Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Etablering av et blekksprutøkosystem for biomedisinsk og bioingeniørforskning

Published: September 22, 2021 doi: 10.3791/62705
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2,4
1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Neuroengineering division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 3Biomedical Imaging division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 4Department of Radiology, Michigan State University

Summary

Å forstå de unike fysiologiske og anatomiske strukturene til blekksprut kan i stor grad påvirke biomedisinsk forskning. Denne veiledningen demonstrerer hvordan man setter opp og vedlikeholder et marint miljø for å imøtekomme denne arten og inkluderer toppmoderne avbildning og analytiske tilnærminger for å visualisere blekkspruts nervesystemanatomi og funksjon.

Abstract

Mange utviklinger innen biomedisinsk forskning har blitt inspirert av å oppdage anatomiske og cellulære mekanismer som støtter spesifikke funksjoner i forskjellige arter. Blekksprut er et av disse eksepsjonelle dyrene som har gitt forskere ny innsikt i nevrovitenskap, robotikk, regenerativ medisin og proteser. Forskning med denne arten av blæksprutte krever oppsett av komplekse fasiliteter og intensivbehandling for både blekksprut og økosystem som er avgjørende for prosjektets suksess. Dette systemet krever flere mekaniske og biologiske filtreringssystemer for å gi et trygt og rent miljø for dyret. Sammen med kontrollsystemet er det nødvendig med spesialisert rutinemessig vedlikehold og rengjøring for å effektivt holde anlegget i drift på lang sikt. Det anbefales å gi et beriket miljø til disse intelligente dyrene ved å endre tankens landskap, innlemme en rekke byttedyr og introdusere utfordrende oppgaver for dem å jobbe gjennom. Våre resultater inkluderer MR og en autofluorescence-avbildning av hele kroppen, samt atferdsstudier for bedre å forstå nervesystemet. Blekksprut har unik fysiologi som kan påvirke mange områder av biomedisinsk forskning. Å gi dem et bærekraftig økosystem er det første avgjørende skrittet for å avdekke deres distinkte evner.

Introduction

Nye konsepter innen biomedisinsk forskning og biomedisinsk ingeniørfag er ofte inspirert av å identifisere spesifikke strategier som biologiske arter har for å møte miljømessige og fysiologiske forhold og utfordringer. For eksempel har forståelse av fluorescensegenskapene i ildfluer ført til utvikling av nye fluorescerende sensorer som kan rapportere cellulær aktivitet i andre modellorganismer1; identifisere ionkanaler aktivert av lys i alger har ført til utvikling av cellulær og tidsspesifikk lysbasert nevromodulering2,3,4,5; oppdage proteiner i glass steinbit som navigerer i henhold til jordens magnetfelt har ført til utvikling av magnetisk-basert-nevromodulering6,7,8,9,10,11; forstå sifonrefleksen i Aplysia har vært medvirkende til å forstå det cellulære grunnlaget for atferd12,13,14.

Forskere fortsetter å utvide den nåværende bioingeniør- og fylogenetiske verktøykassen ved å dra nytte av de unike styrkene og nye perspektivene på fysiologiske funksjoner som ikke-konvensjonelle laboratoriearter har. Føderale etater begynner å støtte disse studielinjene ved å finansiere nytt arbeid utført på forskjellige arter.

En slekt av dyr med unik anatomi og regenerering evner samt adaptiv kontroll av hver av sine armer, fascinerende biologer og ingeniører, og fengslende publikum fra alle deler av samfunnet er Octopus17. Faktisk har mange aspekter av blekksprutens fysiologi og oppførsel blitt studert de siste tiårene15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Den siste utviklingen innen molekylær og evolusjonsbiologi, robotikk, bevegelsesopptak, avbildning, maskinlæring og elektrofysiologi akselererer imidlertid funn relatert til blekksprutfysiologi og atferd og oversetter dem til innovative bioingeniørstrategier27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.

Her beskriver vi hvordan man setter opp og vedlikeholder blekkspruthold, noe som vil være av interesse og relevans for forskere og ingeniører med ulik bakgrunn, vitenskapelige interesser og mål. Likevel fokuserer våre resultater på anvendelse av blekksprut i nevrovitenskap og nevroengineering forskning. Blekksprut har et høyt utviklet nervesystem med 45 millioner nevroner i sentralhjernen, 180 millioner nevroner i optiske lober og ytterligere 350 millioner nevroner i de åtte aksiale ledningene og perifere gangliaene; Til sammenligning har en hund et lignende antall nevroner og en katt bare halvparten av den40. I motsetning til virveldyrnervesystemet, er det bare 32K sprudlende og 140K afferente fibre som forbinder millioner av nevroner i blekksprutens hjerne til millioner av nevroner i hver av armens aksiale ledninger40,41,42. Disse relativt få sammenkoblede fibrene antyder at de fleste detaljene for utførelsen av motorprogrammene utføres i selve aksialledningen, og understreker den unikt distribuerte nevronkontrollen blekksprutene har. Blekksprutens armer har ekstraordinær fin motorisk kontroll som gjør dem manipulasjon ferdigheter som å åpne krukke lokk, selv når de er inne i beholderen. Denne høyt utviklede prehensile motorkapasiteten er unik for klassen av Cephalopods (blekksprut, blekksprut og blekksprut)43.

Faktisk, gjennom hundrevis av millioner år med evolusjon, har blekksprut utviklet et bemerkelsesverdig og sofistikert genom og fysiologisk system43,44 som har inspirert ny utvikling og fremgang på tvers av vitenskapelige og tekniske felt. For eksempel kan en vannavstøtende limplaster basert på den anatomiske strukturen til blekkspruts suckers holde seg til våte og tørre overflater45; et syntetisk kamufleringsmateriale inspirert av blekksprutens kamuflasjehud kan forvandle en flat, 2D-overflate til en tredimensjonal en med støt og groper46. Miniatyr myke og autonome roboter (dvs. Octobots) som i fremtiden kan tjene som kirurgiske verktøy inne i kroppen47; og en arm (dvs. OctoArm) festet til en tanklignende robot48 er også utviklet. Mange arter av blekksprut brukes i biomedisinsk forskning, for eksempel Blekksprut vulgaris, Blekksprut sinensis, Octopus variabilis og Octopus bimaculoides (O. bimaculoides); O. vulgaris og O. bimaculoides er de vanligste34,49,50. Den nylige sekvenseringen av forskjellige blekksprutgenomer gjør denne slekten av spesiell interesse og åpner nye grenser i blekksprutforskning34,43,51,52.

O. bimakuloider som brukes i vårt oppsett er en mellomstor art av blekksprut, først oppdaget i 1949, som finnes i grunt vann utenfor nordøst-Stillehavskysten fra sentrale California til sør for Baja California-halvøya17. Det kan gjenkjennes av de falske øynene på mantelen under øynene. Sammenlignet med Giant Pacific Octopus (Enteroctopus dofleini) og Common Octopus (O. vulgaris), er California Two-Spot Octopus (O. bimaculoides) relativt liten i størrelse, og starter mindre enn noen få centimeter, vokser raskt som en ungdom. Når den heves i et laboratorium, kan den voksne mantelstørrelsen vokse til en gjennomsnittlig størrelse på 100 cm og veie opp til 800 g53,54. Blekksprut har en rask vekstperiode i løpet av de første 200 dagene; Da regnes de som voksne og fortsetter å vokse gjennom resten av livet55,56,57. Blekksprut kan være kannibalistiske, spesielt når begge kjønn er plassert sammen i en tank; Derfor må de plasseres individuelt i separate tanker58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Michigan State University.

1. Oppsett av blekkspruttankutstyr

  1. Først må du skaffe alle ikke-biologiske materialer til et akvarium som vil bli innlemmet i det marine miljøsystemet, som vist i materialtabellen. Størrelser er gitt i tommer.
  2. Vask alle rør-, rør- og filtersystemdeler med 70% etanol og deionisert (DI) vann før installasjonen. Ikke bruk såpe eller andre kjemikalier ved rengjøring.
  3. Plasser et glassfiberbord 13 x 49 tommer x 1/2 tommer (del #71) med fire bordben laget av karbonfiber og med dimensjonene 2 x 2 x 23 tommer (del #72). Fest bena direkte under hjørnene på bordplaten.
  4. Under toppoverflaten, mellom hvert av bordbenene, plasser 2 x 2 tommer lange (del # 72) karbonfiberstabiliseringsstøtter festet til undersiden av bordet og direkte mot kanten av topphyllen. Fest med skruer en annen hylle med samme dimensjoner direkte på bakken under bordet. La pumpen (se Materialbord) sitte direkte på den nederste hylleoverflaten mens tanken sitter på oversiden. Dette systemet vises i figur 1.
    MERK: Vannproduksjonen fra tanken er tyngdekraften matet og alle slanger, unntatt de som mates inn og ut av tanken, må være lavere enn bunnen av tanken for å sikre maksimalt dreneringshodetrykk.

Figure 1
Figur 1: Oppsett av blekkspruttank. Vanninntak og utløp (a). Tre blekkspruttanker hver med et areal på 1,22 m x 0,3 m (b). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Bor et enkelt 13/4 tommers hull, 2 tommer fra en av sidene av tanken, ved hjelp av glassskjæringsbor. Bunnen av vannutgangssugeskjermen vil bestemme høyden på utgangshullet som vist på høyre side av figur 2a. Vannstanden bestemmes av sugeskjermen og må være minst 6 tommer fra toppen av tanken, noe som gir mulighet for en vannsprutsone.
  2. Bruk en PVC primer og sement for å koble seksjonene permanent. For å gjøre det, skyv først enden av det tiltenkte mannlige PVC-røret inn i enden av det kvinnelige røret. Plasser et stykke malerbånd på utsiden av den mannlige delen som fortsatt er synlig for å forhindre at primeren og sementen vises på utsiden av røret. Skill delene etter taping og legg et lett lag med primer på utsiden av hannrøret etter påføring av sementen i samme område.
  3. Monter det mannlige røret inn i det kvinnelige røret, så snart som mulig, etter påføring av sement og fjern båndet. 24 timer etter påføring av primeren og sementen, vask ut nytilkoblede deler med DI-vann. For herdingstid se på sementproduktet for ytterligere retninger.
    MERK: Sørg for at oppsettet av alle slanger og utstyr er plassert riktig før du bruker PVC primer og sement; krav til rørlengde kan variere.
  4. Deretter kobler du den 1 tomme ytre diameteren (OD) enden av sugeskjermen permanent til den 1 tomme indre diameteren (ID) enden av albueforbindelsen. Koble enden av albueleddet til rette PVC-slanger (1 tomme OD). Koble den andre siden av den rette slangen og deretter til 1 tomme ID på den rette adapteren som er koblet til den rette adapteren.
    MERK: ID refererer til den bredeste avstanden mellom rørets innervegger. OD refererer til utsiden av slangebredden.
  5. Koble den rette adapteren gjennom veggen permanent til et rett 4 tommers langt PVC-rør med en 1 tommers OD (fra trinn 1.8). Dette røret vil vende ut av tanken.
  6. Koble det rette røret permanent til midten av PVC-kontakten (1 tomme ID Tee formet; fra trinn 1.9). Deretter kobler du to 6 tommers lange (del #69) rør (1 tomme OD) permanent til både motsatte ender av tee-kontakten-en som vender direkte opp for luftutløsning og den andre direkte ned for vannstrøm.
  7. Koble det nedadgående, utvidede rette røret permanent (fra trinn 1.10) til en rett adapter med 1-tommers ID(female socket barbed pipe). Fest et 36 tommer langt gummirør (3/4 tommers ID) til piggrøradapteren.
  8. Plasser kjølesystemet mellom vannutmatingsslangen og sumpsystemet.
  9. Fest de 3/4 tommers barb beslagene, som følger med systemet, til kjøleenhetens inngangs- og utgangsporter. Sett gummislangen (fra trinn 1.11) på innløpsbeslaget på kjøleren.
  10. Koble til et nytt stykke 3/4 tommers ID-slange (fra trinn 1.13) fra kjølerutgangen (fra trinn 1.12) til innløpet til sumpsystemet som vist i figur 2b.
  11. Deretter plasserer du det 4 x 12 tommers sokkefilteret, med porestørrelse på 200 μm, inn i det angitte området som vist i figur 2. Også, som avbildet i figur 2, plasser proteinskummeren og returpumpen i deres passende områder. Sammen med returpumpen fester du den automatiske avløpsventilen til innsiden av pumpeområdet, 2 tommer over toppen av pumpens vanninntak; Ikke blokker pumpen fra å bli fjernet fra tanken om nødvendig.
  12. Koble et rett 12-tommers langt rør (3/4 tommers OD) permanent til pumpens utløp (fra trinn 1.15). I den andre enden av det 3/4 tommers od rette røret, koble rørets OD permanent til en 3/4 tommers ID 45 ° albueledd. Til den andre enden av skjøten kobler du permanent til en 3/4 tommers OD-slange.
  13. Fest den andre enden av det rette røret (fra trinn 1.16) til 3/4 tommers ID på en rett reduksjonsadapter. Koble den større adapterenden (2-tommers OD) permanent til inngangen til UV-lyset.
    MERK: Rette slangelengder kan variere.
  14. Deretter tilpasser du plasseringen av UV-lysinntaket med pumpens utgangsrør (fra trinn 1.17) slik at røret ikke bøyes mellom lys og pumpe (fra trinn 1.15). Bor hull i stabiliseringsstøtten slik at de samsvarer med hullene i UV-lysets festehull. Tilpass størrelsen på skruene med boret og fest UV-lyset til bordet ved hjelp av skruene som er gitt.
  15. Koble den 2-tommers siden av en annen reduksjonsadapter permanent til uv-lysets utgang (fra trinn 1.18). Fest en 1-tommers OD av et 5-tommers langt rett rør til adapterens 1-tommers ID. Deretter kobler du et 90° hjørnestykke med 1-tommers ID til 1-tommers OD-røret; har den umonterte enden av hjørnestykket pekende mot siden av tanken der vanninngangen er ment å gå (samme side som i trinn 1.5).
  16. Koble den andre enden av hjørnet permanent (fra trinn 1.19) til et 6 tommer langt rør (del # 69) med 1-tommers OD med inngangen til strømningskontrollenheten (del # 2). Koble et annet 1-tommers OD-rør (del #69) permanent til utgangen av strømningsovervåkingsenheten; lengden må strekke seg minst 3 tommer utover tankens side.
  17. Bruk en 13/4 tommers glassskjæringsbor (del #1), klipp et nytt hull 3 tommer over den tiltenkte vannlinjen og 2 tommer fra siden av tanken (figur 1a) på siden motsatt den som har vannutgangshull. Fest en annen gjennomgående vegg skottbeslag med en 1-tommers slip (del # 77) vendt ut av tanken.
  18. Til skottet slip koble et rett rør med 1-tommers OD og 4 inches lengde (Del # 69) permanent. Klipp ned slangen fra siste del av trinn 1.21 for å matche avstanden denne slangen strekker seg fra tanken. Koble et 90° rør permanent (del #65) til hvert av de åpne rørene og kutt et endelig 1-tommers OD rett rør (del #69) som permanent forbinder begge hjørnestykkene.
    MERK: Figur 3 viser en enkel representasjon av akvariesystemet.
  19. Sett opp resten av kontrollsystemet (del #34), monter først grenuttaket (del #53) på selve bordet eller til en vegg i nærheten. Ved siden av monteres væskeovervåkingsmodulen (del #2).
  20. Koble strømningssensoren, grenuttaket og lekkasjedeteksjonssensorene til modulen. Sett opp vekstlyset (del #26) som er festet til algeskuffen (figur 2).
  21. Koble til strømningssensoren, UV-lyset, vekstlyset, pumpen og proteinskummeren til energistangen. Sett opp programmeringen av vannkontrollsystemet i henhold til produsentens bruksanvisning.
  22. Forbered saltvann ved å blande en halv kopp kommersielt tilgjengelig saltblanding med 1 gallon omvendt osmose (RO) eller deionisert (DI) vann. Lag 45 gallons for å fylle en tank og sump system.
  23. Slå på pumpen i sumpsystemets strømningsregulator og fortsett å tilsette saltvann til den automatiske avfyllingsventilen er i av-stilling, slik at det ikke er nødvendig med ekstra ferskvann.
  24. Når vannet er fullt, må du slutte å fylle og slå på vannkjøleenheten for å stille inn temperaturen mellom 18 °C og 22 °C, da dette er det foretrukne temperaturområdet53. Slå på proteinskummet.
  25. Tilsett 30 kg knust korall til bunnen av tanken, samt et lag med knust korall til bunnen av algerbeholderen. Legg til flere levende bergarter og andre tillegg til blekksprutmiljøet. Plasser en topp for å dekke åpningen av tanken.
    MERK: Levende bergarter er døde koraller som er bebodd av makroskopisk marint liv som bakterier og alger.
  26. Tilsett nitrifiserende bakterier som brukes i saltvannsakvariene som anvist på emballasjen. Fortsett å legge til dette som anvist, kontroller temperatur, saltholdighet, pH, ammoniakk, nitritt og nitrat daglig med vanntestsett, pH-sensor og temperatursensor. Sikre verdier for nivåene ammoniakk, nitritt og nitrat er under henholdsvis 0,5 ppm, 0,25 ppm og 22:00.
  27. Sørg for at UV-lys er slått av i dagene nitrifiserende bakterier tilsetter for å la saltvannsmikroorganismer vokse. Etter at parametrene er innenfor sikre områder, kan UV-lyset aktiveres på nytt.
  28. Etter at systemet er etablert, må du også kontrollere at pH og oksygenering er på henholdsvis 8,0-8,4 og Equation 159. Før du legger til noen dyr i akvariet, må du se etter tilstedeværelsen av kobber- og oksygennivåer i systemet ved hjelp av et kobbervannstestsett.
    MERK: Kobber forårsaker skade på hvirvelløse dyr, og det forstyrrer osformulering i fiskevager60,61.
  29. Hvis det finnes kobber i vannet, tester du DI/RO-vannkilden. Etter å ha bestemt at vannkilden ikke inneholder kobber, utfør en 30% vannforandring og plasser den aktiverte karbonblokken (del #46) i vann. Hvis problemet vedvarer, utfør en full vannforandring og rengjør alle delene.
  30. Etter at alle vannparametrene er fastslått å være innenfor trygge nivåer, tilsett 10 spøkelsesreker i systemet minst en uke før du legger til blekksprutene. Dette vil bidra til å introdusere biomasse for bakterier og indikere den generelle vannkvaliteten.
  31. Legg til flere akvarieøkosysteminnbyggere til algerbeholderen. Dette inkluderer Chaetomorpha spp. (spaghetti alger), Trochus Sp. (banded trochus snegl), og Mercenaria leiesoldataria (kirsebærstein muslinger).

Figure 2
Figur 2: Sumpsystem. Sett fra siden av sumpsystemet (a). Øverste visning av sumpsystemet (b). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Akvarium med sumpfiltreringssystem under tanken og miljøkontrollenheter. Grønne piler indikerer vannretningen gjennom systemet. Vann som strømmer fra seksjon en til to for kjøling og på tre for å skille tungt biologisk materiale fra lettere materiale. Tungt avfall flyter til bunnen og ut til seksjon fem mens det mindre biologiske stoffet strømmer inn i sokkefilteret innen seksjon fire. Vann strømmer fra fire under seksjon fem som kommer inn i proteinskummeren i seks for å fjerne gjenværende avfall i vannet. Algebeholderen inneholder mikroorganismer for å bryte ned avfall, ammoniakk og nitrater samt oksygenere vannet. I den siste delen av systemet tilsettes mer vann for å gjøre rede for fordampning før det pumpes tilbake i tanken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Lagertanker

  1. Sett opp to høye 60-gallon vannlagringstanker, en for saltvannet og den andre for RO-vann. Påse at ferskvannstankens maksimale fyllingslinje er høyere enn bordet. Fest en 1/4 tommers slange til den automatiske toppen av flottørventilen i sumpsystemet og fest den andre enden av slangen til bunnen av ferskvannstanken.
    MERK: Dette er for påfylling hvis vann fordamper. Salt blir i vannet.
  2. Fyll saltvannstanken med vann og tilsett den proporsjonale mengden salt til tanken. Luft saltvannstanken kontinuerlig for blanding og riktig oksygenering. Vent i en time før bruk for å sikre full blanding av saltet.
    MERK: Saltvannstanken er nyttig for påfylling av tankene etter rengjøring.

3. Oppsett av mattank

  1. For å holde reker i live i mer enn en uke, oppbevar dem i en separat tank fra blekksprut med saltholdighet under 30 ppt og temperaturen nær 25 °C.
  2. For å gjøre det, en uke etter at blekkspruttankene er modnet, overfør 8 liter modnet saltvann til reketanken. Tilsett 15 kg knust korall til bunnen av tanken. Tilsett noen levende steiner i tanken for å skjule flekker for smelting (figur 4).
    MERK: Modnet sjøvann refererer til prosessen med å la marine bakterier vokse i saltvannet som vist i trinn 1.30.
  3. Fest et beholderfilter til kanten av tanken. Sett opp beholderfilteret som anvist av produsenten. Legg til en luftpumpe ved siden av tanken som er koblet til et rør med en vedlagt luftstein satt inn i tanken.
  4. Rengjør filteret og bytt filterputer hver uke. Også 25% av vannet må endres samtidig. Kontroller nitrogen-, pH- og temperaturparametere daglig i mattankene med vanntestsett som beskrevet i trinn 1.30. Hvis vann nitrogenparametere forblir høye, utfør ytterligere vannforandringer og legg til en nitrogenabsorberende pose til vannet; eller hvis problemene vedvarer lenger enn en måned, må rekene flyttes til en større tank.
  5. Tilsett reker så snart knust korallsediment er spredt. For å legge til reker først, ved ankomst, flytt rekene uten å sende vann til den lille saltvannstanken i 5 min for å fjerne biowaste. Deretter kan rekene legges direkte til tanken. Myggfisk, ved ankomst, kan legges direkte til reketanken.
    MERK: Reker og myggfisk kan kjøpes fra enhver kommersiell leverandør av levende dyr som er oppført på materialarket eller andre matleverandører. Det er også mulig å tilby blekksprut avfrossede reker.
  6. Fôr reker og fisk med fiskeflak, død vegetasjon eller alger62, som anvist på matinstruksjoner.
  7. For krabbetanken, tilsett 1 gallon saltvann og 10 kg småstein. Stable småsteinene på den ene siden og la tørt land på den ene siden og 2 cm saltvann på den andre siden (som nevnt i figur 4). De optimale miljøvannsparametrene for disse hvirvelløse dyr bør være henholdsvis 30-35 ppt og 22-25 °C for saltholdighet og temperatur11,63.
  8. Legg felekrabber direkte inn i tanken (figur 4). Krabber vil tilbringe mesteparten av livet på land, men kan være under vann i noen dager av gangen, noe som gjør tanken som er delvis under vann avgjørende for deres langsiktige overlevelse.
  9. Fôr felekrabber en gang om dagen ved å legge fiskeflak i parabolen på tankens tørre område. Rengjør ukentlig ved å fjerne krabber og endre 100% av saltvannet. Rengjør småsteinene.
  10. Oppbevar marine bivalve bløtdyr (muslinger og blåskjell) i saltvannstankene for blekksprutene for å åpne seg og gi en annen vannfiltreringsmekanisme64.
  11. Plasser blåskjell inne i en separat ubebodd tank den første uken for å unngå å plassere unødvendig avfallsbelastning på blekkspruttankens filtreringssystem.
    MERK: Selv om blåskjellene har vært blekksprutens valgte mat, er det mer sannsynlig at de dør kort tid etter ankomst og vil øke det biologiske avfallet i tanken betydelig hvis de er til stede i store mengder.

4. Innføring av blekksprut til tanken

  1. Kontroller at ammoniakk-, nitritt- og nitratnivåene er under henholdsvis 0,5 ppm, 0,25 ppm og 22 ppm. Ha vannhåndpumpe tilgjengelig for å fjerne blekksprutblekk fra tanken. Det anbefales også å ha to personer for denne prosedyren.
  2. Ved ankomst, plasser posen på skalaen og trekk vekten av posen etter at blekksprut er fjernet. Legg til en luftstein i posen for å øke vannoksygeneringen mens du overfører dyret til tanken. Mål fraktvannets temperatur og saltholdighet. Registrer tilfeller av langvarig sykdom etter forsendelse.
    1. Uten å overføre vann fra posen til tanken, heng transportposen over tankens hjørne med posen delvis nedsenket i tankvannet for å begynne å endre temperaturen på transportposen. Fjern 10% av vannet fra posen og dump ned vasken. Tilsett samme mengde vann fra tanken i posen. Gjenta hver 10 min til vanntemperaturen i posen ikke er mer enn 1° forskjellig fra vanntemperaturen i tanken.
    2. Når temperaturforskjellen på posen og tanken er innenfor 1°, må du sørge for at hansker er slitt for å flytte blekksprutene til sin individuelle tank. For å flytte, plasser begge hendene under blekksprut for å gi støtte under overføringen; den andre personen må forsiktig trekke de sugede armene fra siden av posen.
    3. Når blekksprut er ute av posen, flytt den raskt inn i vannet i sin nye habitat som overfører så lite vann fra forsendelsesposen som mulig. Bruk håndpumpen til å fjerne blekk blekksprut slipper ut når du er i tanken. Vei nå posen med vann for å oppnå omtrentlig vekt av dyret.
  3. I de første 2 ukene etter ankomst, overvåke blekksprut daglige forbruk som skal være rundt 4% til 8% av deres vekt58,65,66. Blekksprut bør kontrolleres fire ganger om dagen; Dette kan reduseres til to ganger per dag etter 2 uker. Vei annenhver uke for å justere matforbruket etter behov.
    MERK: Noen arter av blekksprut er kjent for å unnslippe fra tanken, så det anbefales å plassere en vekt på 2,5 kg på lokket på tanken.

5. Daglig pleie

  1. Bruk et kommersielt tilgjengelig testsett for saltvann for pH, ammoniakk, nitritt og nitrat, og tilsett den kit-regisserte mengden tankvann til de fire reagensrørene som følger med settet. Som angitt på testsettet, legg til mengden kolorimetrisk reaktant til det tilsvarende røret.
  2. Hvis ammoniakk-, nitritt- og nitratnivåene er over henholdsvis 0,5 ppm, 0,25 ppm og 10 ppm, vask biomassen ut av sokkefilteret eller bytt til et nytt sokkefilter. I tillegg rengjør biomasse fra toppen av skimmeren med en børste og legg til ytterligere denitrifiserende bakterier til tanken. Hvis problemene vedvarer, må du erstatte 25% ferskvann.
    MERK: Trinnene ovenfor reduserer nitrogenforbindelser i økosystemet.
  3. Fjern alle døde krabbe- og rekekropper fra tanken, samt blekksprut fekalt materiale ved hjelp av en håndpumpe. Fjern alle gjenværende levende krabber fra tanken og flytt dem tilbake til lagertanken. Deretter omorganiserer du store gjenstander i tanken.
  4. Introduser halvparten av antall krabber som blekksprut ville spise daglig til tanken som veier 1,25 +/- 0,25 g. Fôr avfrossede reker eller små mannlige felekrabber til juvenile blekksprut. Avhengig av eksperimentet kan krabber og reker innføres hvor som helst i tanken eller til blekksprut direkte.
    MERK: Blekksprutenes daglige matforbruk er 4%-8% av vekten67. Frosne reker kan også leveres som matkilde basert på blekksprutens vekt.
  5. Tilby fem spøkelses reker daglig. I gjennomsnitt ble tre konsumert i dette eksperimentet. For å gi en rekke mat til blekksprut, gi en levende musling eller blåskjell en gang i uken og alltid opprettholde tre myggfisk inne i tanken.
    MERK: Å gi dyrene en rekke matvarer er ikke nødvendig og kan forhindre at dyr blir lokket av mat under eksperimenter. Fôringsplanen som brukes her for best å overvåke blekksprutfôring og oppførsel er å introdusere halvparten av antall krabber basert på vekt og øke antall reker til fem om morgenen. Om kvelden, introdusere andre halvdel av krabber til tanken.

6. Ukentlig sanitærforhold

  1. Slå av skimmer-, pumpe- og algebeholderlysene før du rengjør sumpsystemet. Slå deretter av den automatiske ventilen på systemet før du fjerner vann. Til slutt fjerner du skimmeren og alt vannet bare fra sumpsystemet.
  2. Skrubbe algerbeholderen lett for å fjerne det meste av biomassen fra veggene. Rengjør resten av sumpområdet med en børste. Fjern sokkefilteret, rengjør med eddik og la det tørke; roter med et annet sokkefilter hver uke og erstatt med nye hver tredje måned. Fjern og rengjør biomasse fra toppen av skimmeren ukentlig.
    MERK: Unngå å bruke metall til å rengjøre plasten, da det vil skape riper som kan være utsatt for mikrobiell vekst.
  3. Sett skimmeren tilbake i systemet og begynn å fylle på med saltvann. Når pumpeområdet begynner å fylles, kan alle systemene slås på igjen. Slutt å tilsette vann når den automatiske toppen av flottørventilen er i av-stilling.

Figure 4
Figur 4: Tank for felekrabber (Minuca pugnax). Bunnen av tanken er halvparten utpekt for tørr seng og den andre halvparten for 2 cm grunt saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Tank for spøkelsesreker (Palaemonetes paludosus). Bergarter i reketanken gir steder for rekene å gjemme seg og smelte, så vel som for veksten av mikroorganismer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7. Pleie av uvel dyr

  1. Følg veiledningsreferansen66 for å vurdere blekksprut velvære.
    MERK: For kvinnelige blekksprut begynner slutten av livssyklusen normalt etter å ha lagt egg. Dyret vil begynne å redusere matforbruket og vil slutte å spise helt og bli mer sløv. Levetiden etter slutten av levetiden varierer. Ingen ytterligere tiltak kan tas bortsett fra fôring og overvåking av dyret. Senescent menn vil redusere matforbruket og bli sløv68.

8. Blekksprut anestesi

  1. Utfør blekksprutbedøvelse som beskrevet i Butler-Struben et al.69.
  2. Få en 6 L beholder med lokk som er minst 15 cm høy. Plasser 4 L vann direkte fra blekkspruttanken inn i beholderen og gi lufting for 4 L saltvann ved hjelp av en liten luftpumpe med luftstein for å spre oksygen til vannmiljøet58.
  3. Før blekksprut introduksjonen, tilsett 1% EtOH i beholderen. Før du håndterer blekksprut, registrer antall pust per minutt ved å telle utånding av vann fra sifonen.
    MERK: For blekksprut i forskerens laboratorium er baseline respirasjonene 16 -24 pust per minutt.
  4. Før du flytter blekksprut, registrer blekksprut hudpigmentering og baseline pustefrekvens. Fjern blekksprut fra tanken ved hjelp av en ren 4 L åpen munnbeholder ved å øse den opp med det omkringliggende vannet.
    MERK: Under anestesi indikerer ikke pustefrekvensen nødvendigvis fullstendig anestesi.
  5. Vei blekksprut mens du er i beholderen, og flytt den deretter ved å plassere begge hendene rundt blekksprutkroppen og løfte den opp. En annen person kan være nødvendig for å fjerne de sugede lemmer fra beholderveggene.
  6. Flytt blekksprut raskt inn i den forberedte beholderen med 1% EtOH. Lukk lokket for å unngå en mulig flukt.
  7. Registrer åndedrett av blekksprut per minutt ved å telle utånding av vann fra sifon på slutten av de første 5 minuttene. Hvis åndedrettet forblir over grunnlinjen og dyret fortsetter å reagere på en lett klemme, legg til ytterligere 0,25% EtOH til vann. Tilsetningen av etanol til vann kan fortsette til maksimalt 3% EtOH.
    MERK: En indikasjon på at blekksprut er bevisstløs er tap av kontroll over kromatoforene. I dette tilfellet ser huden blekere ut enn normalt. En ytterligere indikasjon er å lett klemme armene og teste om det er en motorrespons. Hvis det fortsatt ikke er noe svar på dette tidspunktet, er blekksprut bevisstløs, og eksperimenter kan utføres.
  8. Mens du er under anestesi, kan du overvåke blekksprutens pust og farge for å sikre at den forblir bevisstløs i løpet av prosedyren. Hvis blekksprut begynner å våkne under prosedyren, legg til ytterligere 0,25% EtOH.
  9. For å reversere effekten av etanolbedøvelse, overfør blekksprut til en ny 4 L eller større tank med oksygenert vann fra sin permanente lagertank. Når respirasjonene går tilbake til det normale, blir blekksprut aktiv, og huden går tilbake til normale pigmenter; den kan flyttes tilbake til tanken.

9. Blekksprut eutanasi

  1. Følg de internasjonale standardene for blekksprut eutanasi som beskrevet i Fiorito et al., Moltschaniwskyj et al., og Butler-Struben et al57,58,69.
  2. Forbered en ny 6 L beholder med 4 L vann fra blekksprutens lagertank. Bland i MgCl2 til en konsentrasjon på 4% til eutanasitanken. Utfør trinn fra 8,1 til 8,9 for å bedøve blekksprut.
  3. Flytt blekksprut etter trinn 8.8 til eutanasitanken. Etter at pusten stopper, vent i 5 min og utfør en decerebration av blekksprut eller hold i eutanasitanken i 5 ekstra minutter.

10. Oppførsel av O. bimakuloider

  1. Ikke mat blekksprut om morgenen når de skal trenes til å bruke en skruehettbeholder. Sett opp en kameraopptaksenhet som peker mot området som er beregnet for fôring.
  2. Få et 50 ml skruehettrør med hull i diameter 1 mm gjennom hele overflaten og hetten for vannstrøm gjennom hele beholderen. Plasser en felekrabbe i beholderen. Legg en vekt i beholderen eller festet til utsiden for at den skal forbli på bunnen av tanken.
  3. Plasser beholderen på bunnen av tanken innenfor det åpne området og i sikte av blekksprut og kamera. Hvis krabben ikke har blitt spist etter 4 timer, fjern den deretter fra røret og gjenoppta fôringsplanen for dagen. Fortsett å utføre denne øvelsen daglig.
    MERK: Dette vises i figur 6 og drøftet i delen om representativt resultat.

11. Blekksprut MR

MERK: Tidligere ble fremkalte funksjonelle MR-responser i blekkspruts netthinne målt hos bedøvede dyr70. Her fikk vi en ultrahøy ROMLIG OPPLØSNING MR av blekksprutens nervesystem som krevde timer med skanning. Dermed ble dette utført i en euthanized O. bimaculoides.

  1. Få tak i MR-bilder ved hjelp av et 7T-system. Pakk blekksprut i en kjøkken-grade polyvinylklorid plastfolie for å opprettholde hydrering av vev. Plasser blekksprut på omslaget, legg i endene, og rull deretter til forsegling.
  2. Bruk en volum overfører/mottar spole med en diameter på 4 cm for å skaffe bilder av hjernen og flere armer. Bruk T1-vektet RARE-sekvens med følgende parametere: Repetisjonstid (TR) på 1500 ms, ekkotid (TE) på 20 ms, 117 x 117 x 500 μm oppløsning, 100 gjennomsnitt, SJELDEN faktor 8. Dette er typiske MR-parametere for avbildning av gnagerhjerner. Hvis du bruker en RARE-faktor, blir bildet raskere, mens 100 bilder beregnes sammen for å øke signal-til-støy-forholdet71.
  3. Bilde blekksprut armen ved hjelp av en 86 mm volum overføring spole og en 4 x 4 cm 4-kanals array motta spole. Klipp av en arm ved hjelp av kirurgisk saks og legg den i et 15 ml konisk rør fylt med fosfatbufret saltvann.
    MERK: Sekvensen var en T1_weighted inversjonsgjenopprettingssekvens (MP-RAGE) med parametere: TR/TE = 4000/2,17 ms, inversjonsforsinkelse 1050 ms, 100 x 100 x 500 μm oppløsning, 9 gjennomsnitt, skannetid 1,5 t (figur 7). En inversjonsgjenvinningssekvens nullstiller signalet fra vann og øker kontrasten i bildet. denne sekvensen ble valgt fordi den tillater visualisering av arm72s indre anatomi.

12. Kryo-fluorescenstomografi (CFT) avbildning

  1. Flash-freeze blekksprut: Arbeid i en avtrekkshette. Dekk bunnen av en Dewar med tørris, og fyll deretter med heksaner. Senk blekksprut sakte ned i heksaxene over ca. 10 min, og tilsett friske heksaner og tørris etter behov for å dekke blekksprut med kalde heksaner. Hold blekksprut frosset ved -20 °C til den er innebygd.
  2. Bygg inn og del blekksprut: Lag en rektangulær form av riktig størrelse for å holde blekksprut ved hjelp av verktøyene levert av CFT-produsenten. Dekk bunnen av formen med OCT (optimal skjæretemperatur) medier (standardmateriale som brukes i histologilaboratorier) og la det fryse til en halvfast gel.
  3. Plasser den frosne blekksprut i gellaget av OCT, og dekk deretter sakte med OCT i 2-3 lag. Mellom hellingstrinnene fryser du blokktrinnene til OKT er på gelstadiet. Etter at blekksprut er helt dekket, fryse blokken i minst 12 timer ved -20 °C.
  4. Last prøven inn i kryo-fluorescenstomografisystemet73.
  5. Seksjon og bilde hele euthanized O. bimaculoides ved mesoskopisk oppløsning ved hjelp av 3 utslipp / eksitasjon filtre og dermed produsere flere 3D isotropiske datasett.
  6. Når seksjoneringen når armen og fordøyelsessystemet, overfør seksjonene til lysbildene for videre histologi.
  7. Last inn rådatasettet i rekonstruksjonsprogramvaren fra CFT-leverandøren som er spesielt utformet for å muliggjøre rask behandling.
  8. Rekonstruere en 3-dimensjonal stabel ved hjelp av landemerkejustering, histogrambalansering og fluorescenskorrigeringer og normalisering, inkludert fjerning av undergrunnsfluorescenseffekter for hver bølgelengde.
  9. Når den endelige 3D-stakken er produsert av rekonstruksjonsverktøyet, visualiserer du dataene med bildebehandlingsprogramvareverktøyet og lager fly-throughs med hvitt lys og fluorescensoverlegg sammen med 3D Maximum Intensity Projections (3D-MIPS), f.eks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle dyrene i våre studier ble hentet fra naturen, og dermed kunne deres eksakte alder ikke bestemmes og deres opphold i laboratoriet var variabelt. Blekkspruttilstand ble observert daglig. Vi så ikke parasitter, bakterier, hudskader eller unormal oppførsel. Gjennomsnittlig vekt av dyr var 170,38 +/- 77,25 g. Hvert dyr bebodd sin egen 40-gallon tank. Gjennomsnittlig ± standardavvik for parametrene som er registrert for en tank over en uke var: pH 8,4 ± 0,0, saltholdighet 34,06 ± 0,61 ppt, temperatur 18,7 ± 0,75 °C, ammoniakk 0,11 ± 0,14 ppm, nitritt 0,25 ± 0,14 ppm og nitrat 1,43 ± 2,44 ppm.

Oppførsel av O. bimakuloider: For å forstå den sensoriske funksjonen samt læring og minneegenskaper hos blekksprut, har skruerør vist seg å være en nyttig test (figur 6). Det gir også et beriket miljø som har vist seg nyttig for å opprettholde kritiske fysiologiske mekanismer forbundet med nevral nedbrytning74. Denne testen ble utført daglig med tre blekksprut, og det tok blekksprut 4 dager i gjennomsnitt å lære å åpne et reagensrør.

Figure 6
Figur 6: Progresjon av blekksprut skrur av lokket på et rør. Bruk kameraer for å spille inn videoer av grønne deteksjonsbokser generert fra kameraprogramvaren. I den siste rammen av videoen er det blå objektet hetten på røret som stiger mot tankens overflate etter å ha blitt fjernet av blekksprut. Skalastang = 30 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MR i blekksprutens nervesystem: En MR gir et middel til å visualisere bløtvev med stor romlig oppløsning. Vi fikk ultrahøye romlige oppløsningsbilder (100 mikron voxels) av O. bimaculoides nervesystem (figur 7). Denne teknikken vil tillate å oppnå detaljert morfologi og fibersporing og orientering i et heldyrpreparat.

Figure 7
Figur 7: MR i blekksprutnervesystemet. Høyoppløselig MR-karakterisering av O. bimaculoides nervesystemet. Vi kjøpte ex vivo MR-bilder av hjernen og blekksprutens armer som til sammen danner et nervesystem som inneholder over 500 millioner nevroner. Hjernen er i midten, og de to optiske lobene er koblet på hver side (a). En koronal utsikt over armene. Den aksiale ledningen kan ses i hver av de syv armene som er fanget i denne visningen (b). En sagittal utsikt over suckers demonstrerer en kompleks perifer nervøs struktur (c). Skalastang = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Kryo-fluorescenstomografi (CFT) avbildning: CFT er en toppmoderne metode som gjør det mulig å anskaffe høyoppløselig avbildning i et helt dyrepreparat. Systemet brukte bare autofluorescence for å generere 3-dimensjonalt morfologiske bilde av hele dyret. Som vist i figur 8, tillot dette å visualisere hjernen og suckers som er plassert langs armen i 470 bølgelengde (grønn) og fordøyelsessystemet i 555 (blå) og 640 (gule) bølgelengder.

Figure 8
Figur 8: Kryo-fluorescenstomografi (CFT) avbildning av O. bimakuloider. Hele blekksprut ble innebygd i en blokk og serielt skiver mens samle hvitt lys og fluorescens bilder etter hver seksjon. Dette produserte et 3D-isotropt datasett med tre fluorescensbølgelengder. Skalastang = 30 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Systemoppsett:
Akvariet økosystemet er utviklet på en måte som både mekaniske og biologiske metoder for filtrering og oksygenering av vannet brukes. Filtreringselementene i systemet bruker sokkefiltre, proteinskummer og regelmessig rengjøring for å opprettholde nitrogen- og oksygennivåer. Enda viktigere er det at vi også er avhengige av marine mikroorganismer for å konsumere de farlige nitrogenholdige forbindelsene og annet biologisk avfall, samt aerere vannet gjennom prosesser for fotosyntese. Ytterligere metoder, foruten bruk av alger, for å legge oksygen til vannet er gjennom utvendig luftfilter med vedlagt luftstein. Før du legger til bakterier, anbefales det å legge til levende sand eller knust korall som vekstmedier. Uten media vil organismene ta lengre tid å etablere seg i systemet. Denne utviklingen vil ta 1-3 uker å effektivt bryte ned biowaste og stabilisere nitrogensyklusen innenfor passende parametere.

Miljøberikelse:
Kognitiv og sensorisk berikelse kan hjelpe til med nevrogenese og den generelle trivselen til blekksprut75. Berikelse kan bestå av sandsubstrat, skall, bergarter og andre strukturer som gir gjemmesteder og deksel. Vi endrer ofte konfigurasjonen av strukturene i blekkspruttanken og introduserer nye leker med interessant mekanikk for å motivere blekksprut til å utforske. Vi fant ut at det er best å bruke blomsterpotter med et hull i bunnen for å huse blekksprut. Dette gir mindre traumatisk håndtering, hvor i et hus med en inngang kan blekksprut bli skadet når du prøver å bli fjernet. Blekksprut liker å samhandle med store Legos og skru av krukker med mat plassert inne, som også beskrevet i Fiorito et al.58. Miljøberikelse er viktig for blekksprutens kognitive og fysiologiske helse, som har vist seg å påvirke kritiske regenereringsmekanismer i blekksprutens nervesystem74,75.

Forbedringer:
Oppsettet av systemet kan endres, for eksempel å øke størrelsen på tankene, ved hjelp av forskjellige sumpsystemer, samt annet utstyr. Ytterligere forbedringer som kan gjøres er å legge til kjølesystemet etter sumppumpeutgangen på grunn av strømningsbegrensninger forårsaket av kjølesystemet. Ytterligere forbedringer ville være å introdusere forskjellige typer alger for å kontrollere nitratnivåer så vel som andre byttedyr, for eksempel andre ikke-giftige bløtdyr og decapods, som blekksprut kan foretrekke som flere alternativer.

Blekksprut krever konstant omsorg og oppmerksomhet, og metodene som brukes i denne protokollen har vist seg å gi et stabilt og sunt miljø for innbyggerne. Mens metodene som er skissert her er for O. bimaculoides, kan det grunnleggende akvariumoppsettet brukes til de fleste marine dyr med mindre variasjoner i størrelsen på systemet og utstyret. De unike egenskapene til disse dyrene gjør dem ideelle for mange forskningsområder, og suksessen til prosjekter som involverer disse dyrene, avhenger av flid av husdyrholdet. Blekksprut med sine uforlignelige evner gjør dem til en bemerkelsesverdig og viktig dyremodell å bruke i biomedisinsk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH UF1NS115817 (G.P.). G.P. støttes delvis av NIH-tilskudd R01NS072171 og R01NS098231. Vi vil takke Patrick Zakrzewki og Mohammed Farhoud fra Emit Imaging for hjelp og støtte til å samle inn og visualisere dataene på Xerra Imaging Platform. MSU har en forskningsavtale med Bruker Biospin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-3/4 in. Drill Bit Home Depot 204074205 Glass cutting tool
Part number:1
1" flow sensors Neptune Systems Local Dealer Pipe with sensor to measure water flow
Part number:2
1" Slip Bulkhead Strainer Bulk Reef Supply 207113 Strainer for water leaving tank
Part number:3
10 gallon tank Preuss Pets Local Dealer Fiddler crab holding tank
Part number:4
4 inch X 12 inch 200 Micron Nylon Monofiliment Mesh Filter Sock w/ Plastic Ring AQUAMAXX UJ41171 Filter for large organic matter in sump
Part number:5
40 gallon aquarium Preuss Pets Local Dealer 4 Food aquarium tanks
Part number:6
60g poly tanks - rectangle Preuss Pets Local Dealer 2 Water Storage (salt and freshwater)
Part number:7
Active Aqua 1/10th HP Hydroponic or Aquarium Chiller 2018 Model WayWe 719574198463 For cooling water continuously
Part number:8
ALAZCO 2 Soft-Grip Handle Heavy-Duty Tile Grout Brush ALAZCO B06W2FT5V5 Tank Cleaning
Part number:9
Ammonia Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 33D For water testing
Part number:10
Apex system WiFi Neptune Systems Local Dealer System connection for off site monitoring
Part number:11
API Aquarium Test Kit Amazon B001EUE808 For water testing
Part number:12
API Copper Test Kit Amazon B0006JDWH8 For water testing
Part number:13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 Watt Series Units Aqua Ultraviolet A00028 For removing bacteria leaving sump system
Part number:14
AquaClear 50 Foam Filter Inserts, 3 pack Aquaclear A1394 Food Tank Carbon Filter Inserts
Part number:15
Aqueon QuietFlow LED PRO Aquarium Power Filter 30 Aqueon 100106082 Food tank filtering units
Part number:16
Auto Top Off Kit (ATK) (Each includes 1 FMM module, 2 optical sensors and 1 float) Neptune Systems Local Dealer For freshwater tank
Part number:17
Automatic top off from RODI (LLC) Neptune Systems Local Dealer From water storage to octopus tanks
Part number:18
Banded Trochus Snail LiveAquaria CN-112080 For algae bin
Part number:19
Chaetomorpha Algae, Aquacultured LiveAquaria BVJ-76354 For algae bin
Part number:20
Clams - Live, Hard Shell, Cherrystone, Wild, USA Dozen Fulton Fish Market N/A Live food
Part number:21
Classic Sea Salt Mix - Tropic Marin Bulk Reef Supply 211813 Salt for tank water
Part number:22
Clear Masterkleer Soft PVC Plastic Tubing, for Air and Water, 3/4" ID, 1" OD McMaster 5233K71 Cleaning tool
Part number:23
Continuum Aquablade-P Acrylic Safe Algae Scraper W/ Plastic Blade - 15 Inch Marine Depot 4C31001 Cleaning tool
Part number:24
Copper Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 65L For water testing
Part number:25
Curve Refugium CREE LED Aquarium Light Eshopps 6500K Algae bin light
Part number:26
Eheim 1262 return pumps EHEIM 1250219 Pump for storage tanks
Part number:27
Eshopps R-100 Refugium Sump GEN 3 Eshopps 15000 Sump system
Part number:28
Ethyl Alcohol, 200 Proof Sigma-Aldrich 64-17-5 Anesthesia
Part number:29
Extech DO600 ExStik II Dissolved Oxygen Meter Extech DO600 Oxygen measurement
Part number:30
Fiddler Crabs; live; dozen NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:31
Filter Cartridges Aqueon 100106087 Food tank filters
Part number:32
Florida Crushed Coral Dry Sand - CaribSea Bulk Reef Supply 212959 Sediment for bottom of tank
Part number:33
FMM module Neptune Systems Local Dealer Controller for apex system
Part number:34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - Fritz Bulk Reef Supply 213036 Bacteria start
Part number:35
Hand Operated Drum Pump, Siphon, Basic Pump with Spout, For Container Type Bucket, Pail Grainger 38Y789 Water Hand Pump
Part number:36
High pH Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 27 For water testing
Part number:37
Imagitarium Fine Mesh Net for Shrimp Petco 2580993 Shrimp and fish transfer net
Part number:38
Leak Detection Kit (LDK) - Includes FMM module plus 2 ALD sensors Neptune Systems Local Dealer Placed on floor to detect water
Part number:39
Lee`S Algae Scrubber Pad Jumbo - Glass Marine Depot LE12007 Cleaning tool
Part number:40
Live rocks Preuss Pets Local Dealer Habitat for octopus
Part number:41
Long Bottle Cleaning Brush 17" Extra Long Haomaomao B07FS7J7PN Tank Cleaning
Part number:42
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M1028-100ML Euthanasia
Part number:43
Magnetic Probe Rack Neptune Systems Local Dealer For holding apex sensor probes
Part number:44
Marine Ghost Shrimp NORTHEAST BRINE SHRIMP N/A Live food
Part number:45
Marineland C-Series Canister Carbon Bags Filter Media, 2 count Chewy 98331 For elevated copper levels
Part number:46
Nitra-Zorb Bag Aquarium Pharmaceuticals AP2213 Absorbs nitrogen compounds
Part number:47
Nitrate Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals LR1800 For water testing
Part number:48
Nitrite Testing Kit Aquarium Pharmaceuticals 26 For water testing
Part number:49
Pawfly 2 Inch Air Stones Cylinder 6 PCS Bubble Diffuser Airstones for Aquarium Fish Tank Pump Blue Amazon B076S56XWX Aerate water
Part number:50
Penn Plax Airline Tubing for Aquariums –Clear and Flexible Resists Kinking, 8 Feet Standard Amazon B0002563MM Tubing for connecting air pump to air stone
Part number:51
Plumbing with unions/valves plus 3/4" flex hose Preuss Pets Local Dealer Water transport
Part number:52
PM1 module Neptune Systems Local Dealer Power control module for apex
Part number:53
Protein skimmer Reef Octopus AC20284 Removes biowaste from system
Part number:54
PVC Apex Mounting board, grommets, wire mounts Neptune Systems Local Dealer Helps ensure organization for wires and tubing within system
Part number:55
PVC Regular Cement and 4-Ounce NSF Purple Primer Amazon Oatey - 30246 For connecting PVC pipes
Part number:56
RODI unit Neptune Systems Local Dealer RO Water
Part number:57
Salinity Probes HANNA probes HI98319 Measures salinity of water
Part number:58
Seachem Pristine Aquarium Treatment Seachem 1438 Provides bacteria that break down excess food, waste and detritus
Part number:59
Seachem Stability Fish Tank Stabilizer Seachem 116012607 Seachem Stability will rapidly and safely establish the aquarium biofilter in freshwater and marine systems
Part number:60
Set of lexan tops Preuss Pets Local Dealer Aquarium tank lids
Part number:61
Set of Various extended length aquabus cables Neptune Systems Local Dealer Cables for Apex system
Part number:62
SLSON Aquarium Algae Scraper Double Sided Sponge Brush Cleaner Long Handle Fish Tank Scrubber for Glass Aquariums Amazon B07DC2TZCJ Cleaning tool
Part number:63
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 45 Degree Elbow Adapter, 3/4 Socket Female x 3/4 Socket Male McMaster 4880K189 PVC pipe
Part number:64
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, 90 Degree Elbow Adapter, 1 Socket Female x 1 Socket Male McMaster 4880K773 PVC pipe
Part number:65
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Adapter, 1 Socket-Connect Female x 1 Barbed Male McMaster 4880K415 PVC pipe
Part number:66
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Straight Reducer, 2 Socket Female x 3/4 Socket Female McMaster 4880K008 PVC pipe
Part number:67
Standard-Wall PVC Pipe Fitting for Water, Tee Connector, White, 1 Size Socket-Connect Female McMaster 4880K43 PVC pipe
Part number:68
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 1 Pipe Size, 10 Feet Long McMaster 48925K13 PVC pipe
Part number:69
Standard-Wall Unthreaded Rigid PVC Pipe for Water, 3/4 Pipe Size, 5 Feet Long McMaster 48925K92 PVC pipe
Part number:70
Structural FRP Fiberglass Sheet, 48" Wide x 96" Long, 1/2" Thick McMaster 8537K15 Table top material
Part number:71
Structural FRP Fiberglass Square Tube, 10 Feet Long, 2" Wide x 2" High Outside, 1/8" Wall Thickness McMaster 8548K33 Structural table material
Part number:72
Tank Sediment TopDawg Pet Supply 8479001207 Sediment for bottom of fiddler crab tank
Part number:73
Temperature probe Neptune Systems Local Dealer Temperature probe for tanks
Part number:74
Tetra TetraMarine Large Saltwater Flakes for all Marine Fish Amazon B00025K0US Fish, shrimp, and crab food
Part number:75
Tetra Whisper Aquarium Air Pump for 10 gallon Aquariums Petco 2335234 Air pump for smaller tanks
Part number:76
Thick-Wall Through-Wall Pipe Fitting, for Water, PVC Connector, 1 Socket-Connect Female McMaster 36895K843 PVC pipe
Part number:77
Vectra s2 pump Bulk Reef Supply 212141 Aquarium Pump
Part number:78
Water Pump TACKLIFE GHWP1A Pump for cleaning tanks
Part number:79
Wyze Cam v2 1080p HD Indoor WiFi Smart Home Camera with Night Vision Amazon B076H3SRXG DeepLabCut Recording
Part number:80

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wet, J. R., Wood, K. V., DeLuca, M., Helinski, D. R., Subramani, S. Firefly luciferase gene: structure and expression in mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 7 (2), 725-737 (1987).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), 299 (2007).
  3. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Li, N., et al. Optogenetic-guided cortical plasticity after nerve injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (21), 8838-8843 (2011).
  5. Airan, R. D., Li, N., Gilad, A. A., Pelled, G. Genetic tools to manipulate MRI contrast. NMR Biomedicine. 26 (7), 803-809 (2013).
  6. Cywiak, C., et al. Non-invasive neuromodulation using rTMS and the electromagnetic-perceptive gene (EPG) facilitates plasticity after nerve injury. Brain Stimulation. 13 (6), 1774-1783 (2020).
  7. Hwang, J., et al. Regulation of Electromagnetic Perceptive Gene Using Ferromagnetic Particles for the External Control of Calcium Ion Transport. Biomolecules. 10 (2), (2020).
  8. Lu, H., et al. Transcranial magnetic stimulation facilitates neurorehabilitation after pediatric traumatic brain injury. Scientific Reports. 5, 14769 (2015).
  9. Krishnan, V., et al. Wireless control of cellular function by activation of a novel protein responsive to electromagnetic fields. Bioscience Reports. 8 (1), 8764 (2018).
  10. Mitra, S., Barnaba, C., Schmidt, J., Pelled, G., Gilad, A. A. Functional characterization of an electromagnetic perceptive protein. bioRxiv. , 329946 (2020).
  11. Hunt, R. D., et al. Swimming direction of the glass catfish is responsive to magnetic stimulation. PLoS One. 16 (3), 0248141 (2021).
  12. Kandel, E. R., Krasne, F. B., Strumwasser, F., Truman, J. W. Cellular mechanisms in the selection and modulation of behavior. Neurosciences Research Program bulletin. 17, 521 (1979).
  13. Carew, T. J., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. An analysis of dishabituation and sensitization of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. International Journal of Neuroscience. 2 (2), 79-98 (1971).
  14. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bioscience Reports. 21 (5), 565-611 (2001).
  15. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life-span of octopus-bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  16. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Behavior, body patterning and reproductive-biology of octopus-bimaculoides from California. Malacologia. 29 (1), 41-55 (1988).
  17. Pickford, B. M. The Octopus bimaculatus problem: A study in sibling species. Bulletin of the Bingham Oceanographic Collection. 12, 1-66 (1949).
  18. Sumbre, Y., Fiorito, G., Flash, T. Control of octopus arm extension by a peripheral motor program. Science. 293 (5536), 1845-1848 (2001).
  19. Gutfreund, Y., et al. Organization of octopus arm movements: a model system for studying the control of flexible arms. Journal of Neuroscience. 16 (22), 7297-7307 (1996).
  20. Gutfreund, Y., Matzner, H., Flash, T., Hochner, B. Patterns of motor activity in the isolated nerve cord of the octopus arm. The Biological Bulletin. 211 (3), 212-222 (2006).
  21. Hague, T., Florini, M., Andrews, P. L. R. Preliminary in vitro functional evidence for reflex responses to noxious stimuli in the arms of Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 100-105 (2013).
  22. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  23. Hochner, B., Glanzman, D. L. Evolution of highly diverse forms of behavior in molluscs. Current Biology. 26 (20), 965-971 (2016).
  24. Hvorecny, L. M., et al. Octopuses (Octopus bimaculoides) and cuttlefishes (Sepia pharaonis, S. officinalis) can conditionally discriminate. Animal Cognition. 10 (4), 449-459 (2007).
  25. Kier, W. M., Stella, M. P. The arrangement and function of octopus arm musculature and connective tissue. Journal of Morphology. 268 (10), 831-843 (2007).
  26. Levy, G., Hochner, B. Embodied organization of octopus vulgaris morphology, vision, and locomotion. Frontiers in Physiology. 8, 164 (2017).
  27. Giorgio-Serchi, F., Arienti, A., Laschi, C. Underwater soft-bodied pulsed-jet thrusters: Actuator modeling and performance profiling. The International Journal of Robotics Research. 35 (11), 1308-1329 (2016).
  28. Han, S., Kim, T., Kim, D., Park, Y., Jo, S. Use of deep learning for characterization of microfluidic soft sensors. IEEE Robotics and Automation Letters. 3 (2), 873-880 (2018).
  29. Hanassy, S., Botvinnik, A., Flash, T., Hochner, B. Stereotypical reaching movements of the octopus involve both bend propagation and arm elongation. Bioinspiration and Biomimetics. 10 (3), 035001 (2015).
  30. Hochner, B., Shomrat, T., Fiorito, G. The octopus: a model for a comparative analysis of the evolution of learning and memory mechanisms. The Biological Bulletin. 210 (3), 308-317 (2006).
  31. Imperadore, P., Fiorito, G. Cephalopod tissue regeneration: consolidating over a century of knowledge. Frontiers in Physiology. 9, 593 (2018).
  32. Imperadore, P., et al. Nerve regeneration in the cephalopod mollusc Octopus vulgaris: label-free multiphoton microscopy as a tool for investigation. Journal of the Royal Society, Interface. 15 (141), 20170889 (2018).
  33. Levy, G., Flash, T., Hochner, B. Arm coordination in octopus crawling involves unique motor control strategies. Current Biology. 25 (9), 1195-1200 (2015).
  34. Li, F., et al. Chromosome-level genome assembly of the East Asian common octopus (Octopus sinensis) using PacBio sequencing and Hi-C technology. Molecular Ecology Resources. 20 (6), 1572-1582 (2020).
  35. Lopes, V. M., Rosa, R., Costa, P. R. Presence and persistence of the amnesic shellfish poisoning toxin, domoic acid, in octopus and cuttlefish brains. Marine Environmental Research. 133, 45-48 (2018).
  36. Mazzolai, B., Margheri, L., Dario, P., Laschi, C. Measurements of octopus arm elongation: Evidence of differences by body size and gender. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 160-164 (2013).
  37. McMahan, W., et al. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. , 2336-2341 (2006).
  38. Meisel, D. V., Kuba, M., Byrne, R. A., Mather, J. The effect of predatory presence on the temporal organization of activity in Octopus vulgaris. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 447, 75-79 (2013).
  39. Nesher, N., Levy, G., Grasso, F. W., Hochner, B. Self-recognition mechanism between skin and suckers prevents octopus arms from interfering with each other. Current Biology. 24 (11), 1271-1275 (2014).
  40. Wells, M. J. Octopus : Physiology and behaviour of an advanced invertebrate. , Chapman and Hall. Halsted Press. (1978).
  41. Young, J. Z. The anatomy of the nervous system of Octopus vulgaris. , Clarendon Press. (1971).
  42. Zullo, L., Sumbre, G., Agnisola, C., Flash, T., Hochner, B. Nonsomatotopic organization of the higher motor centers in octopus. Current Biology. 19 (19), 1632-1636 (2009).
  43. Albertin, C. B., et al. The octopus genome and the evolution of cephalopod neural and morphological novelties. Nature. 524 (7564), 220-224 (2015).
  44. Albertin, C. B., Simakov, O. Cephalopod Biology: At the intersection between genomic and organismal novelties. Annual Review if Animal Biosciences. 8, 71-90 (2020).
  45. Baik, S., et al. A wet-tolerant adhesive patch inspired by protuberances in suction cups of octopi. Nature. 546 (7658), 396-400 (2017).
  46. Pikul, J. H., et al. Stretchable surfaces with programmable 3D texture morphing for synthetic camouflaging skins. Science. 358 (6360), 210 (2017).
  47. Wehner, M., et al. An integrated design and fabrication strategy for entirely soft, autonomous robots. Nature. 536 (7617), 451-455 (2016).
  48. McMahan, W., et al. Field trials and testing of the OctArm continuum manipulator. Proceedings 2006 IEEE International Conference on Robotics and Automation, 2006. ICRA. , 2336-2341 (2006).
  49. Hochner, B., Brown, E. R., Langella, M., Shomrat, T., Fiorito, G. A learning and memory area in the octopus brain manifests a vertebrate-like long-term potentiation. Journal of Neurophysiology. 90 (5), 3547-3554 (2003).
  50. Tapia-Vasquez, A. E., et al. Proteomic identification and physicochemical characterisation of paramyosin and collagen from octopus (Octopus vulgaris) and jumbo squid (Dosidicus gigas). International Journal of Food Science & Technology. 55 (10), 3246-3253 (2020).
  51. Kim, B. -M., et al. The genome of common long-arm octopus Octopus minor. GigaScience. 7 (11), (2018).
  52. Zarrella, I., et al. The survey and reference assisted assembly of the Octopus vulgaris genome. Scientific data. 6 (1), 13 (2019).
  53. Forsythe, J. W., Hanlon, R. T. Effect of temperature on laboratory growth, reproduction and life span of Octopus bimaculoides. Marine Biology. 98 (3), 369-379 (1988).
  54. Stoskopf, M. K., Oppenheim, B. S. Anatomic features of Octopus bimaculoides and Octopus digueti. Journal of Zoo and Wildlife Medicine. 27 (1), 1-18 (1996).
  55. Ramos, J. E., et al. Body size, growth and life span: implications for the polewards range shift of Octopus tetricus in south-eastern Australia. PLoS One. 9 (8), 103480 (2014).
  56. Hanlon, R. T., Forsythe, J. W. Advances in the laboratory culture of octopuses for biomedical research. Lab Animal Science. 35 (1), 33-40 (1985).
  57. Moltschaniwskyj, N. A., Carter, C. G. Protein synthesis, degradation, and retention: mechanisms of indeterminate growth in cephalopods. Physiological and Biochemical Zoology. 83 (6), 997-1008 (2010).
  58. Fiorito, G., et al. Guidelines for the care and welfare of Cephalopods in Research -A consensus based on an initiative by CephRes, FELASA and the Boyd Group. Lab Animal. 49, 2 Suppl 1-90 (2015).
  59. Valverde, J. C., Garcia, B. G. Suitable dissolved oxygen levels for common octopus (Octopus vulgaris cuvier, 1797) at different weights and temperatures: analysis of respiratory behaviour. Aquaculture. 244 (1-4), 303-314 (2005).
  60. Cardeilhac, P. T., Whitaker, B. R. Copper Treatments: Uses and Precautions. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. 18 (2), 435-448 (1988).
  61. Hodson, P. V., Borgman, U., Shear, H. Toxicity of copper to aquatic biota. Copper in the Environment. (2), John Wiley. 307-372 (1979).
  62. Poole, B. M. Techniques for the culture of ghost shrimp (palaemonetes pugio). Environmental Toxicology and Chemistry. 7 (12), 989-995 (1988).
  63. Burggren, W. W. Respiration and circulation in land crabs: novel variations on the marine design. American Zoologist. 32 (3), 417-427 (1992).
  64. Reitsma, J., Murphy, D. C., Archer, A. F., York, R. H. Nitrogen extraction potential of wild and cultured bivalves harvested from nearshore waters of Cape Cod, USA. Marine Pollution Bulletin. 116 (1), 175-181 (2017).
  65. Messenger, J. B. Cephalopod chromatophores: neurobiology and natural history. Biological Reviews. 76 (4), 473-528 (2001).
  66. Morgan Holst, M. M., Miller-Morgan, T. The Use of a species-specific health and welfare assessment tool for the giant pacific octopus, enteroctopus dofleini. Journal of Applied Animal Welfare Science. 24 (3), 272-291 (2021).
  67. Rosas, C., et al. Energy balance of Octopus maya fed crab or an artificial diet. Marine Biology. 152 (2), 371-381 (2007).
  68. Anderson, R. C., Wood, J. B., Byrne, R. A. Octopus Senescence: The Beginning of the end. Journal of Applied Animal Welfare Science. 5 (4), 275-283 (2002).
  69. Butler-Struben, H. M., Brophy, S. M., Johnson, N. A., Crook, R. J. In vivo recording of neural and behavioral correlates of anesthesia induction, reversal, and euthanasia in cephalopod molluscs. Frontiers in Physiology. 9, 109 (2018).
  70. Jiang, X., et al. Octopus visual system: A functional MRI model for detecting neuronal electric currents without a blood-oxygen-level-dependent confound. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1311-1319 (2014).
  71. Hennig, J., Nauerth, A., Friedburg, H. RARE imaging: a fast imaging method for clinical MR. Magnetic Resonance in Medicine. 3 (6), 823-833 (1986).
  72. Brant-Zawadzki, M., Gillan, G. D., Nitz, W. R. MP RAGE: a three-dimensional, T1-weighted, gradient-echo sequence--initial experience in the brain. Radiology. 182 (3), 769-775 (1992).
  73. emit-Xerra. , Available from: http://emit-imaging.com/xerra/ (2021).
  74. Bertapelle, C., Polese, G., Di Cosmo, A. Enriched environment increases PCNA and PARP1 Levels in Octopus vulgaris central nervous system: first evidence of adult neurogenesis in Lophotrochozoa. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (4), 347-359 (2017).
  75. Maselli, V., Polese, G., Soudy, A. -S. A., Buglione, M., Cosmo, A. D. Cognitive stimulation induces differential gene expression in Octopus vulgaris: The key role of protocadherins. Biology. 9, Basel. (2020).

Tags

Bioingeniør utgave 175
Etablering av et blekksprutøkosystem for biomedisinsk og bioingeniørforskning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp,… More

VanBuren, T., Cywiak, C., Telgkamp, P., Mallett, C. L., Pelled, G. Establishing an Octopus Ecosystem for Biomedical and Bioengineering Research. J. Vis. Exp. (175), e62705, doi:10.3791/62705 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter