2 डोमेन पर प्राप्त डेटा के साथ सचित्र हैं ।
Introduction
यह लंबे समय से माना जाता रहा है कि प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की उच्च ऊर्जा, विरल आबादी वाले अनुरूप राज्यकई जैविकरास्तों 1,2, 3में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं। कैर-पुरसेल-मेबूम-गिल (सीपीएमजी)4,केमिकल एक्सचेंज सैचुरेशन ट्रांसफर (सीईटी)5,और डार्क-स्टेट एक्सचेंज सैचुरेशन ट्रांसफर (डीईएसटी)6 पल्स सीक्वेंस (अन्य के बीच) पर आधारित प्रयोगों के लिए धन्यवाद, समाधान एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी क्षणिक अनुरूप राज्यों की विशेषता के लिए पसंद की एक विधि के रूप में उभरा है7। इन प्रयोगों के साथ- साथ उच्च ऊर्जा अनुरूप उपराज्यों की सापेक्ष आबादी को बढ़ाने के लिए तापमान, पीएच या रासायनिक डेनेचर्स जैसे क्षोभ शुरू किए जा सकते हैं। इसी तरह हाई हाइड्रोस्टैटिक प्रेशर लगाने से प्रोटीन संतुलन भी बेफिक्र हो सकता है। इसी अनुरूप परिवर्तनों से जुड़े वॉल्यूम परिवर्तन के परिमाण के आधार पर, कुछ सौ से कुछ हजार बार तक दबाव में वृद्धि एक उच्च ऊर्जा स्थिति को काफी हद तक स्थिर कर सकती है या प्रोटीन को पूरी तरह से8,9,10को प्रकट कर सकती है। प्रोटीन एनएमआर स्पेक्ट्रा आमतौर पर हाइड्रोस्टैटिक दबाव के साथ दो प्रकार के परिवर्तन प्रदर्शित करता है: (i) रासायनिक बदलाव परिवर्तन और (ii) पीक तीव्रता परिवर्तन। रासायनिक बदलाव परिवर्तन प्रोटीन सतह-जल इंटरफेस और/या प्रोटीन संरचना के स्थानीय संपीड़न में तेजी से समय पैमाने पर (एनएमआर समय पैमाने के सापेक्ष)11में परिवर्तन को दर्शाते हैं । बड़े गैर-रैखिक रासायनिक बदलावों का प्रदर्शन करने वाले क्रॉसपीक दबाव निर्भरता उच्च ऊर्जा अनुरूप राज्यों की उपस्थिति का संकेत दे सकती है12,13। दूसरी ओर, पीक तीव्रता परिवर्तन धीमी गति से समय पैमाने पर प्रमुख अनुरूप संक्रमण की ओर इशारा करते हैं, जैसे कि मुड़ा हुआ/सामने आई राज्य की आबादी में परिवर्तन । किसी दिए गए प्रोटीन 14, 15 ,16,17के विभिन्न अवशेषों के लिए मापा जाने पर मात्रा परिवर्तन की मात्रा के परिमाण में बड़े अंतर से तह मध्यवर्ती या उच्च ऊर्जा राज्यों की उपस्थिति का पता लगाया जा सकता है । हमारे अनुभव के आधार पर, यहां तक कि छोटे प्रोटीन जिन्हें आम तौर पर दो-राज्य फ़ोल्डर्स के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, दबाव के लिए गैर-समान प्रतिक्रियाएं प्रदर्शित करते हैं, जो उनके स्थानीय तह स्थिरता के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है। यहां वर्णित अधिग्रहण और अमेज पीक तीव्रता और 1एच रासायनिक बदलाव दबाव निर्भरता के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल है, एक मॉडल प्रोटीन के रूप में उपयोग कर विषम परमाणु राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन A1 (hnRNPA1) के अलग आरएनए मान्यता आकृति 2 (RRM2) ।
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Protocol
नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल (i) एक उच्च दबाव पंप और सेल के साथ एक २.५ kbar रेटेड एल्यूमीनियम-कड़ा जिरकोनिया ट्यूब18,(ii) NMR स्पेक्ट्रा के विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर स्पार्की19 की आवश्यकता है, और (iii) एक वक्र फिटिंग सॉफ्टवेयर ।
1. नमूना तैयारी, उच्च दबाव सेल की असेंबली, और प्रयोगों की स्थापना।
- बफर का विकल्प: एनियोनिक और cationic बफ़र्स के समान मिश्रण का उपयोग करें, जैसे फॉस्फेट और ट्रिस20,21।
नोट: फॉस्फेट और एमईएस जैसे एनियोनिक बफ़र्स का पीकेए पर्याप्त प्रतिक्रिया मात्रा (यानी, एसिड और आयनीकृत उत्पादों के आंशिक मोलाल वॉल्यूम में अंतर) से जुड़ा हुआ है। इसलिए ऐसे बफ़र्स का पीएच दबाव (~ 0.25-0.5 पीएच इकाई/kbar) के परिवर्तन से काफी प्रभावित हो सकता है। - सुनिश्चित करें कि आवश्यक नमूना मात्रा एक मानक 3 मिमी व्यास एनएमआर ट्यूब (~ 300μL) के समान है।
- जिरकोनिया ट्यूब में एक ग्लास पिपेट के साथ 15एन-लेबल नमूना पेश करें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब के नीचे नमूना सीटें। ट्रांसमिशन तरल (जैसे, पानी) के साथ मिश्रण से नमूने को रोकने के लिए खनिज तेल के 200 माइक्रोन के साथ पूरा करें। बाकी ट्यूब को ट्रांसमिशन लिक्विड से भरें।
- जिरकोनिया ट्यूब के शीर्ष पर एक एकल उपयोग ओ-रिंग रखो और ट्यूब को आधार(चित्रा 1A,बी)में स्लाइड करें। फिर, ट्यूब को उच्च दबाव वाली तार लाइन से कनेक्ट करें और आधार को पहले हाथ से सेल में कस लें। फिर, कम दबाव (चित्रा 1C,D)पर लीक को रोकने के लिए14.7एनएम टॉर्क लागू करें।
- दबाव सेल असेंबली की अखंडता की जांच करने के लिए, सेल समर्थन और रोकथाम पोत का उपयोग करके स्पेक्ट्रोमीटर के बाहर 300 बार तक ट्यूब पर दबाव डालें। 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, दबाव को 1 बार रीसेट करें और एक साफ लिंट-फ्री वाइप के साथ लीक की जांच करें।
- टिथर लाइन को ध्यान से मार्गदर्शन करके स्पेक्ट्रोमीटर में अनप्रेशर ट्यूब डालें। नमूना बैठे स्थिति(चित्रा 1E)तक पहुंचने तक स्पेक्ट्रोमीटर में ट्यूब स्लाइड ।
- हमेशा की तरह 1एच और 15एन चैनलों को लॉक, शिम, मैच और ट्यून करें।
नोट: उच्च दबाव रेटेड जिरकोनिया ट्यूबों के लिए शिम्स मानक एनएमआर ट्यूबों से बहुत अलग हैं। भविष्य के उपयोग के लिए अनुकूलित शिम्स को बचाने की सिफारिश की जाती है। - 1एच-15एन-एचएसक्यूसी या ट्रोसी-एचएसक्यूसी सेट करें और वायुमंडलीय स्थितियों (1बार) में एक संदर्भ प्रयोग रिकॉर्ड करें।
2. उच्च दबाव एनएमआर प्रयोगों की रिकॉर्डिंग
- धीरे-धीरे प्रोटीन की समग्र स्थिरता का परीक्षण करने के लिए 500 बार वेतन वृद्धि के साथ 1 बार से 2.5 कबर तक दबाव बढ़ाएं। ~ 18 बार/एस पर डिफ़ॉल्ट रूप से दबाव पंप की गति निर्धारित करें । यदि सटीक तह/खुलासा दरों का पता नहीं है, तो प्रत्येक ५००-बार वेतन वृद्धि के बाद नमूना 15-20 मिनट बराबर कर दें । 2.5 कबर पर एक स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें।
- धीरे-धीरे दबाव क्षोभ की रिवर्सिबिलिटी का परीक्षण करने के लिए 500 बार चरणों के साथ 1 बार में वापस दबाव कम करें। वायुमंडलीय परिस्थितियों में एक और स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करें और रासायनिक बदलावों और चोटी की तीव्रता की तुलना पहले एक ही परिस्थितियों में दर्ज संदर्भ स्पेक्ट्रम के साथ करें ।
नोट: यदि दबाव चलाने के बाद देशी क्रॉसपीक अधिक तीव्र होते हैं, तो यह संकेत दे सकता है कि वायुमंडलीय दबाव में समाधान में मौजूद छोटे समुच्चय को अलग किया जा सकता है और ठीक से फिर से मुड़ा हुआ हो सकता है। दूसरी ओर, तीव्रता या महत्वपूर्ण रासायनिक बदलाव परिवर्तनों में नुकसान से पता चलता है कि प्रोटीन उच्च दबाव की स्थितियों में एक गैर-रिवर्सिबल गलत गुना का अनुभव कर सकता है। - हर 500 बार में 1 बार से 2.5 कबर तक 2डी प्रयोगों की एक श्रृंखला रिकॉर्ड करें। फिट की सटीकता में सुधार करने के लिए तह/खुलासा संक्रमण के मोड़ बिंदु के पास अतिरिक्त प्रयोगों को रिकॉर्ड करने की सिफारिश की जाती है ।
3. पीक तीव्रता परिवर्तन का विश्लेषण
- सभी स्पेक्ट्रा को संसाधित करें और 1 बार में संदर्भ स्पेक्ट्रम से बैकबोन असाइनमेंट को 500 बार में दर्ज स्पेक्ट्रम में स्थानांतरित करें, और फिर असाइनमेंट को 500 बार से 1 कबर और आगे स्थानांतरित करें।
नोट: क्योंकि दबाव 1 एच और 15एन रासायनिक बदलाव के एक गैर वर्दी बदलाव लाती है, बस एक स्पेक्ट्रम से अगले करने के लिए रीढ़ की हड्डी काम की नकल नहीं है । इसे मैन्युअल रूप से समायोजित करें। - स्पार्की मेनू में, पीक > पीक लिस्ट (लेफ्टिनेंट)पर क्लिक करें । पीक लिस्ट विंडो में, विकल्पों पर क्लिक करें और आवृत्तियों (पीपीएम) और डेटा ऊंचाईदोनों को प्रदर्शित करने का विकल्प चुनें। प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए प्राप्त सूची को सहेजें।
- एक वक्र फिटिंग सॉफ्टवेयर में, क्रॉसपीक पहचान और पीक तीव्रता मूल्यों को कॉपी करें ताकि एक्स-एक्सिस वेरिएबल और तीव्रता के रूप में Y-अक्ष चर के रूप में दबाव मूल्य (बार में) हो।
- यदि एक पूर्ण या निकट पूर्ण (>80%) का खुलासा देखा जाता है, तो एक साधारण दो-राज्य मॉडल का उपयोग करके क्रमशः खुलासा करने पर मुफ्त ऊर्जा और मात्रा परिवर्तन निकालने के लिए व्यक्तिगत पीक तीव्रता प्रोफाइल फिट करें:
Eq. 1
जहां, "मैं" एक दिए गए दबाव पी पर एक क्रॉसपीक की मनाया तीव्रता है और मैंएफ एक पूरी तरह से मुड़ा हुआ राज्य में एक ही क्रॉसपीक की तीव्रता है । आर गैस स्थिर है, टी निरपेक्ष तापमान है, 1GU0 वायुमंडलीय दबाव पी 0 (1 बार) पर सामने आया और मुड़ा राज्यों के बीच मानक गिब्स मुक्त ऊर्जा अंतर है, और खुलासा करने पर यू मात्रा में परिवर्तन । बार में दबाव पी और केल्विन में तापमान टी के साथ, आर = १.९८७ cal/K, ΤGयू0 cal/mol में है, और ΤVयू cal/mol/bar में है । 41.84 द्वारा फिट से प्राप्त 1Vयू मूल्यों को गुणा करने के लिए gll/mol. ΤVयू मूल्यों की सीमा में आम तौर पर कर रहे है-५० से-१५० एमएल/मोल गोलाकार प्रोटीन के लिए22। यहां, सभी मापदंडों खुलासा प्रतिक्रिया के संबंध में व्यक्त कर रहे हैं, लेकिन आसानी से तह प्रतिक्रिया मापदंडों में परिवर्तित किया जा सकता है (ΤGयू= -ΤGएफ0 और ΤVU =-ΤVएफ)।
Eq. 14. रासायनिक बदलाव परिवर्तन का विश्लेषण
- सॉफ्टवेयर में कॉलम की व्यवस्था करने के लिए चर के रूप में दबाव अंक है और 1एच रासायनिक Y-अक्ष के रूप में स्पार्की सूचियों से निकाले गए बदलाव ।
- एक साधारण चतुर्भुज समीकरण के लिए 1एच रासायनिक बदलाव की दबाव निर्भरता फिट:
δ (p) = δ0(p0)+ B1(p-p0)+ B2 (p-p0)2 Eq. 2
जहां, δ(पी)एक दिए गए दबाव पी पर एक क्रॉसपीक के मापा 1एच रासायनिक बदलाव और 0(पी0)1बार में दर्ज संदर्भ स्पेक्ट्रम में एक ही क्रॉसपीक के 1 एच रासायनिक बदलाव ों के δ है । बी1 और बी2 क्रमशः पीपीएम/बार और पीपीएम/बार2में व्यक्त पहले और दूसरे क्रम के मापदंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
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Representative Results
यहां वर्णित प्रोटोकॉल RRM2, hnRNPA1 (अवशेष 95-106) के दूसरे आरएनए मांयता आकृति की दबाव निर्भरता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो लगभग पूरी तरह से २.५ kbar रेंज (>९०%) के भीतर सामने आया है । 1 एच-15एन स्पेक्ट्रा को 1 बार, 500 बार, 750 बार, 1 कबर, 1.5 कबर, 2 कबर और 2.5 कबर(चित्रा 2)पर एकत्र किया गया। चूंकि देशी क्रॉसपीक में से कोई भी 2.5 कबर पर शोर स्तर से ऊपर दिखाई नहीं दे रहा था, इसलिए सभी संबंधित अवशेषों को इस दबाव(चित्रा 3 ए)पर 0 की तीव्रता मूल्य को जिम्मेदार ठहराया गया था। कुल 45 व्यक्तिगत दबाव तीव्रता प्रोफाइल समीकरण 1 (Eq. 1) के अनुसार फिट किए गए थे मानक गिब्स मुक्त ऊर्जा (ΤG U0)और मात्रा (ΤVU)खुलासा प्रतिक्रिया(चित्रा 3A)के साथ जुड़े में इसी परिवर्तन प्राप्त करने के लिए । गणना 1Vयू मूल्यों से लेकर -41 से लेकर -88 mL/मोल और 1.8-3.3 किलो कैलोरी/मोल से 1GU0. डोमेन संरचना (पीडीबी 1U1R) पर मैप किए जाने पर, ऐसा लगता है कि वॉल्यूम परिवर्तन के सबसे बड़े परिमाण वाले अवशेष डोमेन स्ट्रक्चरल कोर (चित्रा 3बीमें लाल रंग में) के भीतर पाए जाते हैं, जबकि वॉल्यूम परिवर्तन के सबसे छोटे परिमाण वाले अवशेष मुख्य रूप से β-किस्में 2 और 3 को जोड़ने वाले लूप में स्थित होते हैं, और β-स्ट्रैंड 4 को सी-टर्मिनल हेलिक्स (ग्रीन, ग्रीन, में, ग्रीन, में, चित्रा 3B)। देशी रीढ़ की दबाव निर्भरता 1एच रासायनिक बदलाव भी संकुचित और जोड़ राज्य पहनावा की अनुरूप विषमता की डिग्री की जांच करने के लिए विश्लेषण किया गया था । दबाव के एक समारोह के रूप में 1एच रासायनिक बदलाव के व्यक्तिगत प्रोफाइल Eq. 2 का उपयोग कर साइट विशिष्ट रैखिक (बी1)और गैर रैखिक (बी2)गुणांक(चित्रा 3C)निकालने के लिए फिट किए गए थे । सबसे बड़े गैर-रैखिक गुणांक वाले अवशेष ज्यादातर डोमेन के संरचनात्मक कोर (पीले, चित्रा 3 डीमें) में पाए जाते थे, जबकि सबसे छोटे गैर-रैखिक गुणांक वाले अवशेष ज्यादातर विभिन्न संरचनात्मक रूपांकनों (नीले, चित्रा 3 डीमें) को जोड़ने वाले छोरों के भीतर स्थित थे।
चित्रा 1:उच्च दबाव सेल विधानसभा और स्पेक्ट्रोमीटर में स्थापना। (ए-डी) पूर्ण उच्च दबाव सेल असेंबली के लिए एक जिरकोनिया ट्यूब, एक एकल उपयोग ओ-रिंग, सेल बेस(ए, बी)की आवश्यकता होती है। ट्यूब सेल(सी, डी)के लिए आधार कस कर तार लाइन से जुड़ा हुआ है । कम दबाव पर लीक को रोकने के लिए 14.7 एनएम टॉर्क की आवश्यकता होती है। (ई)तार लाइन के माध्यम से Xtreme-60 सिरिंज पंप से जुड़े जिरकोनिया ट्यूब को सामान्य नमूना बैठने की स्थिति तक पहुंचने तक स्पेक्ट्रोमीटर में पेश किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:दबाव में hnRNPA1 RRM2 डोमेन का खुलासा। 1एच-15 एन एचएसक्यूसी स्पेक्ट्रा(A)1 बार,(B)1,000 बार,(C)1,500 बार, (D)और 2,500 बार दबाव में RRM2 डोमेन का पूरा खुलासा दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3:RRM2 पीक तीव्रता और 1एच रासायनिक बदलाव दबाव निर्भरता का विश्लेषण । (A)1 से 2,000 बार के बीच RRM2 के लिए दर्ज प्रतिनिधि पीक तीव्रता प्रोफाइल। ठोस लाइनें इसी मानक मुक्त ऊर्जा और खुलासा प्रतिक्रिया के साथ जुड़े मात्रा परिवर्तन की गणना करने के लिए Eq. 1 का उपयोग कर प्राप्त फिट का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख)एसयूवीयू के सबसे बड़े मापा परिमाण के साथ अवशेषों के शीर्ष 25% RRM2 संदर्भ संरचना (pdb 1U1R) पर लाल क्षेत्रों के साथ प्रकाश डाला जाता है । 1Vयू के सबसे छोटे परिमाण वाले अवशेष हरे रंग में दिखाए जाते हैं। (ग)1 बार और 2,000बार के बीच RRM2 के लिए मापा 1 एच रासायनिक बदलाव के प्रतिनिधि परिवर्तन। ठोस रेखाएं रैखिक (बी1)और गैर-रैखिक (बी2)दबाव गुणांक की गणना करने के लिए एक्यू 2 के लिए फिट का प्रतिनिधित्व करती हैं। (घ)सबसे बड़े बी 2 गुणांक वाले अवशेषों में से शीर्ष25% पीले रंग में दिखाए जाते हैं, जबकि सबसे छोटे बी 2 गुणांक वाले लोगों को नीले रंग में दिखायाजाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यह अध्ययन दबाव क्षोभ के लिए प्रोटीन संरचनात्मक और थर्मोडायनामिक्स प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए लागू एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है। RRM2 पर यहां दर्ज किए गए उच्च दबाव वाले प्रयोगों से यह प्रदर्शित होता है कि एडब्ल्यूयू मूल्यों में बड़ी भिन्नताएं, गैर-पूरी तरह से सहकारी खुलासा का संकेत, अपेक्षाकृत छोटे एकल डोमेन प्रोटीन में पाया जा सकता है। इसी तरह की तस्वीर दबाव में 1एच केमिकल शिफ्ट बदलाव के विश्लेषण से उभरकर सामने आती है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए Kalbitzer और सहकर्मियों का प्रदर्शन किया है कि रासायनिक बदलाव परिवर्तन का एक और अधिक गहराई से विश्लेषण गैर रैखिक और रैखिक गुणांक (बी2/बी1)के बीच अनुपात को जोड़ने के साथ संपीड़न और मात्रा में परिवर्तन के अनुपात के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है (Τ/ΟV)23। ये परिणाम स्थानीय थर्मोडायनामिक स्थिरता और खुलासा से जुड़े वॉल्यूम परिवर्तन के आधार पर व्यक्तिगत संरचनात्मक रूपांकनों और उपडोमेन को अस्थिर करने के लिए उच्च हाइड्रोस्टैटिक दबाव की क्षमता को उजागर करते हैं। दबाव टाइटेशन प्रयोगों का एक सरल सेट रिकॉर्डिंग इसलिए एक प्रोटीन के तह तंत्र और उपडोमेन वास्तुकला के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।
संपूर्ण दबाव प्रणाली (पंप और नियंत्रक) अपेक्षाकृत कॉम्पैक्ट है और स्पेक्ट्रोमीटर(चित्रा 1)तक आसान पहुंच के लिए एक मानक उपयोगिता गाड़ी पर स्थापित किया जा सकता है। सभी पल्स दृश्यों ट्रिपल प्रतिध्वनि प्रयोगों सहित संशोधन के बिना दबाव में इस्तेमाल किया जा सकता है। एकमात्र सीमा यह है कि दबाव-रेटेड जिरकोनिया ट्यूब मानक 3 मिमी व्यास एनएमआर ट्यूब की तुलना में एनएमआर प्रयोगों की संवेदनशीलता को लगभग 50% तक कम करते हैं। यह प्रोटीन के नमूनों के लिए एक चुनौती पेश कर सकता है जिसे उच्च-पर्याप्त स्तर पर केंद्रित नहीं किया जा सकता है। तापमान या रासायनिक विकृतियों जैसे अन्य क्षोभ विधियों की तुलना में, हाइड्रोस्टैटिक दबाव बहुत कम अपवादों के साथ, पूरी तरह से प्रतिवर्ती होने का लाभ प्रस्तुत करता है। क्योंकि दबाव प्रोटीन परिसरों के वियोजन के पक्ष में है, उदाहरण के लिए, नमूना एकत्रीकरण का बहुत कम जोखिम है, एक समस्या अक्सर उच्च तापमान के साथ सामना करना पड़ा।
जबकि हाइड्रोस्टैटिक दबाव प्रोटीन स्थिरता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि क्षोभ की कोई सही विधि नहीं है। उनमें से प्रत्येक एक अलग तरीके से एक प्रोटीन मुक्त ऊर्जा परिदृश्य की विशिष्टता पर प्रकाश डाला गया । उदाहरण के लिए, यदि दो अनुरूप राज्यों में एक ही मोलर मात्रा है, हाइड्रोस्टैटिक दबाव में वृद्धि उनके सापेक्ष आबादी को काफी नहीं बदलेगी । इसी तरह, यदि दो अनुरूप राज्यों में एक समान उजागर सतह क्षेत्र है, तो रासायनिक विकृतियों को जोड़ने से एक राज्य की सापेक्ष आबादी में दूसरे की तुलना में वृद्धि नहीं होगी । आदर्श रूप से, प्रोटीन मुक्त ऊर्जा परिदृश्य15,24का पूर्ण विवरण प्राप्त करने के लिए विभिन्न क्षोभ विधियों को जोड़ा जाना चाहिए। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हालांकि पांडुलिपि संतुलन में मापा 2D 1एच-15एन प्रयोगों की श्रृंखला से तीव्रता और रासायनिक बदलाव की दबाव निर्भरता पर केंद्रित है, एनएमआर प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला स्थिरता के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए दबाव क्षोभ के लिए युग्मित किया जा सकता है, तह तंत्र, और प्रोटीन और प्रोटीन परिसरों की अनुरूप गतिशीलता20, 25.
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Disclosures
सभी लेखकों ने पांडुलिपि पढ़ी और अनुमोदित की है। वे हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते ।
Acknowledgments
इस काम को रॉय जे कार्वर चैरिटेबल ट्रस्ट से जूलियन रोशे तक के फंड्स ने सपोर्ट किया । हम जे डी लेवेंगुड और बी एस टॉलबर्ट को RRM2 नमूना प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
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