Summary
Vi giver en detaljeret beskrivelse af de trin, der kræves for at samle en højtrykscelle, oprette og registrere NMR-eksperimenter med højtryk og endelig analysere både topintensitets- og kemikalieskift under tryk. Disse eksperimenter kan give værdifuld indsigt i foldeveje og strukturel stabilitet af proteiner.
Abstract
Højtryk er en velkendt forstyrrelsesmetode, der kan bruges til at destabilisere kugleformede proteiner og adskille proteinkomplekser på en reversibel måde. Hydrostatisk tryk driver termodynamisk ligevægt mod staten (r) med den lavere molar volumen. Stigende tryk giver derfor mulighed for at finjustere stabiliteten af kugleformede proteiner og oligomeriseringsekvilibri af proteinkomplekser. Nmr-eksperimenter med højt tryk giver mulighed for en detaljeret karakterisering af de faktorer, der styrer stabiliteten af kugleproteiner, deres foldemekanismer og oligomeriseringsmekanismer ved at kombinere trykforstyrrelsens finstabilitetsevne og den stedopløsning, der tilbydes ved løsning NMR-spektroskopi. Her præsenterer vi en protokol til sonde den lokale folde stabilitet af et protein via et sæt af 2D 1H-15N eksperimenter registreret fra 1 bar til 2,5 kbar. De trin, der kræves til erhvervelse og analyse af sådanne eksperimenter, illustreres med data, der er erhvervet på RRM2-domænet for hnRNPA1.
Introduction
Det har længe været anerkendt, at højere energi, tyndt befolkede kropsbygningstilstande af proteiner og proteinkomplekser spiller en central rolle i mange biologiske veje1,2,3. Takket være eksperimenter baseret på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5og dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 pulssekvenser (blandt andre) er løsning NMR-spektroskopi opstået som en valgfri metode til karakterisering af forbigående kropsbygningstilstande7. Sammen med disse eksperimenter, forstyrrelser såsom temperatur, pH, eller kemiske denaturanter kan indføres for at øge den relative befolkning af højere energi kropsbygning substates. Tilsvarende kan protein ekvilibri også forstyrres ved at anvende højt hydrostatisk tryk. Afhængigt af størrelsen af volumenændringen i forbindelse med de tilsvarende kropslige ændringer kan en stigning i trykket med et par hundrede til et par tusinde barer betydeligt stabilisere en højere energitilstand eller få et protein til helt at udfolde sig8,9,10. Protein NMR-spektre udviser typisk to typer ændringer med hydrostatisk tryk: (i) ændringer i kemisk skift og (ii) ændringer i spidsbelastningsintensiteten. Ændringer i kemiske skift afspejler ændringer i proteinoverfladen-vand-grænsefladen og/eller den lokale kompression af proteinstrukturen på en hurtig tidsskala (i forhold til NMR-tidsskalaen)11. Krydsfarver , der udviser store ikke-lineære kemiske skift trykafhængighed, kan indikere tilstedeværelsen af højere energikonformationstilstande12,13. På den anden side peger ændringer i spids intensitet på større kropslige overgange på en langsom tidsskala, såsom ændringer i foldede / udfoldede tilstandspopulationer. Tilstedeværelsen af sammenklappelige mellemprodukter eller højere energitilstande kan påvises fra store variationer i volumenændringens størrelse ved udfoldning målt for forskellige restkoncentrationer af et givet protein14,15,16,17. Baseret på vores erfaring udviser selv små proteiner, der typisk er klassificeret som tostatsmapper, ikke-ensartede reaktioner på tryk, hvilket giver nyttige oplysninger om deres lokale foldestabilitet. Beskrevet her er en protokol for erhvervelse og analyse af amide peak intensitet og 1H kemiske skift trykafhængighed, ved hjælp af som model protein den isolerede RNA anerkendelse motiv 2 (RRM2) af heterogene nukleare ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Den protokol, der er beskrevet her, kræver (i) en højtrykspumpe og celle med en 2,5 kbar bedømt aluminiumshærdet zirconiarør18, (ii) softwaren SPARKY19 til analyse af NMR-spektret og (iii) en kurvemonteringssoftware.
1. Prøveforberedelse, samling af højtrykscellen og opsætning af forsøgene.
- Valg af buffer: Brug lige blanding af anioniske og kationiske buffere, såsom fosfat og Tris20,21.
BEMÆRK: PKa af anioniske buffere som fosfat og MES er forbundet med et betydeligt reaktionsvolumen (dvs. forskellen i de delvise molalmængder af syren og de ioniserede produkter). PH for sådanne buffere kan derfor påvirkes betydeligt af en trykændring (~0,25-0,5 pH-enhed/kbar). - Sørg for, at det krævede prøvevolumen svarer til et NMR-rør med en diameter på 3 mm (~300μL).
- Indfør den 15N-mærkede prøve med en glaspipette i zirconiarøret. Sørg for, at prøvesæderne i bunden af røret. Komplet med 200 μL mineralolie for at forhindre prøven i at blande sig med transmissionsvæsken (f.eks. vand). Fyld resten af røret med transmissionsvæske.
- Sæt en engangs-O-ring oven på zirconiarøret, og skub røret ind i bunden (Figur 1A,B). Tilslut derefter røret til højtryksbåndlinjen og stram bunden til cellen først med hånden. Påfør derefter 14,7 Nm drejningsmoment for at forhindre lækager ved lavere tryk (Figur 1C, D).
- For at kontrollere trykcellesamlingens integritet skal røret trykkes op til 300 bar uden for spektrometeret ved hjælp af cellestøtte og indeslutningsbeholder. Vent i 15 minutter, nulstil trykket til 1 bar og kontroller for lækager med en ren fnugfri aftørring.
- Sæt det trykrør ind i spektrometeret ved forsigtigt at styre tetherlinjen. Røret skubbes i spektrometeret, indtil prøvestillingen når frem (figur 1E).
- Lås, shim, match, og tune 1H og 15N kanaler som sædvanlig.
BEMÆRK: Shims til højtryksvurderede zirconiarør er meget forskellige fra standard NMR-rør. Det anbefales at gemme de optimerede shims til fremtidig brug. - Opret en 1H-15N-HSQC eller TROSY-HSQC og registrere et referenceeksperiment ved atmosfæriske forhold (1bar).
2. Registrering af NMR-eksperimenter med højtryk
- Gradvist øge trykket fra 1 bar til 2,5 kbar med 500 bar intervaller for at teste den samlede stabilitet af proteinet. Indstil trykpumpens hastighed som standard til ~18 bar/s. Hvis de præcise folde-/foldehastigheder ikke kendes, skal prøven ekvilibrere 15-20 min efter hver stigning på 500 bar. Optag et spektrum på 2,5 kbar.
- Sænk gradvist trykket tilbage til 1 bar med 500 bar trin for at teste reversibiliteten af trykforstyrrelsen. Registrer et andet spektrum ved atmosfæriske forhold, og sammenlign de kemiske forskydninger og spidsbelastninger med det referencespektrum, der tidligere blev registreret under de samme forhold.
BEMÆRK: Hvis de indfødte crosspeaks er mere intense efter trykkørslen, kan det indikere, at små aggregater, der er til stede i opløsning ved atmosfærisk tryk, kan have adskilt og korrekt foldet. På den anden side tyder et tab i intensiteten eller betydelige kemiske skiftændringer på, at proteinet kan opleve en ikke-reversibel fejlfoldning under højtryksforhold. - Optag en række 2D-eksperimenter fra 1 bar til 2,5 kbar hver 500 bar. Det anbefales at registrere yderligere eksperimenter i nærheden af bøjningspunktet for folde/udfoldelsesovergangen for at forbedre pasformens præcision.
3. Analyse af ændringer i spidsbelastningsintensiteten
- Behandl alle spektre og overføre rygraden tildeling fra referencespektret på 1 bar til spektret registreres på 500 bar, og derefter overføre opgaven fra 500 bar til 1 kbar og så videre.
BEMÆRK: Da tryk fremkalder et ikke-ensartet skift på 1H og 15N kemiske skift, skal du ikke blot kopiere rygradsopgaven fra det ene spektrum til det næste. Juster det manuelt. - Klik på Peak > Peak List (lt) imenuen Sparky . Klik på Indstillinger i vinduet Topliste , og vælg indstillingen for at få vist både frekvenser (ppm) og Datahøjde. Gem den liste, der er opnået for hvert spektrum.
- Kopier krydshensynsidentitets- og topintensitetsværdierne i en kurvetilpasningssoftware for at have trykværdierne (i søjle) som X-aksevariablen og intensiteten som Y-aksevariablen.
- Hvis der observeres en fuldstændig eller næsten komplet (>80 %), skal du montere de individuelle profiler med høj intensitet for at udtrække den frie energi- og volumenændring, når du folder sig ud ved hjælp af en simpel tostatsmodel:
Eq. 1
Hvor"I" er den observerede intensitet af en crosspeak ved et givet tryk p og jegF er intensiteten af den samme crosspeak i en fuldt foldet tilstand. R er gaskonstanten, T er den absolutte temperatur, ΔGU0 standard Gibbs fri energiforskel mellem de udfoldede og foldede tilstande ved atmosfærisk tryk p0 (1 bar) og ΔVu volumenændringen ved udfoldning. Med trykket p i stang og temperatur T i kelvin, R = 1.987 cal/K, ΔGU0 er i cal/mol, og ΔVU er i cal/mol/bar. Multiplicer de ΔV U-værdier, der er opnået fra pasformen, med 41,84 for at omdannes til mL/mol. ΔVU-værdier ligger typisk i intervallet -50 til -150 mL/mol for kugleproteiner22. Her udtrykkes alle parametre med hensyn til udfoldelsesreaktionen, men kan nemt konverteres til foldereaktionsparametre (ΔGU0 = -ΔGF0 og ΔVU = -ΔVF).
Eq. 14. Analyse af ændringer i kemiske skift
- Arranger kolonnerne i softwaren for at få trykpunkter som variable, og de 1H kemiske skift ekstraheret fra Sparky lister som Y-aksen.
- Passer trykafhængigheden af 1H kemiske skift til en simpel kvadratisk ligning:
δ(p) = δ0(p0) + B1(p-p0) + B2 (p-p0)2 Eq. 2 Eq.
Hvis δ(p)er den målte 1H kemiske skift af en crosspeak ved et givet tryk p og δ0(p0) de 1H kemiske skift af samme krydspeak i referencespektret registreret på 1 bar. B1 og B2 repræsenterer henholdsvis første og andenrangsparametre udtrykt i ppm/bar og ppm/bar2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet her blev brugt til at sondere trykafhængigheden af RRM2, det andet RNA-anerkendelsesmotiv af hnRNPA1 (rester 95-106), som næsten helt udfoldes inden for 2,5 kbar-området (>90%). 1 H-15N spektre blev indsamlet på 1 bar, 500 bar, 750 bar, 1 kbar, 1,5 kbar, 2 kbar, og 2,5 kbar (Figur 2). Da ingen af de indfødte tværpeakker var synlige over støjniveauet ved 2,5 kbar, blev alle tilsvarende rester tilskrevet en intensitetsværdi på 0 ved dette tryk (figur 3A). I alt 45 individuelle trykintensitetsprofiler blev monteret i henhold til ligning 1 (eq. 1) for at opnå de tilsvarende ændringer i standard Gibbs frienergi (ΔGU0) og volumen (ΔVU),der er forbundet med den udfoldende reaktion (Figur 3A). De beregnede ΔVU-værdier varierede fra -41 til -88 mL/mol og ΔGU0 fra 1,8-3,3 kcal/mol. Når de er kortlagt på domænestrukturen (pdb 1U1R), ser det ud til, at rester med den største mængdeændring findes inden for domænestrukturkernen (i rødt, i figur 3B),mens de, der har den mindste volumenændring, hovedsageligt er placeret i løkken, der forbinder β-strengene 2 og 3, og løkken, der forbinder β-streng 4 til C-terminalhelixen (i grøn, Figur 3B). Trykafhængigheden af de indfødte rygrad 1H kemiske skift blev også analyseret for at sonde graden af kompressibilitet og kropslig heterogenitet af den foldede tilstand ensemble. Individuelle profiler af 1H kemiske skift som funktion af tryk blev monteret ved hjælp af Eq. 2 for at udtrække stedspecifikke lineære (B1)og ikke-lineære (B2)koefficienter (figur 3C). Resterne med de største ikke-lineære koefficienter blev for det meste fundet i domænets strukturelle kerne (i gult figur 3D), mens rester med de mindste ikke-lineære koefficienter for det meste var placeret inden for sløjfer, der forbinder de forskellige strukturelle motiver (i blåt figur 3D).
Figur 1: Højtrykscellesamling og installation i spektrometeret. (A-D) Den fulde højtrykscellesamling kræver et zirconiarør, en engangs O-ring, cellebasen (A,B). Røret er forbundet til tetherlinjen ved at stramme bunden til cellen (C, D). 14,7 Nm drejningsmoment er påkrævet for at forhindre lækager ved lavere tryk. (E) Zirconiarøret, der er tilsluttet Xtreme-60 Sprøjtepumpen via tetherlinjen, føres ind i spektrometeret, indtil det når den normale prøve siddende stilling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Udfoldning af hnRNPA1 RRM2 domæne under tryk. 1H-15N HSQC spektre indsamlet på (A) 1 bar, (B) 1.000 bar, (C) 1.500 bar, (D) og 2.500 bar viser en komplet udfoldelse af RRM2 domæne under pres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Analyse af RRM2-spidsintensitet og 1H kemisk forskydninger trykafhængighed. (A) Repræsentative profiler med høj intensitet registreret for RRM2 mellem 1 og 2.000 bar. Faste linjer repræsenterer den pasform, der opnås ved hjælp af Eq. 1 til at beregne de tilsvarende standardfri energi- og volumenændringer, der er forbundet med udfoldelsesreaktionen. (B) De øverste 25 % af restkoncentrationerne med den største målte størrelse på ΔVU fremhæves med røde kugler på RRM2-referencestrukturen (pdb 1U1R). Rester med den mindste størrelse af ΔVU er vist med grønt. (C) Repræsentative ændringer af 1H kemiske skift målt for RRM2 mellem 1 bar og 2.000 bar. Faste linjer repræsenterer pasformen til Eq. 2 til beregning af de lineære (B1) og ikke-lineære (B2)trykkoefficienter. (D) De øverste 25% af restkoncentrationer med de største B2 koefficienter er vist i gult, mens dem med de mindste B2 koefficienter er vist med blåt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse beskriver en protokol implementeret til sonde protein strukturelle og termodynamik reaktioner på trykforstyrrelse. De højtryksforsøg, der er registreret her på RRM2, viser, at store variationer i ΔVU-værdier, der indikerer ikke-fuldt samarbejdsvillig udfoldning, kan findes i et relativt lille enkelt domæneprotein. Et lignende billede fremgår af analysen af 1H kemiske skift ændringer under pres. Det skal bemærkes, at Kalbitzer og kolleger har påvist, at der kan foretages en mere tilbundsgående analyse af ændringer i kemiske skift, der forbinder forholdet mellem de ikke-lineære og lineære koefficienter (B2/B1) med forholdet mellem ændringen i kompressibilitet og volumen (Δβ/ΔV)23. Disse resultater fremhæver evnen til højt hydrostatisk tryk til at destabilisere individuelle strukturelle motiver og underdomæner baseret på den lokale termodynamiske stabilitet og volumenændring forbundet med udfoldelse. Registrering af et simpelt sæt tryk titrering eksperimenter kan derfor give værdifulde oplysninger om folde mekanismer og subdomain arkitektur af et protein.
Hele tryksystemet (pumpe og controller) er relativt kompakt og kan installeres på en standard nyttevogn for nem adgang til spektrometeret (Figur 1). Alle puls sekvenser kan bruges under tryk uden modifikation, herunder tredobbelt resonans eksperimenter. Den eneste begrænsning er, at trykvurderede zirconiarør reducerer nmr-eksperimenternes følsomhed med næsten 50% sammenlignet med et standard NMR-rør med en diameter på 3 mm. Dette kan udgøre en udfordring for proteinprøver, der ikke kan koncentreres til et højt nok niveau. Sammenlignet med andre forstyrrelser som f.eks. temperatur eller kemiske denaturanter giver hydrostatisk tryk fordelen ved med meget få undtagelser at være fuldt reversibel. Fordi tryk favoriserer dissociation af proteinkomplekser, er der for eksempel meget lille risiko for prøvesammenlægning, et problem, der ofte opstår med høje temperaturer.
Mens hydrostatisk tryk er et kraftfuldt værktøj til at studere protein stabilitet, er det vigtigt at huske på, at der ikke er nogen perfekt metode til forstyrrelser. Hver af dem fremhæver specificiteten af et proteinfrit energilandskab på en anden måde. For eksempel, hvis to kropsbygningstilstande har samme molarvolumen, vil en stigning i hydrostatisk tryk ikke ændre deres relative populationer væsentligt. Tilsvarende, hvis to kropsbygning stater har en lignende udsat overfladeareal, tilføje kemiske denaturanter ville ikke nødvendigvis øge den relative befolkning i en stat i forhold til den anden. Ideelt set bør forskellige forstyrrelsesmetoder kombineres for at opnå en komplet beskrivelse af et proteinfrit energilandskab15,24. Endelig skal det bemærkes, at selv om manuskriptet er fokuseret på trykafhængigheden af intensitet og kemiske skift fra serie af 2D 1H-15N eksperimenter målt ved ligevægt, kan en bred vifte af NMR-eksperimenter kobles til trykforstyrrelser for at sondere forskellige aspekter af stabiliteten, foldemekanismen og kropsdynamikken i proteiner og proteiner komplekser20, 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne har læst og godkendt manuskriptet. De erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Roy J. Carver Charitable Trust til Julien Roche. Vi takker JD Levengood og B. S. Tolbert for venligt at give RRM2 prøve.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
| Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
| Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |
References
- Alderson, R. T., Kay, L. E. Unveiling invisible protein states with NMR spectroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 60, 39-49 (2020).
- Korzhnev, D. M., Kay, L. E. probing invisible, low-populated states of protein molecules by relaxation dispersion NMR spectroscopy: An application to protein folding. Accounts of Chemical Research. 41, 442-451 (2008).
- Loria, P. J., Berlow, R. B., Watt, E. D. Characterization of enzyme motions by solution NMR relaxation dispersion. Accounts of Chemical Research. 41, 214-221 (2008).
- Ishima, R. CPMG relaxation dispersion. Methods in Molecular Biology. 1084, 29-49 (2014).
- Longo, D. L., et al. Chemical exchange saturation transfer (CEST): an efficient tool for detecting molecular information on proteins' behaviour. Analyst. 39, 2687-2690 (2014).
- Fawzi, N. L., Ying, J., Torchia, D. A., Clore, M. G. Probing exchange kinetics and atomic resolution dynamics in high-molecular-weight complexes using dark-state exchange saturation transfer NMR spectroscopy. Nature Protocols. 7, 1523-1533 (2012).
- Anthis, N. J., Clore, M. G. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48, 35-116 (2015).
- Roche, J., et al. Cavities determine the pressure unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6945-6950 (2012).
- Chen, C. R., Makhatadze, G. I. Molecular determinant of the effects of hydrostatic pressure on protein folding stability. Nature Communications. 8, 14561 (2017).
- Roche, J., Royer, C. A. Lessons from pressure denaturation of proteins. Journal of the Royal Society Interface. 15, 20180244 (2018).
- Xu, X., Gagné, D., Aramini, J. M., Gardner, K. H. Volume and compressibility differences between protein conformations revealed by high-pressure NMR. Biophysical Journal. 120, 924-935 (2021).
- Akasaka, K., Li, H. Low-lying excited states of proteins revealed from non-linear pressure shifts in 1H and 15N NMR. Biochemistry. 40, 8665-8671 (2001).
- Akasaka, K. Probing conformational fluctuation of proteins by pressure perturbation. Chemical Reviews. 106, 1814-1835 (2006).
- Kitahara, R., Yokoyama, S., Akasaka, K. NMR snapshots of a fluctuating protein structure: ubiquitin at 30 bar-3 kbar. Journal of Molecular Biology. 347, 277-285 (2005).
- Roche, J., et al. remodeling of the folding free energy landscape of Staphylococcal nuclease by cavity-creating mutations. Biochemistry. 51, 9535-9546 (2012).
- Nucci, N. V., Fuglestad, B., Athanasoula, E. A., Wand, J. A. Role of cavities and hydration in the pressure unfolding of T4 lysozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13846-13851 (2014).
- Maeno, A., et al. Cavity as a source of conformational fluctuation and high-energy state: High-pressure NMR study of a cavity-enlarged mutant of T4 lysozyme. Biophysical Journal. 108, 133-145 (2015).
- Peterson, R. W., Wand, J. A. Self-contained high-pressure cell, apparatus, and procedure for the preparation of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids for nuclear magnetic resonance spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 76, 094101 (2005).
- Goddard, T. D., Kneller, D. G. Sparky 3. , University of California San Francisco. San Francisco, CA. (2010).
- Caro, J. A., Wand, J. A. Practical aspects of high-pressure NMR spectroscopy and its applications in protein biophysics and structural biology. Methods. 148, 67-80 (2018).
- Kitamura, T., Itoh, J. Reaction volume of protonic ionization for buffering agents. Prediction of pressure dependence of pH and pOH. Journal of Solution Chemistry. 16, 715-725 (1987).
- Royer, C. A. Revisiting volume changes in pressure-induced protein unfolding. Biochimica et Biophysica Acta. 1595, 201-209 (2002).
- Erlach, M. B., et al. Relationship between nonliner pressure-induced chemical shift changes and thermodynamic parameters. Journal of Physical Chemistry B. 118, 5681-5690 (2014).
- de Oliveira, G. A. P., Silva, J. L. A hypothesis to reconcile the physical and chemical unfolding of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States of America. 112, 2775-2784 (2015).
- Nguyen, L. M., Roche, J. High-pressure NMR techniques for the study of protein dynamics, folding and aggregation. Journal of Magnetic Resonance. 277, 179-185 (2017).
