Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

إنشاء نظام إيكولوجي للأخطبوط لأبحاث الطب الحيوي والهندسة الحيوية

Published: September 22, 2021 doi: 10.3791/62705
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Neuroengineering division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 3Biomedical Imaging division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 4Department of Radiology, Michigan State University

Summary

يمكن أن يؤثر فهم الهياكل الفسيولوجية والتشريحية الفريدة من الأخطبوط بشكل كبير على البحوث الطبية الحيوية. يوضح هذا الدليل كيفية إنشاء وصيانة بيئة بحرية لاستيعاب هذا النوع ويتضمن أحدث أساليب التصوير والتحليل لتصور تشريح الجهاز العصبي والأخطبوط ووظيفته.

Abstract

وقد استلهمت العديد من التطورات في البحوث الطبية الحيوية من خلال اكتشاف الآليات التشريحية والخلوية التي تدعم وظائف محددة في أنواع مختلفة. الأخطبوط هو واحد من هذه الحيوانات الاستثنائية التي أعطت العلماء رؤى جديدة في مجالات علم الأعصاب والروبوتات والطب التجديدي والأطراف الاصطناعية. تتطلب الأبحاث التي أجريت مع هذا النوع من السيفالوبودات إنشاء مرافق معقدة وعناية مركزة لكل من الأخطبوط والنظام البيئي الخاص به وهو أمر بالغ الأهمية لنجاح المشروع. يتطلب هذا النظام أنظمة تصفية ميكانيكية وبيولوجية متعددة لتوفير بيئة آمنة ونظيفة للحيوان. وإلى جانب نظام التحكم، يلزم إجراء الصيانة والتنظيف الروتينيين المتخصصين للحفاظ على تشغيل المرفق على المدى الطويل. وينصح بتوفير بيئة غنية لهذه الحيوانات الذكية من خلال تغيير المناظر الطبيعية للخزان، ودمج مجموعة متنوعة من الفريسة، وإدخال مهام صعبة بالنسبة لهم للعمل من خلال. وتشمل نتائجنا التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير الذاتي للجسم كله، فضلا عن الدراسات السلوكية لفهم أفضل للجهاز العصبي. الأخطبوط تمتلك علم وظائف الأعضاء الفريدة التي يمكن أن تؤثر على العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية. إن تزويدهم بنظم إيكولوجية مستدامة هو الخطوة الحاسمة الأولى في الكشف عن قدراتهم المتميزة.

Introduction

وغالبا ما تكون المفاهيم الجديدة في البحوث الطبية الحيوية والهندسة الطبية الحيوية مستوحاة من تحديد استراتيجيات محددة تمتلكها الأنواع البيولوجية لمعالجة الظروف والتحديات البيئية والفسيولوجية. فعلى سبيل المثال، أدى فهم خصائص الفلورسينس في اليراعات إلى استحداث أجهزة استشعار فلورية جديدة يمكنها الإبلاغ عن النشاط الخلوي في كائنات نموذجية أخرى(1)؛ وقد أدى تحديد القنوات الأيونية التي ينشطها الضوء في الطحالب إلى تطوير التشكيل الخلوي والزمني المحدد للضوء والعصبي2،3،4،5؛ اكتشاف البروتينات في سمك السلور الزجاجي التي تبحر وفقا للمجال المغناطيسي للأرض أدى إلى تطوير التعديل المغناطيسي العصبي6,7,8,9,10,11; فهم منعكس سيفون في Aplysia كان له دور فعال لفهم الأساس الخلوي للسلوك12,13,14.

يواصل الباحثون التوسع في صندوق أدوات الهندسة الحيوية والحيوية الحالي من خلال الاستفادة من نقاط القوة الفريدة ووجهات النظر الجديدة حول الوظائف الفسيولوجية التي تحتفظ بها أنواع المختبر غير التقليدية. وقد بدأت الوكالات الاتحادية في دعم خطوط الدراسات هذه من خلال تمويل الأعمال الجديدة التي أجريت على أنواع متنوعة.

جنس واحد من الحيوانات مع التشريح فريدة من نوعها وقدرات التجديد، فضلا عن السيطرة التكيفية لكل من ذراعيها، وعلماء الأحياء والمهندسين رائعة، والجماهير آسر من كل جزء من المجتمع هو Octopus17. في الواقع، تمت دراسة العديد من جوانب فسيولوجيا الأخطبوط وسلوكه على مدى العقود الماضية15،16،17،18،19،20،21،22،23،24،25،26 . ومع ذلك، فإن التطورات الأخيرة في البيولوجيا الجزيئية والتطورية، والروبوتات، وتسجيل الحركة، والتصوير، والتعلم الآلي، وعلم الفيزيولوجيا الكهربية تسرع الاكتشافات المتعلقة بعلم وظائف الأعضاء والسلوك الأخطبوط وتترجمها إلى استراتيجيات مبتكرة للهندسة الحيوية27،28،29،30،31،32،33،34،35 36,37,38,39.

هنا نحن نصف كيفية إعداد وصيانة تربية الأخطبوط ، والتي ستكون ذات أهمية وأهمية للعلماء والمهندسين من خلفيات مختلفة ، والمصالح العلمية ، والأهداف. ومع ذلك، تركز نتائجنا على تطبيق الأخطبوط في أبحاث علم الأعصاب والهندسة العصبية. الأخطبوط لديه جهاز عصبي متطور للغاية مع 45 مليون خلية عصبية في الدماغ المركزي، و 180 مليون خلية عصبية في الفصوص البصرية، و 350 مليون خلية عصبية إضافية في الحبال المحورية الثمانية والعصابات الطرفية. على سبيل المقارنة ، لديه عدد مماثل من الخلايا العصبية والقط فقط نصف ذلك40. على عكس الجهاز العصبي الفقاري ، لا يوجد سوى ألياف 32K فوثر و 140K afferent التي تربط الملايين من الخلايا العصبية في دماغ الأخطبوط بملايين الخلايا العصبية في كل من الحبال المحورية لذراعهم40،41،42. تشير هذه الألياف المترابطة القليلة نسبيا إلى أن معظم تفاصيل تنفيذ البرامج الحركية يتم إجراؤها في الحبل المحوري نفسه ، مع التأكيد على التحكم العصبي الموزع بشكل فريد الذي تمتلكه الأخطبوطات. أذرع الأخطبوط لديها مراقبة السيارات الدقيقة غير عادية تمكنهم من مهارات التلاعب مثل فتح أغطية جرة، حتى عندما تكون داخل الحاوية. هذه القدرة الحركية المتطورة للغاية هي فريدة من نوعها لفئة السيفالوبودات (الأخطبوط والحبار والحبار)43.

في الواقع ، من خلال مئات الملايين من السنين من التطور ، طور الأخطبوط جينوما رائعا ومتطورا ونظاما فسيولوجيا4344 ألهم تطورا وتقدما جديدا عبر المجالات العلمية والهندسية. على سبيل المثال ، يمكن أن تلتصق رقعة لاصقة مقاومة للماء استنادا إلى البنية التشريحية لمصاصي الأخطبوط بالأسطح الرطبة والجافة45 ؛ يمكن لمواد التمويه الاصطناعية المستوحاة من جلد الأخطبوط المموه تحويل سطح مسطح ثنائي الأبعاد إلى سطح ثلاثي الأبعاد مع نتوءات وحفر46. مصغرة الروبوتات لينة ومستقلة (أي، Octobots) التي يمكن أن تكون في المستقبل بمثابة أدوات جراحية داخل body47؛ كما تم تطوير ذراع (أي OctoArm) تعلق على robot48 مثل دبابة. وتستخدم أنواع كثيرة من الأخطبوط في البحوث الطبية الحيوية على سبيل المثال، الأخطبوط فولغاريس، الأخطبوط سينينسيس، الأخطبوط فاريابيليس، والأخطبوط bimaculoides (O. bimaculoides)؛ وO. vulgaris وO. bimaculoides كونها الأكثر شيوعا34,49,50. التسلسل الأخير لجينوم الأخطبوط المختلفة يجعل هذا الجنس من أهمية خاصة ويفتح آفاقا جديدة في البحوث الأخطبوط34,43,51,52.

O. bimaculoides المستخدمة في إعداد لدينا هو نوع متوسط الحجم من الأخطبوط، اكتشفت لأول مرة في عام 1949، التي يمكن العثور عليها في المياه الضحلة قبالة ساحل شمال شرق المحيط الهادئ من وسط كاليفورنيا إلى جنوب شبه جزيرة باخا كاليفورنيا17. يمكن التعرف عليه من خلال بقع العيون الزائفة على عباءته تحت عينيه. بالمقارنة مع الأخطبوط المحيط الهادئ العملاق (Enteroctopus dofleini) والأخطبوط المشترك (O. vulgaris) ، فإن الأخطبوط ذو البقعتين في كاليفورنيا (O. bimaculoides) صغير الحجم نسبيا ، بدءا من أصغر من بضعة سنتيمترات ، وينمو بسرعة كحدث. عندما تثار داخل المختبر، يمكن أن ينمو حجم عباءة الكبار إلى متوسط حجم 100 سم وتزن ما يصل إلى 800 g53،54. الأخطبوط لديها فترة نمو سريع خلال أول 200 يوم. بحلول ذلك الوقت ، يعتبرون بالغين ويستمرون في النمو طوال بقية حياتهم55،56،57. الأخطبوط يمكن أن يكون أكل لحوم البشر، وخصوصا عندما يتم إيواء كلا الجنسين معا داخل دبابة. لذلك، فإنها تحتاج إلى أن يسكن بشكل فردي في خزانات منفصلة58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ولاية ميشيغان.

1. معدات خزان الأخطبوط انشاء

  1. أولا، الحصول على جميع المواد غير البيولوجية لحوض السمك الذي سيتم دمجه في النظام البيئي البحري، كما هو مبين في جدول المواد. يتم توفير الأحجام في بوصة.
  2. اغسل جميع أجزاء نظام الأنابيب والأنابيب والفلاتر باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ ومياه deionized (DI) قبل التركيب. لا تستخدم الصابون أو أي مواد كيميائية أخرى عند التنظيف.
  3. ضع جدول الألياف الزجاجية 13 بوصة × 49 بوصة × 1/2 بوصة (الجزء # 71) مع أربعة أرجل الجدول مصنوعة من ألياف الكربون ومع أبعاد 2 بوصة × 2 بوصة × 23 بوصة (الجزء # 72). إرفاق الساقين مباشرة تحت زوايا الطاولة.
  4. تحت السطح العلوي، بين كل من الساقين الجدول، ضع 2 بوصة × 2 بوصة طويلة (الجزء # 72) أقواس تثبيت ألياف الكربون تعلق على الجانب السفلي من الجدول ومباشرة ضد حافة الرف العلوي. نعلق مع مسامير رف آخر مع نفس الأبعاد مباشرة على الأرض تحت الطاولة. دع المضخة (انظر جدول المواد) تجلس مباشرة على سطح الرف السفلي بينما يجلس الخزان على السطح العلوي. يظهر هذا النظام في الشكل 1.
    ملاحظة: إخراج المياه من الخزان هو تغذية الجاذبية وجميع الأنابيب، باستثناء تلك التي تتغذى داخل وخارج الخزان، تحتاج إلى أن تكون أقل من الجزء السفلي من الخزان لضمان أقصى ضغط رأس الصرف الصحي.

Figure 1
الشكل 1: إعداد خزان الأخطبوط. مدخل المياه ومنفذ (أ). ثلاثة خزانات الأخطبوط مع كل مساحة 1.22 م × 0.3 م (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. حفر حفرة واحدة 1 بوصة، 2 بوصة من أحد جانبي الخزان، وذلك باستخدام قطع الزجاج حفر بت. سيحدد الجزء السفلي من شاشة شفط إخراج المياه ارتفاع ثقب الإخراج كما هو موضح على الجانب الأيمن من الشكل 2a. سيتم تحديد مستوى المياه بواسطة شاشة الشفط، وسوف تحتاج إلى أن تكون على الأقل 6 بوصات من أعلى الخزان مما يسمح لمنطقة دفقة المياه.
  2. استخدام التمهيدي PVC والاسمنت لربط الأقسام بشكل دائم. للقيام بذلك، أولا، الشريحة نهاية أنبوب PVC الذكور المقصود في نهاية أنبوب أنثى. ضع شريطا للرسامين على الجزء الخارجي من الجزء الذكري الذي لا يزال مرئيا لمنع التمهيدي والاسمنت من الظهور على السطح الخارجي للأنبوب. فصل الأجزاء بعد تسجيل ووضع معطف خفيف من التمهيدي على السطح الخارجي للأنبوب الذكور بعد تطبيق الاسمنت في نفس المنطقة.
  3. تجديد أنبوب الذكور في أنبوب الإناث، في أقرب وقت ممكن، بعد تطبيق الاسمنت وإزالة الشريط. 24 ساعة بعد تطبيق التمهيدي والاسمنت، وغسل الأجزاء المتصلة حديثا مع المياه DI. لعلاج الوقت ننظر في المنتج الاسمنت لمزيد من الاتجاهات.
    ملاحظة: تأكد من إعداد جميع الأنابيب والمعدات يتم وضعها بشكل صحيح قبل استخدام التمهيدي PVC والاسمنت; قد تختلف متطلبات طول الأنبوب.
  4. بعد ذلك، قم بتوصيل نهاية القطر الخارجي (OD) قطرها 1 بوصة (OD) بشكل دائم بطرف القطر الداخلي (ID) مقاس 1 بوصة لمفصل الكوع. ربط نهاية مفصل الكوع إلى أنابيب PVC مستقيم (1 بوصة OD). قم بتوصيل الجانب الآخر من الأنابيب المستقيمة ثم بالم معرف بوصة واحدة من توصيل مأخذ توصيل أنثى المحول المستقيم عبر الجدار.
    ملاحظة: يشير معرف إلى المسافة الأوسع بين الجدران الداخلية للأنبوب. OD يشير إلى خارج عرض الأنابيب.
  5. قم بتوصيل المحول المستقيم من خلال الجدار بشكل دائم بأنبوب PVC مستقيم بطول 4 بوصات مع OD بوصة واحدة (من الخطوة 1.8). هذا الأنبوب سيواجه خارج الخزان
  6. قم بتوصيل الأنبوب المستقيم بشكل دائم بمركز موصل PVC (1 بوصة ID Tee على شكل؛ من الخطوة 1.9). بعد ذلك، قم بتوصيل أنابيب بطول 6 بوصات (الجزء رقم 69) (1 بوصة OD) بشكل دائم بكلا الطرفين المعاكسين لموصل نقطة الإنطلاق-واحد المواجه مباشرة لإطلاق الهواء والآخر لأسفل مباشرة لتدفق المياه.
  7. قم بتوصيل الأنبوب المستقيم الممتد لأسفل بشكل دائم (من الخطوة 1.10) إلى أنبوب شائك مقبس أنثى (معرف 1 بوصة) مستقيم. إرفاق أنبوب مطاطي بطول 36 بوصة (معرف 3/4 بوصة) إلى محول الأنابيب الشائكة.
  8. وضع نظام التبريد بين أنابيب إخراج المياه ونظام مستنقع.
  9. إرفاق التجهيزات بارب 3/4 بوصة، التي تأتي مع النظام، إلى منافذ المدخلات والمخرجات وحدة المبرد. وضع أنابيب المطاط (من الخطوة 1.11) على مدخل المناسب للمبرد.
  10. قم بتوصيل قطعة جديدة من أنابيب ID مقاس 3/4 بوصة (من الخطوة 1.13) من إخراج المبرد (من الخطوة 1.12) إلى مدخل نظام sump كما هو موضح في الشكل 2b.
  11. بعد ذلك، ضع مرشح جورب مقاس 4 بوصات × 12 بوصة، بحجم مسام 200 ميكرومتر، في المنطقة المحددة له كما هو موضح في الشكل 2. أيضا، كما هو مبين في الشكل 2، وضع مقشط البروتين ومضخة العودة إلى المناطق المناسبة. جنبا إلى جنب مع مضخة العودة، نعلق أعلى التلقائي قبالة صمام تعويم إلى الجدار الداخلي لمنطقة المضخة، 2 بوصة فوق الجزء العلوي من مدخل المياه للمضخة. لا تمنع المضخة من إزالتها من الخزان، إذا لزم الأمر.
  12. قم بتوصيل أنبوب مستقيم بطول 12 بوصة (3/4 بوصة OD) بمأخذ المضخة بشكل دائم (من الخطوة 1.15). على الطرف الآخر من أنبوب 3/4 بوصة OD مستقيم, ربط دائم OD أنبوب إلى 3/4 بوصة معرف 45° مفصل الكوع. إلى الطرف الآخر من المفصل، قم بتوصيل أنابيب OD 3/4 بوصة بشكل دائم.
  13. إرفاق الطرف الآخر من أنبوب مستقيم (من الخطوة 1.16) إلى معرف 3/4 بوصة من محول الحد على التوالي. قم بتوصيل نهاية المحول الأكبر (2 بوصة OD) بشكل دائم بإدخال ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
    ملاحظة: قد تختلف أطوال الأنابيب المستقيمة.
  14. بعد ذلك، تطابق وضع مدخل ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع أنبوب إخراج المضخة (من الخطوة 1.17) بحيث لا ينحني الأنبوب بين الضوء والمضخة (من الخطوة 1.15). حفر ثقوب في دعامة الاستقرار لتتناسب مع ثقوب مرفق ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تطابق حجم مسامير مع بت الحفر وإرفاق ضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى الجدول باستخدام مسامير معينة.
  15. قم بتوصيل الجانب 2 بوصة من محول تخفيض آخر إلى إخراج ضوء الأشعة فوق البنفسجية (من الخطوة 1.18). إرفاق OD 1 بوصة من أنبوب مستقيم 5 بوصة طويلة إلى معرف محول 1 بوصة. بعد ذلك، قم بتوصيل قطعة الزاوية 90 درجة مع معرف 1 بوصة إلى أنبوب OD 1 بوصة; يكون الطرف غير مرتبط من قطعة الزاوية مشيرا نحو جانب الخزان حيث يهدف إلى إدخال المياه للذهاب (نفس الجانب كما هو الحال في الخطوة 1.5).
  16. قم بتوصيل الطرف الآخر من الزاوية (من الخطوة 1.19) إلى أنبوب طوله 6 بوصات (الجزء رقم 69) بعد 1 بوصة OD مع إدخال وحدة التحكم في التدفق (الجزء رقم 2). توصيل أنبوب OD آخر 1 بوصة (الجزء رقم 69) بشكل دائم إلى إخراج وحدة مراقبة التدفق؛ يجب أن يمتد طول ما لا يقل عن 3 بوصات وراء جانب الخزان.
  17. باستخدام 13/4 بوصة الزجاج قطع حفر بت (الجزء # 1) ، وقطع حفرة جديدة 3 بوصات فوق خط المياه المقصود و 2 بوصة بعيدا عن جانب الخزان (الشكل 1a) على الجانب المقابل لواحد وجود حفرة إخراج المياه. إرفاق آخر من خلال الجدار تركيب الحاجز مع زلة 1 بوصة (الجزء # 77) التي تواجه للخروج من الخزان.
  18. إلى زلة الجزء الأكبر توصيل أنبوب مستقيم مع 1 بوصة OD وطول 4 بوصات (الجزء # 69) بشكل دائم. خفض أنابيب من الجزء الأخير من الخطوة 1.21 لتتناسب مع المسافة التي تمتد هذه الأنابيب من الخزان. قم بتوصيل أنبوب 90 درجة (الجزء رقم 65) بشكل دائم بكل من الأنابيب المفتوحة وقطع أنبوبا مستقيما آخر 1 بوصة (الجزء رقم 69) يربط القطعتين الركنية بشكل دائم.
    ملاحظة: يظهر الشكل 3 تمثيل بسيط لنظام حوض السمك.
  19. قم بإعداد بقية نظام التحكم (الجزء رقم 34)، ثم قم بتركيب شريط الطاقة (الجزء رقم 53) أولا إلى الطاولة نفسها أو إلى جدار قريب. بجانبه جبل وحدة رصد السوائل (الجزء رقم 2).
  20. قم بتوصيل مستشعر التدفق وشريط الطاقة وأجهزة استشعار الكشف عن التسرب بالوحدة. إعداد ضوء النمو (الجزء رقم 26) المرفق بسلة الطحالب (الشكل 2).
  21. قم بتوصيل مستشعر التدفق وضوء الأشعة فوق البنفسجية وضوء النمو والمضخة ومكشط البروتين إلى شريط الطاقة. إعداد نظام التحكم في المياه البرمجة وفقا لدليل الشركة المصنعة.
  22. إعداد المياه المالحة عن طريق خلط نصف كوب من مزيج الملح المتاحة تجاريا مع 1 غالون من التناضح العكسي (RO) أو deionized (DI) المياه. جعل 45 غالون لملء كامل خزان واحد ونظام مستنقع.
  23. قم بتشغيل المضخة داخل وحدة تحكم تدفق نظام sump والحفاظ على إضافة المياه المالحة حتى يكون صمام إيقاف التشغيل التلقائي في وضع إيقاف التشغيل بحيث لا يلزم وجود مياه عذبة إضافية.
  24. بمجرد أن يمتلئ الماء، توقف عن تعبئة وحدة تقشعر لها الأبدان المياه لتشغيل لتعيين درجة الحرارة بين 18 درجة مئوية إلى 22 درجة مئوية لأن هذا هو نطاق درجة الحرارة المفضل53. بدوره على مقشط البروتين.
  25. إضافة 30 كجم من المرجان سحقت إلى الجزء السفلي من الخزان، فضلا عن طبقة من المرجان سحقت إلى الجزء السفلي من بن الطحالب. إضافة في الصخور الحية متعددة وأي إضافات أخرى إلى بيئة الأخطبوط. ضع أعلى لتغطية فتح الخزان.
    ملاحظة: الصخور الحية هي المرجان الميت التي يسكنها الحياة البحرية العيانية مثل البكتيريا والطحالب.
  26. إضافة البكتيريا nitrifying المستخدمة في أحواض المياه المالحة وفقا لتوجيهات على التعبئة والتغليف. استمر في إضافة هذا وفقا لتوجيهاتك، مع التحقق من درجة الحرارة والملوحة ودرجة الحموضة والأمونيا والنتريت والنترات يوميا مع مجموعات اختبار المياه ومستشعر درجة الحموضة ومستشعر درجة الحرارة. القيم الآمنة للأمونيا والنتريت ومستويات النترات أقل من 0.5 ppm و0.25 ppm و10 ppm على التوالي58.
  27. تأكد من إيقاف تشغيل الأشعة فوق البنفسجية للأيام التي يتم فيها إضافة البكتيريا المثيرة للسماح للكائنات الحية الدقيقة في المياه المالحة بالنمو. بعد المعلمات ضمن نطاقات آمنة، يمكن إعادة تنشيط ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
  28. بعد إنشاء النظام، تحقق أيضا من أن رقم الحموضة والأوكسجين هو في 8.0-8.4 و Equation 159، على التوالي. قبل إضافة أي إلى الحوض، تحقق من وجود أي مستويات النحاس والأوكسجين داخل النظام باستخدام عدة اختبار المياه النحاس.
    ملاحظة: النحاس يسبب تلفا لللافقاريات ويتداخل مع التناضح في الخياشيم السمكية60,61.
  29. إذا تم العثور على النحاس في الماء، واختبار مصدر المياه DI / RO. بعد التأكد من أن مصدر المياه لا يحتوي على النحاس، قم بتغيير الماء بنسبة 30٪ ووضع كتلة الكربون المنشطة (الجزء رقم 46) داخل الماء. إذا استمرت المشكلة، قم بتغيير المياه بالكامل وانظف جميع الأجزاء.
  30. بعد تحديد جميع معلمات المياه لتكون ضمن مستويات آمنة، إضافة 10 الروبيان شبح في النظام قبل أسبوع على الأقل من إضافة الأخطبوط. وهذا سوف يساعد على إدخال الكتلة الحيوية للبكتيريا وتشير إلى نوعية المياه بشكل عام.
  31. إضافة سكان النظام الإيكولوجي الحوض إضافية إلى بن الطحالب. وهذا يشمل Chaetomorpha spp. (الطحالب السباغيتي)، Trochus Sp. (الحلزون trochus النطاقات) ، ومرتزقة Mercenaria (المحار الكرز).

Figure 2
الشكل 2: نظام سومب. عرض جانبي لنظام sump (أ). أعلى عرض لنظام مستنقع (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: حوض السمك مع نظام تصفية مستنقع تحت الخزان ووحدات التحكم البيئي. تشير الأسهم الخضراء إلى اتجاه تدفق المياه عبر النظام. المياه المتدفقة من القسم الأول إلى القسم الثاني لالتبريد وعلى ثلاثة لفصل المادة البيولوجية الثقيلة عن المادة الأخف وزنا. تطفو النفايات الثقيلة إلى الأسفل والخروج إلى القسم الخامس بينما تتدفق المادة البيولوجية الأصغر إلى فلتر الجوارب داخل القسم الرابع. تتدفق المياه من أربعة تحت القسم الخامس تدخل مقشط البروتين في ستة لإزالة النفايات المتبقية داخل الماء. بن الطحالب يحتوي على الكائنات الحية الدقيقة لكسر النفايات والأمونيا والنترات، فضلا عن أكسجين المياه. في الجزء الأخير من النظام، يتم إضافة المزيد من المياه لحساب التبخر قبل ضخها مرة أخرى إلى الخزان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. صهاريج التخزين

  1. قم بإعداد خزانين طويلي القامة لتخزين المياه سعة كل منهما 60 جالونا، أحدهما للمياه المالحة والآخر لمياه RO. تأكد من أن خط التعبئة الأقصى لخزان المياه العذبة أطول من الجدول. إرفاق أنابيب 1/4 بوصة إلى أعلى التلقائي للصمام تعويم في نظام مستنقع وإرفاق الطرف الآخر من أنابيب إلى الجزء السفلي من خزان المياه العذبة.
    ملاحظة: هذا هو لإعادة تعبئة إذا تبخر الماء. الملح سيبقى في الماء
  2. ملء خزان المياه المالحة بالماء وإضافة كمية نسبية من الملح إلى الخزان. تفرخ باستمرار خزان المياه المالحة لخلط والأوكسجين السليم. انتظر لمدة ساعة قبل الاستخدام لضمان الخلط الكامل للملح.
    ملاحظة: خزان المياه المالحة مفيد لإعادة ملء الخزانات بعد التنظيف.

3. إعداد خزان الطعام

  1. للحفاظ على الروبيان على قيد الحياة لأكثر من أسبوع، وتخزينها في خزان منفصل من الأخطبوط مع الملوحة أقل من 30 جزء في المليار ودرجة الحرارة قريبة من 25 درجة مئوية.
  2. للقيام بذلك، بعد أسبوع واحد من نضوج خزانات الأخطبوط، نقل 8 غالون من المياه المالحة الناضجة إلى خزان الروبيان. إضافة 15 كجم من المرجان سحقت إلى الجزء السفلي من الخزان. إضافة بعض الصخور الحية إلى الخزان لإخفاء البقع للذوبان (الشكل 4).
    ملاحظة: تشير مياه البحر الناضجة إلى عملية السماح للبكتيريا البحرية بالنمو داخل المياه المالحة كما هو موضح في الخطوة 1.30.
  3. إرفاق فلتر علبة إلى حافة الخزان. إعداد عامل تصفية cannister حسب توجيهات الشركة المصنعة. إضافة مضخة الهواء بجوار الخزان متصلة أنبوب مع حجر الهواء المرفقة وضعت في الخزان.
  4. تنظيف مرشح وتغيير منصات تصفية كل أسبوع. أيضا، 25٪ من المياه سوف تحتاج إلى تغيير في نفس الوقت. تحقق من النيتروجين ودرجة الحموضة ومعلمات درجة الحرارة يوميا في خزانات الطعام مع مجموعات اختبار المياه كما هو موضح في الخطوة 1.30. إذا ظلت معلمات النيتروجين المائي عالية، قم بإجراء تغييرات إضافية في المياه وأضف كيس ماصة النيتروجين إلى الماء؛ أو إذا استمرت المشاكل لأكثر من شهر، فإن الروبيان سوف تحتاج إلى نقلها إلى خزان أكبر.
  5. إضافة الروبيان بمجرد تبدد الرواسب المرجانية المسحوقة. لإضافة الروبيان أولا، عند الوصول، نقل الروبيان دون شحن المياه إلى خزان المياه المالحة الصغيرة لمدة 5 دقائق لإزالة الواست الحيوي. ثم، يمكن إضافة الروبيان مباشرة إلى الخزان. يمكن إضافة أسماك البعوض عند الوصول مباشرة إلى خزان الروبيان.
    ملاحظة: يمكن شراء الجمبري وسمك البعوض من أي مورد تجاري حيواني حي مدرج في ورقة المواد أو موردي الأغذية الآخرين. ومن الممكن أيضا أن نقدم الأخطبوط الجمبري المذاب.
  6. إطعام الروبيان والأسماك مع رقائق السمك، والنباتات الميتة، أو algae62، وفقا لتوجيهات تعليمات الغذاء.
  7. لخزان السلطعون، أضف جالون واحد من المياه المالحة و10 كجم من الحصى. كومة الحصى على جانب واحد ترك الأراضي الجافة على جانب واحد و 2 سم من المياه المالحة على الجانب الآخر (كما لوحظ في الشكل 4). وينبغي أن تكون بارامترات المياه البيئية المثلى لهذه اللافقاريات 30-35 جزء في المليار و22-25 درجة مئوية للملوحة ودرجة الحرارة1163 على التوالي.
  8. إضافة سرطانات عازف الكمان مباشرة إلى الخزان (الشكل 4). سوف السرطانات قضاء معظم حياتهم على الأرض ولكن يمكن أن تكون تحت الماء لبضعة أيام في وقت واحد، مما يجعل الخزان الذي هو تحت الماء جزئيا حاسمة لبقائهم على المدى الطويل.
  9. تغذية السرطانات عازف الكمان مرة واحدة في اليوم عن طريق إضافة رقائق السمك في الطبق على المنطقة الجافة من الخزان. تنظيف أسبوعيا عن طريق إزالة السرطانات وتغيير 100٪ من المياه المالحة. نظف الحصى
  10. تخزين الرخويات البحرية ثنائية الصمام (المحار وبلح البحر) داخل خزانات المياه المالحة للأخطبوط لفتح أنفسهم وتوفير آلية أخرى لتصفية المياه64.
  11. ضع بلح البحر داخل خزان منفصل غير مأهول للأسبوع الأول لتجنب وضع حمولة نفايات غير ضرورية على نظام تصفية خزان الأخطبوط.
    ملاحظة: في حين أن بلح البحر كان الغذاء الأخطبوط المفضل، هم أكثر عرضة للموت بعد وقت قصير من وصوله، وسوف تزيد بشكل كبير من النفايات البيولوجية داخل الخزان إذا كانت موجودة بكميات كبيرة.

4. إدخال الأخطبوط إلى الخزان

  1. تأكد من أن مستويات الأمونيا والنتريت والنترات أقل من 0.5 في الدقيقة و0.25 في الدقيقة و10 في الدقيقة على التوالي. لديك مضخة المياه اليدوية المتاحة لإزالة الحبر الأخطبوط من الخزان. من المستحسن أيضا أن يكون شخصين لهذا الإجراء.
  2. عند الوصول، ضع الحقيبة على الميزان واطرح وزن الحقيبة بعد إزالة الأخطبوط. إضافة حجر الهواء إلى كيس لزيادة الأوكسجين المياه أثناء نقل الحيوان إلى خزان بهم. قياس درجة حرارة مياه الشحن والملوحة. تسجيل حالات المرض لفترات طويلة بعد الشحن.
    1. دون نقل أي ماء من الحقيبة إلى الخزان، حقيبة النقل فوق زاوية الخزان مع الكيس المغمور جزئيا في مياه الخزان للبدء في تغيير درجة حرارة حقيبة النقل. إزالة 10٪ من الماء من كيس وتفريغ أسفل الحوض. إضافة نفس الكمية من الماء من الخزان إلى الحقيبة. كرر كل 10 دقيقة حتى درجة حرارة الماء في الحقيبة لا يزيد عن 1 درجة مختلفة عن درجة حرارة الماء في الخزان.
    2. بمجرد أن يكون الفرق في درجة الحرارة للكيس والصهريج في حدود 1 درجة ، تأكد من ارتداء قفازات لنقل الأخطبوط إلى خزانها الفردي. للتحرك، ضع كلتا يديه تحت الأخطبوط لتقديم الدعم أثناء النقل. الشخص الثاني سوف تحتاج إلى سحب بلطف الذراعين شفط من جانب الحقيبة.
    3. بمجرد أن يخرج الأخطبوط من الحقيبة ، قم بتحريكه بسرعة إلى مياه موطنه الجديد الذي ينقل أقل قدر ممكن من الماء من كيس الشحن. استخدم المضخة اليدوية لإزالة أي حبر يطلقه الأخطبوط عندما يكون في الخزان. الآن وزن الحقيبة مع الماء للحصول على الوزن التقريبي للحيوان.
  3. خلال الأسبوعين الأولين بعد الوصول، راقب الاستهلاك اليومي للأخطبوط الذي يجب أن يكون حوالي 4٪ إلى 8٪ من وزنه58,65,66. يجب فحص الأخطبوط أربع مرات في اليوم. ويمكن أن ينخفض هذا إلى مرتين في اليوم الواحد بعد 2 أسابيع. تزن كل أسبوعين لضبط استهلاكها الغذائي حسب الحاجة.
    ملاحظة: من المعروف أن بعض أنواع الأخطبوط تهرب من خزانها ، لذلك من المستحسن وضع وزن 2.5 كجم على غطاء خزانها.

5. الرعاية اليومية

  1. باستخدام مجموعة اختبار المياه المالحة المتاحة تجاريا لhh، الأمونيا، النتريت، والنترات، إضافة كمية موجهة عدة من مياه الخزان إلى أنابيب الاختبار الأربعة المقدمة مع عدة. كما هو محدد في عدة الاختبار، إضافة كمية من التفاعل colorimetric إلى أنبوب المقابلة.
  2. إذا كانت مستويات الأمونيا والنتريت والنترات أعلى من 0.5 جزء في المليون و0.25 جزء في المليون و10 جزء في المليون على التوالي، فاغسل الكتلة الحيوية من فلتر الجوارب أو قم بتغييرها إلى فلتر جورب جديد. بالإضافة إلى ذلك، تنظيف الكتلة الحيوية من الجزء العلوي من كاشطة مع فرشاة وإضافة البكتيريا denitrifying إضافية إلى الخزان. إذا استمرت المشاكل، ثم استبدال 25٪ من المياه المالحة الطازجة.
    ملاحظة: تقلل الخطوات المذكورة أعلاه من مركبات النيتروجين داخل النظام البيئي.
  3. إزالة جميع جثث سرطان البحر والجمبري الميت من الخزان وكذلك أي البراز الأخطبوط باستخدام مضخة يدوية. إزالة جميع السرطانات الحية المتبقية من الخزان ونقلها مرة أخرى إلى خزان. بعد ذلك، أعد ترتيب الأجسام الكبيرة داخل الخزان.
  4. أدخل نصف عدد السرطانات التي سيأكلها الأخطبوط يوميا إلى الخزان الذي يزن 1.25 +/- 0.25 غرام. إطعام الروبيان المذاب أو سرطان البحر الذكور الصغيرة لأخطبوط الأحداث. اعتمادا على التجربة، يمكن إدخال السرطانات والروبيان في أي مكان في الخزان أو إلى الأخطبوط مباشرة.
    ملاحظة: الأخطبوط الاستهلاك الغذائي اليومي هو 4٪ -8٪ من وزنهم67. كما يمكن توفير الروبيان المجمد كمصدر غذائي على أساس وزن الأخطبوط.
  5. تقدم خمسة جمبري شبح يوميا. في المتوسط، تم استهلاك ثلاثة في هذه التجربة. لتوفير مجموعة متنوعة من الطعام للأخطبوط، وإعطاء البطلينوس الحية واحدة أو بلح البحر مرة واحدة في الأسبوع والحفاظ دائما على ثلاثة أسماك البعوض داخل الخزان.
    ملاحظة: إعطاء الحيوانات مجموعة متنوعة من المواد الغذائية غير مطلوب ويمكن أن يمنع الحيوانات من إغراء الطعام أثناء التجارب. جدول التغذية المستخدم هنا لمراقبة تغذية الأخطبوط وسلوكه هو إدخال نصف عدد السرطانات على أساس الوزن وزيادة عدد الروبيان إلى خمسة في الصباح. في المساء، أدخل النصف الثاني من السرطانات إلى الخزان.

6. الصرف الصحي الأسبوعي

  1. إيقاف كاشط، مضخة، والطحالب بن أضواء قبل تنظيف نظام مستنقع. ثم قم بإيقاف تشغيل الصمام التلقائي للنظام قبل إزالة الماء. وأخيرا، إزالة كاشطة وجميع المياه فقط من نظام مستنقع.
  2. فرك طفيفة بن الطحالب لإزالة معظم الكتلة الحيوية من جدرانها. تنظيف بقية منطقة مستنقع مع فرشاة. إزالة فلتر جورب، وتنظيف مع الخل، والسماح لها الجافة. تدوير مع مرشح جورب آخر كل أسبوع استبدال بأخرى جديدة كل ثلاثة أشهر. إزالة وتنظيف الكتلة الحيوية من أعلى كاشطة أسبوعيا.
    ملاحظة: تجنب استخدام المعدن لتنظيف البلاستيك لأنه سيخلق خدوش يمكن أن تكون عرضة للنمو الميكروبي.
  3. وضع كاشطة مرة أخرى في النظام والبدء في إعادة ملء مع المياه المالحة. عندما تبدأ منطقة المضخة في التعبئة ، يمكن تشغيل جميع الأنظمة مرة أخرى. توقف عن إضافة الماء عندما يكون الجزء العلوي التلقائي من صمام التعويم في وضع إيقاف تشغيله.

Figure 4
الشكل 4: خزان لسرطانات الكمان (Minuca pugnax). الجزء السفلي من الخزان نصف مخصص للسرير الجاف والنصف الآخر ل2 سم من المياه المالحة الضحلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: خزان للجمبري الشبح (Palaemonetes paludosus). الصخور في خزان الروبيان توفر أماكن للجمبري للاختباء والسكب وكذلك لنمو الكائنات الحية الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

7. رعاية الحيوانات غير الصحية

  1. اتبع الدليل reference66 لتقييم العافية الأخطبوط.
    ملاحظة: بالنسبة للأخطبوطات الأنثوية، تبدأ دورة الحياة عادة بعد وضع البيض. سيبدأ الحيوان في تقليل استهلاك الطعام وسيتوقف عن تناول الطعام تماما وسيصبح أكثر الخمول. يختلف العمر بعد عملية نهاية العمر. لا يمكن اتخاذ أي إجراء آخر باستثناء إطعام الحيوان ومراقبته. الذكور Senescent سوف يقلل من استهلاك الغذاء وتصبح الخمول68.

8. تخدير الأخطبوط

  1. إجراء التخدير الأخطبوط كما هو مفصل في بتلر ستروبن وآخرون.69.
  2. احصل على حاوية 6 لترات مع غطاء طوله 15 سم على الأقل. ضع 4 لتر من الماء مباشرة من خزان الأخطبوط في الحاوية وتوفير التهوية ل4 لتر من المياه المالحة باستخدام مضخة هواء صغيرة مع حجر الهواء لنشر الأكسجين إلى بيئة المياه58.
  3. قبل إدخال الأخطبوط، أضف 1٪ EtOH إلى الحاوية. قبل التعامل مع الأخطبوط ، سجل عدد الأنفاس في الدقيقة عن طريق عد زفير الماء من سيفون.
    ملاحظة: بالنسبة للأخطبوط داخل مختبر الباحث ، فإن التنفس الأساسي هو 16-24 نفسا في الدقيقة.
  4. قبل تحريك الأخطبوط، سجل تصبغ جلد الأخطبوط ومعدل التنفس الأساسي. إزالة الأخطبوط من الخزان باستخدام نظيفة 4 لتر حاوية الفم المفتوح عن طريق مغرفة عنه مع المياه المحيطة بها.
    ملاحظة: أثناء التخدير، لا تشير معدلات التنفس بالضرورة إلى تخدير كامل.
  5. وزن الأخطبوط بينما في الحاوية، ومن ثم تحريكه عن طريق وضع كلتا يديه حول جسم الأخطبوط ورفعه. قد تكون هناك حاجة لشخص ثان لإزالة الأطراف المشفطة من جدران الحاوية.
  6. بسرعة نقل الأخطبوط في الحاوية المعدة مع 1٪ EtOH. أغلق الغطاء لمنع الهروب المحتمل.
  7. سجل تنفس الأخطبوط في الدقيقة عن طريق عد زفير الماء من سيفون في نهاية أول 5 دقائق. إذا كان التنفس لا يزال فوق خط الأساس والحيوان لا يزال يستجيب لقرصة خفيفة، إضافة إضافية 0.25٪ EtOH إلى الماء. يمكن أن تستمر إضافة الإيثانول إلى الماء إلى 3٪ كحد أقصى EtOH.
    ملاحظة: أحد المؤشرات على أن الأخطبوط فاقد الوعي هو فقدانه السيطرة على الكروماتوفوريس. في هذه الحالة الجلد يبدو أكثر شحوبا من المعتاد. وهناك مؤشر آخر هو قرصة طفيفة الذراعين واختبار ما إذا كان هناك استجابة المحرك. إذا لم يكن هناك حتى الآن أي استجابة في هذه المرحلة ، فإن الأخطبوط فاقد الوعي ، ويمكن إجراء التجارب.
  8. أثناء التخدير، راقب تنفس الأخطبوط ولونه لضمان عدم وعيه طوال مدة الإجراء. إذا بدأ الأخطبوط في الاستيقاظ أثناء الإجراء ، أضف 0.25٪ إضافية EtOH.
  9. لعكس آثار تخدير الإيثانول، نقل الأخطبوط إلى خزان جديد 4 لتر أو أكبر من المياه المؤكسيجة من خزان الاحتجاز الدائم. بمجرد عودة التنفس إلى طبيعته ، يصبح الأخطبوط نشطا ، وتعود بشرته إلى الأصباغ الطبيعية . يمكن نقلها مرة أخرى إلى خزانها.

9. القتل الرحيم الأخطبوط

  1. اتبع المعايير الدولية للقتل الرحيم الأخطبوط كما هو مفصل في فيوريتو وآخرون، مولتشانيوسكي وآخرون، وبتلر-ستروبن وآخرون 57،58،69.
  2. إعداد حاوية جديدة 6 لتر مع 4 لتر من الماء من خزان عقد الأخطبوط. مزيج في MgCl2 إلى تركيز 4٪ إلى خزان القتل الرحيم. تنفيذ الخطوات من 8.1 إلى 8.9 لتخدير الأخطبوط.
  3. نقل الأخطبوط بعد الخطوة 8.8 إلى خزان القتل الرحيم. بعد توقف التنفس، انتظر لمدة 5 دقائق وإجراء تهديب الأخطبوط أو الاحتفاظ بها في خزان القتل الرحيم لمدة 5 دقائق إضافية.

10. سلوك O. bimaculoides

  1. لا تطعم الأخطبوط في الصباح عندما يتم تدريبهم على استخدام حاوية غطاء المسمار. إعداد جهاز تسجيل كاميرا يشير إلى المنطقة المخصصة للتغذية.
  2. الحصول على أنبوب غطاء المسمار 50 مل مع ثقوب قطرها 1 ملم في جميع أنحاء السطح وسقف لتدفق المياه في جميع أنحاء الحاوية. ضع سلطعون عازف الكمان داخل الحاوية. ضع وزنا داخل الحاوية أو تعلق على الخارج حتى تبقى في الجزء السفلي من الخزان.
  3. ضع الحاوية في الجزء السفلي من الخزان داخل المنطقة المفتوحة وعلى مرأى من الأخطبوط والكاميرا. إذا لم يتم أكل السلطعون بعد 4 ساعة ، فقم بإزالتها من الأنبوب واستأنف جدول التغذية لهذا اليوم. استمر في أداء هذا التمرين يوميا.
    ملاحظة: يظهر هذا في الشكل 6 ويناقش في قسم النتائج التمثيلية.

11. التصوير بالرنين المغناطيسي الأخطبوط

ملاحظة: في السابق، تم قياس استجابات التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفية في شبكية العين الأخطبوط في الحيوانات المخدرة70. هنا، حصلنا على التصوير بالرنين المغناطيسي عالية الدقة المكانية فائقة من الجهاز العصبي الأخطبوط التي تتطلب ساعات من المسح الضوئي. وهكذا، تم تنفيذ هذا في القتل الرحيم O. bimaculoides.

  1. احصل على صور التصوير بالرنين المغناطيسي باستخدام نظام 7T. التفاف الأخطبوط في المطبخ الصف غلاف بلاستيكي كلوريد البولي فينيل للحفاظ على ترطيب الأنسجة. ضع الأخطبوط على الغلاف، واثنيه في النهايات، ثم لفه لختمه.
  2. استخدام حجم نقل / استقبال لفائف بقطر 4 سم للحصول على صور للدماغ والأسلحة متعددة. استخدم تسلسل T1 النادر المرجح مع المعلمات التالية: وقت التكرار (TR) من 1500 مللي ثانية، وقت الصدى (TE) من 20 مللي ثانية، 117 × 117 × 500 ميكرومتر دقة، 100 متوسط، عامل نادر 8. هذه هي معلمات التصوير بالرنين المغناطيسي نموذجية لتصوير أدمغة القوارض. استخدام عامل نادر يجعل التصوير أسرع، في حين يتم متوسط 100 صورة معا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء71.
  3. صورة الذراع الأخطبوط باستخدام لفائف نقل حجم 86 ملم ومجموعة 4 × 4 سم 4 قنوات تلقي لفائف. قطع ذراع باستخدام مقص الجراحية ووضعها في أنبوب مخروطي 15 مل مليئة المالحة الفوسفات المخزنة.
    ملاحظة: كان التسلسل تسلسل استرداد عكس T1_weighted (MP-RAGE) مع معلمات: TR/TE = 4000/2.17 مللي ثانية، تأخير انقلاب 1050 مللي ثانية، 100 × 100 × 500 دقة ميكرومتر، 9 متوسطات، وقت المسح الضوئي 1.5 ساعة (الشكل 7). تسلسل عكس الاسترداد يبطل الإشارة من الماء ويزيد التباين داخل الصورة؛ تم اختيار هذا التسلسل لأنه يسمح تصور التشريح الداخلي للarm72.

12. التصوير المقطعي المضان بالتبريد (CFT)

  1. فلاش تجميد الأخطبوط : العمل في غطاء محرك السيارة الدخان. تغطية الجزء السفلي من ديوار مع الجليد الجاف، ومن ثم ملء مع سداسيات. خفض ببطء الأخطبوط في سداسيات أكثر من حوالي 10 دقيقة، مضيفا سداسيات طازجة والجليد الجاف على النحو المطلوب لتغطية الأخطبوط بالكامل مع سداسيات الباردة. إبقاء الأخطبوط المجمدة في -20 درجة مئوية حتى يتم تضمينه.
  2. تضمين وقسم الأخطبوط: إنشاء قالب مستطيل من الحجم المناسب لعقد الأخطبوط باستخدام الأدوات المقدمة من الشركة المصنعة CFT. تغطية الجزء السفلي من القالب مع أكتوبر (درجة حرارة القطع الأمثل) وسائل الإعلام (المواد القياسية المستخدمة في مختبرات الأنسجة) والسماح لها تجميد إلى هلام شبه الصلبة.
  3. ضع الأخطبوط المجمد في طبقة الجل من OCT ، ثم قم بتغطيته ببطء مع OCT في طبقات 2-3. بين صب الخطوات، وتجميد خطوات كتلة حتى أكتوبر هو في مرحلة هلام. بعد تغطية الأخطبوط بالكامل، قم بتجميد الكتلة لمدة 12 ساعة على الأقل عند -20 درجة مئوية.
  4. قم بتحميل العينة في نظام التصوير المقطعي المبرد73.
  5. قسم وصورة كامل O. bimaculoides القتل الرحيم في قرار mesoscopic باستخدام 3 مرشحات الانبعاثات / الإثارة وبالتالي إنتاج العديد من مجموعات البيانات 3D متساوي الخواص.
  6. عندما يصل المقطع إلى الذراع والجهاز الهضمي ، قم بنقل المقاطع إلى الشرائح لمزيد من الأنسجة.
  7. قم بتحميل مجموعة البيانات الأولية في برنامج إعادة الإعمار من بائع CFT المصمم خصيصا لتمكين المعالجة السريعة.
  8. إعادة بناء كومة ثلاثية الأبعاد باستخدام المحاذاة التاريخية، وموازنة الرسم البياني، والتصحيحات الفلورية والتطبيع، بما في ذلك إزالة آثار الفلورية تحت سطح الأرض لكل طول موجي.
  9. بمجرد أن يتم إنتاج المكدس ثلاثي الأبعاد النهائي بواسطة أداة إعادة الإعمار ، تصور البيانات باستخدام أداة برنامج التصوير وإنشاء عمليات طيران مع تراكبات الضوء الأبيض والفلورسينس جنبا إلى جنب مع إسقاطات الكثافة القصوى ثلاثية الأبعاد (3D-MIPS) ، على سبيل المثال ، الشكل 873.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الحصول على جميع الحيوانات في دراساتنا من البرية ، وبالتالي لم يكن من الممكن تحديد عمرها بالضبط وكانت إقامتها في المختبر متغيرة. لوحظت حالة الأخطبوط يوميا. لم نرى الطفيليات أو البكتيريا أو تلف الجلد أو السلوك غير الطبيعي. وكان متوسط وزن الحيوانات 170.38 +/- 77.25 غرام. كل يسكن خزان سعة 40 جالون خاص به. وكان متوسط الانحراف المعياري ± للمعلمات المسجلة للدبابات على مدى أسبوع: درجة الحموضة 8.4 ± 0.0، الملوحة 34.06 ± 0.61 جزء في المليون، ودرجة الحرارة 18.7 ± 0.75 درجة مئوية، والأمونيا 0.11 ± 0.14 جزء في المليون، والنتريت 0.25 ± 0.14 جزء في المليون، والنترات 1.43 ± 2.44 جزء في المليون.

سلوك O. bimaculoides: لفهم وظيفة الحسية الحركية وكذلك قدرات التعلم والذاكرة من الأخطبوط، وقد ثبت أن أنابيب الاختبار فك ليكون اختبارا مفيدا (الشكل 6). كما يوفر بيئة غنية ثبت أنها مفيدة للحفاظ على الآليات الفسيولوجية الحرجة المرتبطة بالتدهور العصبي74. تم إجراء هذا الاختبار يوميا مع ثلاثة الأخطبوط، واستغرق الأخطبوط 4 أيام في المتوسط لمعرفة كيفية فتح أنبوب اختبار.

Figure 6
الشكل 6: تطور الأخطبوط الذي يفك غطاء الأنبوب. استخدم الكاميرات لتسجيل مقاطع الفيديو لصناديق الكشف الخضراء التي تم إنشاؤها من برنامج الكاميرا. في الإطار الأخير من الفيديو ، الكائن الأزرق هو غطاء الأنبوب الذي يرتفع نحو سطح الخزان بعد إزالته من قبل الأخطبوط. شريط المقياس = 30 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التصوير بالرنين المغناطيسي للجهاز العصبي الأخطبوط: يوفر التصوير بالرنين المغناطيسي وسيلة لتصور الأنسجة الرخوة بدقة مكانية كبيرة. حصلنا على صور عالية الدقة المكانية (100 ميكرون voxels) من الجهاز العصبي O. bimaculoides (الشكل 7). هذه التقنية سوف تسمح للحصول على مورفولوجيا مفصلة وتتبع الألياف والتوجه في إعداد الحيوان كله.

Figure 7
الشكل 7: التصوير بالرنين المغناطيسي للجهاز العصبي الأخطبوط. عالية الدقة التصوير بالرنين المغناطيسي توصيف الجهاز العصبي O. bimaculoides . حصلنا على صور التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي السابق للدماغ وأذرع الأخطبوط التي تشكل معا الجهاز العصبي الذي يحتوي على أكثر من 500 مليون خلية عصبية. الدماغ في المركز، وترتبط الفصوص البصرية اثنين على كل جانب (أ). منظر تاجي للذراعين. ويمكن رؤية الحبل المحوري في كل من الأسلحة السبعة التي تم التقاطها في هذا الرأي (ب). نظرة القوس من المصاصون يدل على بنية عصبية المحيطية المعقدة (ج). شريط المقياس = 5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التصوير المقطعي بالتبريد الفلوري (CFT): وCFT هو وسيلة للدولة من بين الفن الذي يتيح الحصول على التصوير عالية الدقة في إعداد الحيوان كله. استخدم النظام فقط autofluorescence لتوليد صورة مورفولوجية ثلاثية الأبعاد للحيوان بأكمله. كما هو مبين في الشكل 8، وهذا يسمح لتصور الدماغ والمصاصون التي يتم وضعها على طول الذراع في الطول الموجي 470 (الأخضر) والجهاز الهضمي في 555 (الأزرق) و 640 (الأصفر) أطوال موجية.

Figure 8
الشكل 8: التصوير المقطعي المضان بالتبريد (CFT) للتصوير المقطعي ل O. bimaculoides. تم تضمين الأخطبوط بأكمله في كتلة وشرائح متسلسلة أثناء جمع الضوء الأبيض والصور الفلورية بعد كل قسم. وقد أنتج ذلك مجموعة بيانات متساوية الخواص ثلاثية الأبعاد مع ثلاثة أطوال موجية مضانة. شريط المقياس = 30 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إعداد النظام:
وقد تم تطوير النظام الإيكولوجي الحوض بطريقة تستخدم كل من الطرق الميكانيكية والبيولوجية لتصفية واكسجين المياه. تستخدم عناصر التصفية في النظام مرشحات الجوارب ، وكشطات البروتين ، والتنظيف المنتظم للحفاظ على مستويات النيتروجين والأوكسجين. والأهم من ذلك، أننا نعتمد أيضا على الكائنات الحية الدقيقة البحرية لاستهلاك المركبات النيتروجينية الخطيرة وغيرها من النفايات البيولوجية، فضلا عن تأرير المياه من خلال عمليات التمثيل الضوئي. طرق إضافية، إلى جانب استخدام الطحالب، لإضافة الأكسجين إلى الماء هو من خلال التهوية الخارجية مع الحجر الجوي المرفقة. قبل إضافة أي بكتيريا، فمن المستحسن لإضافة الرمال الحية أو المرجان سحقت كوسيلة للنمو. وبدون وسائط الإعلام، ستستغرق الكائنات الحية وقتا أطول لترسيخ نفسها داخل النظام. وسوف يستغرق هذا التطور 1-3 أسابيع لانهيار فعال biowaste وتحقيق الاستقرار في دورة النيتروجين ضمن المعلمات المناسبة.

الإثراء البيئي:
يمكن أن يساعد الإثراء المعرفي والحسي الحركي في تكوين الأعصاب والرفاه العام لل الأخطبوط75. يمكن أن يتكون الإثراء من ركيزة رملية وقذائف والصخور وغيرها من الهياكل التي توفر أماكن للاختباء والغطاء. نحن في كثير من الأحيان تغيير تكوين الهياكل داخل خزان الأخطبوط وإدخال ألعاب جديدة مع الميكانيكا مثيرة للاهتمام لتحفيز الأخطبوط لاستكشاف. وجدنا أنه من الأفضل استخدام أحواض الزهور مع ثقب في الجزء السفلي لإيواء الأخطبوط. وهذا يسمح بالتعامل مع أقل صدمة، حيث في منزل مع مدخل واحد، قد يتعرض للأخطبوط للأذى عند محاولة إزالتها. يتمتع الأخطبوط بالتفاعل مع الليغوس الكبير والجرار غير المفككة مع الطعام الموضوع داخله ، كما هو موضح أيضا في Fiorito et al.58. الإثراء البيئي مهم للصحة المعرفية والفسيولوجية للأخطبوط، والتي ثبت أنها تؤثر على آليات التجديد الحرجة في الجهاز العصبي للأخطبوط74,75.

التحسينات:
يمكن تعديل إعداد النظام مثل زيادة حجم الخزانات ، باستخدام أنظمة مستنقع مختلفة ، بالإضافة إلى معدات مختلفة. مزيد من التحسينات التي يمكن إجراؤها هي لإضافة نظام التبريد بعد إخراج مضخة مستنقع بسبب القيود المفروضة على التدفق الناجمة عن نظام التبريد. وينبغي إدخال تحسينات إضافية لإدخال أنواع مختلفة من الطحالب للسيطرة على مستويات النترات وكذلك الفريسات الأخرى، مثل الرخويات الأخرى غير السامة والديكابودات، التي قد يفضلها الأخطبوط كخيارات إضافية.

الأخطبوط تتطلب الرعاية والاهتمام المستمر والأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول أثبتت أنها توفر بيئة مستقرة وصحية لسكانها. في حين أن الأساليب المبينة هنا هي لO. bimaculoides، يمكن استخدام الإعداد الحوض الأساسية لمعظم الحيوانات البحرية مع اختلافات طفيفة في حجم النظام والمعدات. الخصائص الفريدة لهذه الحيوانات جعلها مثالية للعديد من مجالات البحث ونجاح المشاريع التي تنطوي على هذه الحيوانات يعتمد على اجتهاد فريق تربية الحيوانات. الأخطبوط مع قدراتهم لا تضاهى جعلها نموذجا حيوانية رائعة ومهمة لتوظيفها في البحوث الطبية الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل NIH UF1NS115817 (G.P.). يتم دعم G.P. جزئيا من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01NS072171 و R01NS098231. نود أن نشكر باتريك زاكرزيكي ومحمد فرهود من شركة "تنبعث منها" على المساعدة والدعم في جمع وتصور البيانات على منصة صور Xerra. MSU لديها اتفاق بحثي مع بروكر Biospin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-3/4 in. Drill Bit Home Depot 204074205 Glass cutting tool
Part number:1
1" flow sensors Neptune Systems Local Dealer Pipe with sensor to measure water flow
Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer Bulk Reef Supply 207113 Strainer for water leaving tank
Part number:3
10 gallon tank Preuss Pets Local Dealer Fiddler crab holding tank
Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring AQUAMAXX UJ41171 Filter for large organic matter in sump
Part number:5
40 gallon aquarium Preuss Pets Local Dealer 4 Food aquarium tanks
Part number:6
60g poly tanks - rectangle Preuss Pets Local Dealer 2 Water Storage (salt and freshwater)
Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model WayWe 719574198463 For cooling water continuously
Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush ALAZCO B06W2FT5V5 Tank Cleaning
Part number:9
Ammonia Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 33D For water testing
Part number:10
Apex system WiFi Neptune Systems Local Dealer System connection for off site monitoring
Part number:11
API Aquarium Test Kit Amazon B001EUE808 For water testing
Part number:12
API Copper Test Kit Amazon B0006JDWH8 For water testing
Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units Aqua Ultraviolet A00028 For removing bacteria leaving sump system
Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack Aquaclear A1394 Food Tank Carbon Filter Inserts
Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30 Aqueon 100106082 Food tank filtering units
Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float) Neptune Systems Local Dealer For freshwater tank
Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC) Neptune Systems Local Dealer From water storage to octopus tanks
Part number:18
Banded Trochus Snail LiveAquaria CN-112080 For algae bin
Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured LiveAquaria BVJ-76354 For algae bin
Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen Fulton Fish Market N/A Live food
Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin Bulk Reef Supply 211813 Salt for tank water
Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD McMaster 5233K71 Cleaning tool
Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch Marine Depot 4C31001 Cleaning tool
Part number:24
Copper Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 65L For water testing
Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light Eshopps 6500K Algae bin light
Part number:26
Eheim 1262 return pumps EHEIM 1250219 Pump for storage tanks
Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3 Eshopps 15000 Sump system
Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof Sigma-Aldrich 64-17-5 Anesthesia
Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter Extech DO600 Oxygen measurement
Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:31
Filter Cartridges Aqueon 100106087 Food tank filters
Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea Bulk Reef Supply 212959 Sediment for bottom of tank
Part number:33
FMM module Neptune Systems Local Dealer Controller for apex system
Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz Bulk Reef Supply 213036 Bacteria start
Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail Grainger 38Y789 Water Hand Pump
Part number:36
High pH Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 27 For water testing
Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp Petco 2580993 Shrimp and fish transfer net
Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors Neptune Systems Local Dealer Placed on floor to detect water
Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass Marine Depot LE12007 Cleaning tool
Part number:40
Live rocks Preuss Pets Local Dealer Habitat for octopus
Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long Haomaomao B07FS7J7PN Tank Cleaning
Part number:42
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M1028-100ML Euthanasia
Part number:43
Magnetic Probe Rack Neptune Systems Local Dealer For holding apex sensor probes
Part number:44
Marine Ghost Shrimp NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count Chewy 98331 For elevated copper levels
Part number:46
Nitra-Zorb Bag Aquarium Pharmaceuticals AP2213 Absorbs nitrogen compounds
Part number:47
Nitrate Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals LR1800 For water testing
Part number:48
Nitrite Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 26 For water testing
Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue Amazon B076S56XWX Aerate water
Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard Amazon B0002563MM Tubing for connecting air pump to air stone
Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose Preuss Pets Local Dealer Water transport
Part number:52
PM1 module Neptune Systems Local Dealer Power control module for apex
Part number:53
Protein skimmer Reef Octopus AC20284 Removes biowaste from system
Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts Neptune Systems Local Dealer Helps ensure organization for wires and tubing within system
Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer Amazon Oatey - 30246 For connecting PVC pipes
Part number:56
RODI unit Neptune Systems Local Dealer RO Water
Part number:57
Salinity Probes HANNA probes HI98319 Measures salinity of water
Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment Seachem 1438 Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus
Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer Seachem 116012607 Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems
Part number:60
Set of lexan tops Preuss Pets Local Dealer Aquarium tank lids
Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables Neptune Systems Local Dealer Cables for Apex system
Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums Amazon B07DC2TZCJ Cleaning tool
Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male McMaster 4880K189 PVC pipe
Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male McMaster 4880K773 PVC pipe
Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male McMaster 4880K415 PVC pipe
Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female McMaster 4880K008 PVC pipe
Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female McMaster 4880K43 PVC pipe
Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long McMaster 48925K13 PVC pipe
Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long McMaster 48925K92 PVC pipe
Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/2" Thick McMaster 8537K15 Table top material
Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness McMaster 8548K33 Structural table material
Part number:72
Tank Sediment TopDawg Pet Supply 8479001207 Sediment for bottom of fiddler crab tank
Part number:73
Temperature probe Neptune Systems Local Dealer Temperature probe for tanks
Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish Amazon B00025K0US Fish, shrimp, and crab food
Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums Petco 2335234 Air pump for smaller tanks
Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female McMaster 36895K843 PVC pipe
Part number:77
Vectra s2 pump Bulk Reef Supply 212141 Aquarium Pump
Part number:78
Water Pump TACKLIFE GHWP1A Pump for cleaning tanks
Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision Amazon B076H3SRXG DeepLabCut Recording
Part number:80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), 299 (2007).
  3. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Li, N., et al. Optogenetic-guided cortical plasticity after nerve injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8838-8843 (2011).
  5. Airan, R. D., Li, N., Gilad, A. A., Pelled, G. Genetic tools to manipulate MRI contrast. NMR Biomedicine. 26 (7), 803-809 (2013).
  6. Cywiak, C., et al. Non-invasive neuromodulation using rTMS and the electromagnetic-perceptive gene (EPG) facilitates plasticity after nerve injury. Brain Stimulation. 13 (6), 1774-1783 (2020).
  7. Hwang, J., et al. Regulation of Electromagnetic Perceptive Gene Using Ferromagnetic Particles for the External Control of Calcium Ion Transport. Biomolecules. 10 (2), (2020).
  8. Lu, H., et al. Transcranial magnetic stimulation facilitates neurorehabilitation after pediatric traumatic brain injury. Scientific Reports. 5, 14769 (2015).
  9. Krishnan, V., et al. Wireless control of cellular function by activation of a novel protein responsive to electromagnetic fields. Bioscience Reports. 8 (1), 8764 (2018).
  10. Mitra, S., Barnaba, C., Schmidt, J., Pelled, G., Gilad, A. A. Functional characterization of an electromagnetic perceptive protein. bioRxiv. , 329946 (2020).
  11. Hunt, R. D., et al. Swimming direction of the glass catfish is responsive to magnetic stimulation. PLoS One. 16 (3), 0248141 (2021).
  12. Kandel, E. R., Krasne, F. B., Strumwasser, F., Truman, J. W. Cellular mechanisms in the selection and modulation of behavior. Neurosciences Research Program bulletin. 17, 521 (1979).
  13. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. An analysis of dishabituation and sensitization of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. International Journal of Neuroscience. 2 (2), 79-98 (1971).
  14. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bioscience Reports. 21 (5), 565-611 (2001).
  15. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life-span of octopus-bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  16. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Behavior, body patterning and reproductive-biology of octopus-bimaculoides from California. Malacologia. 29 (1), 41-55 (1988).
  17. Pickford, B. M. The Octopus bimaculatus problem: A study in sibling species. Bulletin of the Bingham Oceanographic Collection. 12, 1-66 (1949).
  18. Sumbre, Y., Fiorito, G., Flash, T. Control of octopus arm extension by a peripheral motor program. Science. 293 (5536), 1845-1848 (2001).
  19. Gutfreund, Y., et al. Organization of octopus arm movements: a model system for studying the control of flexible arms. Journal of Neuroscience. 16 (22), 7297-7307 (1996).
  20. Gutfreund, Y., Matzner, H., Flash, T., Hochner, B. Patterns of motor activity in the isolated nerve cord of the octopus arm. The Biological Bulletin. 211 (3), 212-222 (2006).
  21. Hague, T., Florini, M., Andrews, P. L. R. Preliminary in vitro functional evidence for reflex responses to noxious stimuli in the arms of Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 100-105 (2013).
  22. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  23. Hochner, B., Glanzman, D. L. Evolution of highly diverse forms of behavior in molluscs. Current Biology. 26 (20), 965-971 (2016).
  24. Hvorecny, L. M., et al. Octopuses (Octopus bimaculoides) and cuttlefishes (Sepia pharaonis, S. officinalis) can conditionally discriminate. Animal Cognition. 10 (4), 449-459 (2007).
  25. Kier, W. M., Stella, M. P. The arrangement and function of octopus arm musculature and connective tissue. Journal of Morphology. 268 (10), 831-843 (2007).
  26. Levy, G., Hochner, B. Embodied organization of octopus vulgaris morphology, vision, and locomotion. Frontiers in Physiology. 8, 164 (2017).
  27. Giorgio-Serchi, F., Arienti, A., Laschi, C. Underwater soft-bodied pulsed-jet thrusters: Actuator modeling and performance profiling. The International Journal of Robotics Research. 35 (11), 1308-1329 (2016).
  28. Han, S., Kim, T., Kim, D., Park, Y., Jo, S. Use of deep learning for characterization of microfluidic soft sensors. IEEE Robotics and Automation Letters. 3 (2), 873-880 (2018).
  29. Hanassy, S., Botvinnik, A., Flash, T., Hochner, B. Stereotypical reaching movements of the octopus involve both bend propagation and arm elongation. Bioinspiration and Biomimetics. 10 (3), 035001 (2015).
  30. Hochner, B., Shomrat, T., Fiorito, G. The octopus: a model for a comparative analysis of the evolution of learning and memory mechanisms. The Biological Bulletin. 210 (3), 308-317 (2006).
  31. Imperadore, P., Fiorito, G. Cephalopod tissue regeneration: consolidating over a century of knowledge. Frontiers in Physiology. 9, 593 (2018).
  32. Imperadore, P., et al. Nerve regeneration in the cephalopod mollusc Octopus vulgaris: label-free multiphoton microscopy as a tool for investigation. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (141), 20170889 (2018).
  33. Levy, G., Flash, T., Hochner, B. Arm coordination in octopus crawling involves unique motor control strategies. Current Biology. 25 (9), 1195-1200 (2015).
  34. Li, F., et al. Chromosome-level genome assembly of the East Asian common octopus (Octopus sinensis) using PacBio sequencing and Hi-C technology. Molecular Ecology Resources. 20 (6), 1572-1582 (2020).
  35. Lopes, V. M., Rosa, R., Costa, P. R. Presence and persistence of the amnesic shellfish poisoning toxin, domoic acid, in octopus and cuttlefish brains. Marine Environmental Research. 133, 45-48 (2018).
  36. Mazzolai, B., Margheri, L., Dario, P., Laschi, C. Measurements of octopus arm elongation: Evidence of differences by body size and gender. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 160-164 (2013).
  37. McMahan, W., et al. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. , 2336-2341 (2006).
  38. Meisel, D. V., Kuba, M., Byrne, R. A., Mather, J. The effect of predatory presence on the temporal organization of activity in Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 75-79 (2013).
  39. Nesher, N., Levy, G., Grasso, F. W., Hochner, B. Self-recognition mechanism between skin and suckers prevents octopus arms from interfering with each other. Current Biology. 24 (11), 1271-1275 (2014).
  40. Wells, M. J. Octopus : Physiology and behaviour of an advanced invertebrate. , Chapman and Hall. Halsted Press. (1978).
  41. Young, J. Z. The anatomy of the nervous system of Octopus vulgaris. , Clarendon Press. (1971).
  42. Zullo, L., Sumbre, G., Agnisola, C., Flash, T., Hochner, B. Nonsomatotopic organization of the higher motor centers in octopus. Current Biology. 19 (19), 1632-1636 (2009).
  43. Albertin, C. B., et al. The octopus genome and the evolution of cephalopod neural and morphological novelties. Nature. 524 (7564), 220-224 (2015).
  44. Albertin, C. B., Simakov, O. Cephalopod Biology: At the intersection between genomic and organismal novelties. Annual Review if Animal Biosciences. 8, 71-90 (2020).
  45. Baik, S., et al. A wet-tolerant adhesive patch inspired by protuberances in suction cups of octopi. Nature. 546 (7658), 396-400 (2017).
  46. Pikul, J. H., et al. Stretchable surfaces with programmable 3D texture morphing for synthetic camouflaging skins. Science. 358 (6360), 210 (2017).
  47. Wehner, M., et al. An integrated design and fabrication strategy for entirely soft, autonomous robots. Nature. 536 (7617), 451-455 (2016).
  48. McMahan, W., et al. Field trials and testing of the OctArm continuum manipulator. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. ICRA. , 2336-2341 (2006).
  49. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  50. Tapia-Vasquez, A. E., et al. Proteomic identification and physicochemical characterisation of paramyosin and collagen from octopus (Octopus vulgaris) and jumbo squid (Dosidicus gigas). International Journal of Food Science & Technology. 55 (10), 3246-3253 (2020).
  51. Kim, B. -M., et al. The genome of common long-arm octopus Octopus minor. GigaScience. 7 (11), (2018).
  52. Zarrella, I., et al. The survey and reference assisted assembly of the Octopus vulgaris genome. Scientific data. 6 (1), 13 (2019).
  53. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life span of Octopus bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  54. Stoskopf, M. K., Oppenheim, B. S. Anatomic features of Octopus bimaculoides and Octopus digueti. Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 27 (1), 1-18 (1996).
  55. Ramos, J. E., et al. Body size, growth and life span: implications for the polewards range shift of Octopus tetricus in south-eastern Australia. PLoS One. 9 (8), 103480 (2014).
  56. Hanlon, R. T., Forsythe, J. W. Advances in the laboratory culture of octopuses for biomedical research. Lab Animal Science. 35 (1), 33-40 (1985).
  57. Moltschaniwskyj, N. A., Carter, C. G. Protein synthesis, degradation, and retention: mechanisms of indeterminate growth in cephalopods. Physiological and Biochemical Zoology. 83 (6), 997-1008 (2010).
  58. Fiorito, G., et al. Guidelines for the care and welfare of Cephalopods in Research -A consensus based on an initiative by CephRes, FELASA and the Boyd Group. Lab Animal. 49, 2 Suppl 1-90 (2015).
  59. Valverde, J. C., Garcia, B. G. Suitable dissolved oxygen levels for common octopus (Octopus vulgaris cuvier, 1797) at different weights and temperatures: analysis of respiratory behaviour. Aquaculture. 244 (1-4), 303-314 (2005).
  60. Cardeilhac, P. T., Whitaker, B. R. Copper Treatments: Uses and Precautions. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. 18 (2), 435-448 (1988).
  61. Hodson, P. V., Borgman, U., Shear, H. Toxicity of copper to aquatic biota. Copper in the Environment. (2), John Wiley. 307-372 (1979).
  62. Poole, B. M. Techniques for the culture of ghost shrimp (palaemonetes pugio). Environmental Toxicology and Chemistry. 7 (12), 989-995 (1988).
  63. Burggren, W. W. Respiration and circulation in land crabs: novel variations on the marine design. American Zoologist. 32 (3), 417-427 (1992).
  64. Reitsma, J., Murphy, D. C., Archer, A. F., York, R. H. Nitrogen extraction potential of wild and cultured bivalves harvested from nearshore waters of Cape Cod, USA. Marine Pollution Bulletin. 116 (1), 175-181 (2017).
  65. Messenger, J. B. Cephalopod chromatophores: neurobiology and natural history. Biological Reviews. 76 (4), 473-528 (2001).
  66. Morgan Holst, M. M., Miller-Morgan, T. The Use of a species-specific health and welfare assessment tool for the giant pacific octopus, enteroctopus dofleini. Journal of Applied Animal Welfare Science. 24 (3), 272-291 (2021).
  67. Rosas, C., et al. Energy balance of Octopus maya fed crab or an artificial diet. Marine Biology. 152 (2), 371-381 (2007).
  68. Anderson, R. C., Wood, J. B., Byrne, R. A. Octopus Senescence: The Beginning of the end. Journal of Applied Animal Welfare Science. 5 (4), 275-283 (2002).
  69. Butler-Struben, H. M., Brophy, S. M., Johnson, N. A., Crook, R. J. In vivo recording of neural and behavioral correlates of anesthesia induction, reversal, and euthanasia in cephalopod molluscs. Frontiers in Physiology. 9, 109 (2018).
  70. Jiang, X., et al. Octopus visual system: A functional MRI model for detecting neuronal electric currents without a blood-oxygen-level-dependent confound. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1311-1319 (2014).
  71. Hennig, J., Nauerth, A., Friedburg, H. RARE imaging: a fast imaging method for clinical MR. Magnetic Resonance in Medicine. 3 (6), 823-833 (1986).
  72. Brant-Zawadzki, M., Gillan, G. D., Nitz, W. R. MP RAGE: a three-dimensional, T1-weighted, gradient-echo sequence--initial experience in the brain. Radiology. 182 (3), 769-775 (1992).
  73. emit-Xerra. , Available from: http://emit-imaging.com/xerra/ (2021).
  74. Bertapelle, C., Polese, G., Di Cosmo, A. Enriched environment increases PCNA and PARP1 Levels in Octopus vulgaris central nervous system: first evidence of adult neurogenesis in Lophotrochozoa. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (4), 347-359 (2017).
  75. Maselli, V., Polese, G., Soudy, A. -S. A., Buglione, M., Cosmo, A. D. Cognitive stimulation induces differential gene expression in Octopus vulgaris: The key role of protocadherins. Biology. 9, Basel. (2020).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 175،
إنشاء نظام إيكولوجي للأخطبوط لأبحاث الطب الحيوي والهندسة الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp,… More

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp, P., Mallett, C. L., Pelled, G. Establishing an Octopus Ecosystem for Biomedical and Bioengineering Research. J. Vis. Exp. (175), e62705, doi:10.3791/62705 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter