Vellykket kimlinje transformation i efteråret armyworm, Spodoptera frugiperda, blev opnået ved hjælp af mRNA af hyperaktiv piggyBac transposase.
Stabil indsættelse af genetisk last i insektgenomer ved hjælp af transposable elementer er et kraftfuldt værktøj til funktionelle genomiske undersøgelser og udvikling af genetiske skadedyrsbekæmpelsesstrategier. Det mest anvendte transposable element i insekttransformation er piggyBac, og piggyBac-baseretkimlinjetransformation er blevet udført med succes i modelinsekter. Det er dog stadig udfordrende at anvende denne teknologi i ikke-modelinsekter, der omfatter skadedyr i landbruget. Dette papir rapporter om kimlinje transformation af en global landbrugs skadedyr, faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, ved hjælp af hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I dette arbejde blev hyPBase mRNA produceret og brugt i stedet for hjælper plasmid i embryo mikroinjections. Denne ændring førte til en vellykket generation af transgene FAW. Desuden beskrives metoderne til screening af transgene dyr, PCR-baseret hurtig påvisning af transgeneindføring og termisk asymmetrisk interlaced PCR (TAIL-PCR)-baseret bestemmelse af integrationsstedet. Således præsenterer dette papir en protokol til fremstilling af transgene FAW, som vil lette piggyBac-baserettransgenese i FAW og andre lepidopteran insekter.
Faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, er hjemmehørende i tropiske og subtropiske regioner i Amerika. I øjeblikket er dette en ødelæggende insekt planteæder i mere end 100 lande verden over1. FAW larver foder på mere end 350 værtsplanter, herunder nogle vigtige korte fødevarer afgrøder2. FAW-voksnes stærke migrationsevne bidrager til dens nylige hurtige spredning fra Amerika til andre steder1,2. Som følge heraf truer dette insekt nu fødevaresikkerheden internationalt. Anvendelse af nye teknologier kan lette avancerede undersøgelser i FAW og give nye strategier til at styre dette skadedyr.
Transformation af insektkimlinjen er blevet brugt til at studere genfunktion og generere transgene insekter til brug i genetisk kontrol3,4. Blandt de forskellige metoder, der anvendes til at opnå genetisk transformation i insekter, er piggyBac-elementbaseret metode den mest anvendte metode5. På grund af den lave gennemførelsesrate er det dog stadig udfordrende at udføre transgenese hos ikke-modelinsekter. For nylig blev en hyperaktiv version af piggyBac transposase (hyPBase) udviklet6,7. Germline transformation blev opnået i FAW for nylig8, hvilket er den første rapport, der brugte hyPBase i lepidopteran insekter. I denne rapport beskrives detaljerede oplysninger om anvendelse af hyPBase mRNA til generering af transgen FAW. Den metode, der er beskrevet her, kunne anvendes til at opnå omdannelsen af andre lepidopteran insekter.
Den lave gennemførelsesgrad og vanskeligheden ved at levere transgene komponenter til friske embryoner begrænser succesen af bakterielintransformation i mange ikke-modelinsekter, især dem fra orden, Lepidoptera. For at øge bakterielinjen transformation sats, en hyperaktiv version af de mest udbredte piggyBac transposase (hyPBase) blev udviklet7,10. Til dato er vellykket kimlinjetransformation i lepidopteran insekter hovedsageligt rapporteret i modell…
The authors have nothing to disclose.
Den rapporterede forskning er støttet af National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 og af industripartnere, Landbrug og Fødevareforskningsinitiativ Competitive Grant No. 2019-67013-29351 og National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 og 2353057000).
1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
Taq MasterMix | polymerase mixture |