Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Сбор тканей и извлечение РНК из остеоартритного коленного сустава человека

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Первичные ткани, полученные от пациентов после тотальной эндопротезирования коленного сустава, обеспечивают экспериментальную модель для исследования остеоартрита с максимальной клинической переводимостью. Этот протокол описывает, как идентифицировать, обрабатывать и изолировать РНК из семи уникальных тканей коленного сустава для поддержки механистического исследования остеоартрита человека.

Abstract

Остеоартрит (ОА) является хроническим и дегенеративным заболеванием суставов, чаще всего поражающим коленное. Поскольку в настоящее время нет лечения, тотальная эндопротезирование коленного сустава (ТКА) является распространенным хирургическим вмешательством. Эксперименты с использованием первичных тканей ОА человека, полученных из ТКА, дают возможность исследовать механизмы заболевания ex vivo. В то время как ранее считалось, что ОА влияет в основном на хрящ, теперь известно, что он влияет на несколько тканей в суставе. Этот протокол описывает отбор пациента, обработку образцов, гомогенизацию тканей, экстракцию РНК и контроль качества (на основе чистоты, целостности и выхода РНК) из каждой из семи уникальных тканей для поддержки исследования механизма заболевания в коленном суставе. С информированного согласия образцы были получены от пациентов, перенесших ТКА для ОА. Ткани рассекались, промывались и хранились в течение 4 ч после операции путем мгновенного замораживания для фиксации РНК или формалина для гистологии. Собранные ткани включали суставной хрящ, субхондральную кость, мениск, инфрапателларную жировую прокладку, передовую крестообразную связку, синовиальную часть и косую мышцу vastus medialis. Протоколы экстракции РНК были протестированы для каждого типа ткани. Наиболее значительная модификация включала метод распада, используемый для низкоклеточных, высокоматричных, твердых тканей (рассматриваемых как хрящ, кость и мениск) по сравнению с относительно высококлеточными, низкоматриксными, мягкими тканями (рассматриваемыми как жировая подушка, связка, синовий и мышца). Было обнаружено, что измельчение подходит для твердых тканей, а гомогенизация подходит для мягких тканей. Наблюдалась склонность некоторых субъектов давать более высокие значения целостности РНК (RIN), чем у других субъектов, последовательно в нескольких тканях, предполагая, что основные факторы, такие как тяжесть заболевания, могут влиять на качество РНК. Способность выделять высококачественную РНК из первичных тканей ОА человека обеспечивает физиологически релевантную модель для сложных экспериментов по экспрессии генов, включая секвенирование, которые могут привести к клиническим выводам, которые легче транслируются пациентам.

Introduction

Колено является самым большим синовиальным суставом в организме человека, состоящим из большеберцового бедренного сустава между большеберцовой и бедренной голенями и надколенника между коленной чашечкой и бедреннойкостью 1. Кости в колене выстрены суставным хрящом и поддерживаются различными соединительными тканями, включая мениски, жир, связки и мышцы, а синовиальная мембрана инкапсулирует весь сустав для создания заполненной синовиальной жидкостью полости1,2,3 (рисунок 1). Здоровое колено функционирует как подвижное шарнирное соединение, которое позволяет беспрепятственно передергиваться в лобной плоскости1,3. При патологических состояниях движение может стать ограниченным и болезненным. Наиболее распространенным дегенеративным заболеванием коленного сустава является остеоартрит (ОА)4. Известно, что различные факторы риска предрасполагают к развитию ОА, включая пожилой возраст, ожирение, женский пол, травму суставов и генетику, среди прочих5,6. В настоящее время, по оценкам, в США с симптоматическим ОА коленного сустава насчитывается 14 миллионов человек, причем распространенность увеличивается из-за роста возраста населения и показателей ожирения7,8. Первоначально считавшийся заболеванием хряща, ОА теперь понимается как заболевание всего сустава9. Обычно наблюдаемые патологические изменения при ОА включают эрозию суставного хряща, образование остеофита, утолщение субхондральной кости и воспаление синовиальнойчасти 9,10. Поскольку не существует известного лечения ОА, лечение в основном сосредоточено на лечении симптомов (например, боли)11,12,и как только ОА прогрессирует до конечной стадии, операция по замене сустава часто указывается13.

Операции по замене сустава могут быть частичной или полной заменой коленного сустава, с полной артропластикой коленного сустава (TKA), включая замену всего тибиофеморального сочленения и пателлофеморального сустава. По состоянию на 2020 год в США ежегодно выполняется около 1 миллиона ТКА14. Во время TKA хирург-ортопед резецирует верхнюю часть плато большеберцовой кости и нижние мыщелки бедренной кости(рисунок 2A,2B),которые должны быть установлены протезными имплантатами. Иногда неправильно интерпретируемые пациентами, в ТКА только 8-10 мм резецируется с конца каждой кости, которая впоследствии укупоривается или всплывается металлом. Вставной полиэтиленовый вкладыш образует несущую поверхность (т.е. прокладку) между двумя металлическими имплантатами. Кроме того, несколько компонентов мягких тканей сустава полностью или частично иссякают для достижения правильного баланса сустава. К числу этих тканей относятся медиал и латеральные мениски(рисунок 2С),инфрапателлярная жироваяподушка (рисунок 2D),передняя крестообразная связка (ПКС; Рисунок 2E),синовиум(Рисунок 2F)и vastus medialis косая мышца (VMO; Рисунок 2G) 15. Хотя ТКА, как правило, успешны для лечения ОА, около 20% пациентов сообщают о повторном возникновении боли после операции16. Наряду с высокой стоимостью и относительной инвазивностью процедуры, эти ограничения указывают на необходимость дальнейших исследований для выявления альтернативных методов лечения для смягчения прогрессирования ОА.

Для изучения механизмов заболевания при ОА, которые могут представлять новые возможности для терапевтического вмешательства, могут быть использованы экспериментальные системы, включая клетки, тканевые экспланты и животные модели. Клетки обычно культивируются в монослое и получают из первичных тканей человека или животных (например, хондроцитов, выделенных из хряща) или увековеченных клеток (например, ATDC517 и CHON-00118). Хотя клетки могут быть полезны для манипулирования экспериментальными переменными в контролируемой среде культуры, они не захватывают условия естественного сустава, которые, как известно, влияют на фенотипы клеток19. Чтобы лучше резюмировать сложный каскад химической, механической и межклеточной коммуникации, лежащей в основе ОА, альтернатива найдена в первичных образцах тканей человека или животных, независимо от того, используются ли они в свежем или культивируемом ex vivo в качестве эксплантов, для сохранения структуры ткани и микроокружения клеток20. Для изучения сустава in vivoтакже полезны маленькие (например, мышь21)и большие (например, лошадь22)животные модели для ОА (например, посредством хирургической индукции, генетического изменения или старения). Однако перевод от этих моделей к заболеваниям человека может быть ограничен анатомическими, физиологическими и метаболическими различиями, среди прочих23. Учитывая преимущества и недостатки экспериментальных систем, ключевые сильные стороны видовой специфики и поддержания внеклеточной ниши, предлагаемой первичными тканями ОА человека, максимизируют трансляционный потенциал результатов исследований.

Первичные ткани ОА человека могут быть легко получены после ТКА, что делает высокую частоту ТКА ценным ресурсом для исследований. Среди потенциальных экспериментальных применений — экспрессия генов и гистологический анализ. Чтобы реализовать потенциал первичных тканей ОА человека для этих исследовательских подходов и других, изложены следующие ключевые соображения. Во-первых, использование образцов пациентов подлежит этическому регулированию, и протоколы должны соответствовать утверждениям Институционального наблюдательного совета (IRB)24. Во-вторых, присущая человеку гетерогенность первичных пораженных тканей и влияние таких переменных, как возраст и пол, среди прочего, создают необходимость тщательного отбора пациентов (т.е. применения критериев приемлемости) и интерпретации данных. В-третьих, уникальные биологические свойства различных тканей в суставе (например, низкая клеточность хряща и мениска25)могут представлять проблемы во время экспериментов (например, выделение высокого качества и количества РНК). В этом отчете рассматриваются эти соображения и представлен протокол для отбора пациентов, обработки образцов, гомогенизации тканей, экстракции РНК и контроля качества (т.е. оценки чистоты и целостности РНК; Рисунок 3) поощрять использование первичных тканей ОА человека в исследовательском сообществе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол исследования был одобрен и следовал институциональным руководящим принципам, установленным Советом по институциональному обзору системы здравоохранения Генри Форда (IRB #13995).

1. Подбор пациента

  1. Определите пациентов из числа тех, кто должен пройти TKA с хирургом-ортопедом.
  2. Отбирайте пациентов на основе критериев приемлемости, определенных протоколом исследования. Примеры критериев включения включают в себя возраст 18 лет или старше и наличие подтвержденного диагноза остеоартрита коленного сустава. Примеры критериев исключения включают частичную замену коленного сустава или наличие подтвержденного диагноза ревматоидного артрита.
  3. Свяжитесь с пациентами, чтобы получить информированное согласие до операции.

2. Обработка образцов (для РНК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте всю обработку тканей в шкафу биобезопасности класса II и следуйте стерильным методам. Всегда надевайте соответствующие СИЗ (нитриловые перчатки, лабораторное пальто, защитные очки) при обработке образцов человека. Во время TKA образуется несколько фрагментов кости, большое количество кости / хряща потенциально будет доступно для рассечения. Из-за прогрессирования заболевания дегенерация суставного хряща может быть более серьезной на некоторых участках кости, что может быть учтено в экспериментальном дизайне. Только ткани, которые требуют электрокоагрекции для резекции, имеют тепловое повреждение края, и предпринимаются согласованные хирургические усилия для получения большинства тканей скальпелем, чтобы свести к минимуму повреждение. Резекционные ткани должны быть гидратированы в любое время с стерильным PBS.

  1. Дезинфицируйте все рабочие поверхности и оборудование 70% этанолом, обеззараживающенным РНКазой, водой, обработанной DEPC, и снова 70% этанолом. Протрите остаточную жидкость чистыми, безворсовые ткани. Щипцы, костянки и скальпели либо автоклавируют, либо вымачивают в 70% этаноле в течение не менее 10 минут перед использованием. Держите оборудование погруженным в 70% этанол, когда он не используется в непосредственной близости.
  2. Предварительно маркировать по меньшей мере три криовиала с деидентифицированным названием образца и номером аликвоты для каждой ткани (например, Хрящ 1 ТКА-1).
    1. Определите каждый тип ткани из образца на основе различий в размере, форме, цвете и текстуре, как показано и описано на рисунке 2. Определите хрящ(стрелка на рисунке 2A), кость (стрелкана рисунке 2B), мениск(рисунок 2C),подфрапателляжную жировую подушку(рисунок 2D),переднюю крестообразную связку(рисунок 2E),синовий(рисунок 2F)и косую мышцу vastus medialis(рисунок 2G).
  3. Выделяют суставной хрящ.
    1. Выберите участок кости с минимальной деградацией хряща.
    2. Используя скальпель No 10, прорежьте глубину хряща как можно дальше, чтобы рассечь всю толщину хрящевого слоя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скальпель No 10 проникает только в хрящ, а не в кость.
    3. Используя полную толщину хряща, рассекли три кубика по 5 мм.
  4. Выделяют субхондральную кость.
    1. Используйте тот же участок кости, из которого был собран хрящ.
    2. Используя скальпель No 10, соскоблите оставшиеся хрящи и остаточные ткани с поверхности кости.
    3. Держите костную часть, чтобы разрезать щипцами, и используйте костянки, чтобы разрезать три кубика по 5 мм.
  5. Изолируют мениск.
    1. Определите относительно неповрежденный участок медиаального или бокового мениска.
    2. Используя скальпель No10 и щипцы, рассекают три кубика по 5 мм.
  6. Выделяют инфрапателларную жировую подушку.
    1. Используя скальпель No 10 и щипцы, разрежьте желтую часть ткани на три одинаковые по размеру и однородные части (~ 500 мг каждая).
  7. Выделяют переднюю крестообразную связку (ACL).
    1. Используя скальпель No10 и щипцы, рассекают три кубика по 5 мм.
  8. Выделяют синовиум.
    1. Используя скальпель No10 и щипцы, максимально изолируйте розовую клеточную часть мембраны, соскоблив жировую ткань.
    2. Рассекте три равные по размеру и однородные порции (~200 мг каждая).
  9. Выделяют косую мышцу vastus medialis (VMO).
    1. Используя скальпель No 10 и щипцы, удалите из образца любую жировую ткань, оставив только красную мышечную ткань.
    2. Рассекте три кубика по 5 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начальный размер ткани ограничивает размер порций.
  10. Промойте части ткани стерильным PBS, чтобы удалить остатки или мусор.
  11. Чтобы выполнить гистологию, зафиксируйте каждый участок ткани, как описано в части 3.
  12. Чтобы выполнить экстракцию РНК, разрежьте каждую из трех частей ткани на более мелкие кусочки (~ 1-2 мм   кубиков).
    1. Переложите более мелкие кусочки в криовиальный, плотно закрепленный колпачок объемом 2 мл, заморозьте вспышкой, погружая в жидкий азот на 30 с, а затем переложите в морозильную камеру с температурой -80 °C для длительного хранения (до 4 месяцев, протестированных в текущем протоколе). Повторите это для всех аликвот всех тканей.
    2. Продолжить гомогенизацию тканей, как описано в Части 4.

3. Обработка образцов (для гистологии)

ВНИМАНИЕ: Формалин является опасным химическим веществом, используется только в химическом вытяжном вытяжке.

  1. Заполните предварительно маркированные конические пробирки 15 мл 10% раствором формалина.
  2. С помощью щипцов перенесите участок ткани в заполненные формалином трубки.
  3. Зафиксируйте ткани в формалине в течение 1 недели при комнатной температуре, встряхивая/перемешивая, если это возможно.
  4. Через 1 неделю выбрасывают формалин в надлежащую утилизацию химических отходов, промывают ткани PBS, а затем переносят в свежую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 70% этанола, для длительного хранения при 4 °C до тех пор, пока образцы не будут внедрены для секционирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только для костей/хрящей выполните декальциацию следующим образом.
  5. Через 1 неделю выбрасывайте формалин в надлежащую утилизацию химических отходов и промывайте ткани PBS.
  6. Переложить ткань в коническую трубку 50 мл с 45 мл 10% раствора ЭДТА (рН 7,4).
  7. Если встряхивание/перемешивание невозможно, переворачивают трубки 10-15 раз в день.
  8. Выбрасывайте и заменяйте раствор ЭДТА один раз в неделю.
    1. Два раза в неделю проверяйте текстуру с помощью инструмента (т. Е. Шпателя) или пальца в перчатке, чтобы подтвердить декальценцию, наблюдая деформацию при давлении. Время, необходимое для декальциации костной ткани, будет варьироваться между образцами от 4 до 6 недель.
  9. После декальцинирования промойте ткань PBS и переложите в свежую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 70% этанола, для длительного хранения при 4 °C до тех пор, пока образцы не будут внедрены для секционирования.

4. Гомогенизация тканей

ВНИМАНИЕ: В протоколе используется опасный химический фенол. Работа с фенолом должна выполняться в химическом вытяжном вытяжке.

ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно очистите все оборудование и поверхности, которые будут использоваться с 70% этанолом (замочите не менее 10 минут), затем обеззараживайте РНКазой (замочите не менее 10 минут), промойте водой, обработанной DEPC, протрите чистым бумажным полотенцем без ворса, а затем повторно распылите или замочите 70% этанолом.

  1. Гомогенизация твердых тканей (суставной хрящ, субхондральная кость, мениск)
    1. Перед гомогенизацией охладите ступку, пестик и шпатель, используя жидкий азот. Они должны храниться как можно холоднее, чтобы предотвратить оттаивания образцов.
    2. Обрабатывайте образцы по одному, сохраняя остальные образцы при -80 °C до тех пор, пока они не будут использованы.
    3. Перенесите образец ткани в раствор с помощью охлажденного шпателя; налейте дополнительный жидкий азот поверх ткани и дайте ей испариться. Раздавите ткань с помощью пестикла. Многократно добавляйте больше жидкого азота в образец ткани, дайте ему испариться, а затем продолжайте измельчение с пестиком, чтобы получить мелкий порошок.
    4. После порошкообразной ткани как можно больше переложить в предварительно охлажденный микроцентрифужный пробирку 1,5 мл.
      1. Предварительно охлаждают трубки путем погружения в жидкий азот на 30 с перед переносом ткани.
    5. Добавьте 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола в каждый пробирку и держите его на льду.
    6. Повторите шаги 4.1.3-4.1.5 для каждого образца твердой ткани.
    7. После каждой ткани очистите раствор, пестик и шпатель 70% этанолом, обеззараживателем РНКазы, водой, обработанной DEPC, и дополнительным замачинием в 70% этаноле. Протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью.
    8. Инкубировать образцы на льду еще 20 минут.
  2. Гомогенизация мягких тканей (инфрапателляжная жировая прокладка, ACL, синовиальная, VMO)
    1. Дезинфицируйте гомогенизатор с помощью прогона из 70% этанола, обеззараживающего РНКазы, воды, обработанной DEPC, и дополнительной промывки 70% этанола, каждая в течение 30 с. Протрите любую остаточную жидкость чистой, безворсовой тканью. Повторите это между каждым примером.
    2. Предварительно маркировать 5 мл круглых донных трубок для каждого образца. Добавьте 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола в каждую пробирку.
      1. Работайте с одним образцом за раз, сохраняя другие образцы для обработки при -80 °C до использования.
    3. Переложите ткань в предварительно маркированную пробирку 5 мл с кислотой-гуанидиниум-фенолом.
    4. Гомогенизируют ткани в импульсах 30 с, удерживая на льду во время и между импульсами. Повторяйте до тех пор, пока ткань не растворится визуально или максимум пять импульсов по 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые фиброзные ткани (т.е. мышцы) могут не полностью гомогенизироваться.
    5. Инкубируют растворенные ткани на льду и переходят к следующему образцу.
      1. Очистите гомогенизатор, как описано на этапе 4.2.1. Следите за тем, чтобы куски тканей не оставались в зубах зонда; при необходимости удалить стерильными щипцами.
    6. После гомогенизации всех образцов инкубируют на льду в кислоте-гуанидиниум-феноле еще 20 мин.
    7. Перенесите образцы из трубок с круглым дном в предварительно маркированные и предварительно охлажденные микроцентрифужные трубки 1,5 мл.

5. Извлечение РНК из тканей

ВНИМАНИЕ: В этом протоколе используются опасные химические вещества, такие как фенол, хлороформ и изопропанол. Выполняйте всю работу в химическом вытяжном вытяжке.

ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование и реагенты зарезервированы только для работы с РНК и должны иметь надлежащий химический класс для молекулярных применений (т.е. стерильные, без нуклеаз). Этот протокол является преемником протоколов гомогенизации тканей в частях 4.1 и 4.2. Тщательно очистите все оборудование и поверхности, которые будут использоваться с 70% этанолом (замочите не менее 10 минут), а затем обеззаражительным средством РНКазы (замочите не менее 10 минут). Смойте водой, обработанной DEPC, протрите остаточную жидкость чистым бумажным полотенцем без ворса, а затем распылить или замочить 70% этанолом.

  1. Центрифугировать микроцентрифужные трубки при 10000 х г в течение 10 мин при 4 °C для гранулирования мусора.
  2. Перенесите супернатант в свежую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для жировых тканей липидный слой иногда будет присутствовать сверху. Избегайте переноса этого, прокалывая слой на боковой стороне трубки наконечником пипетки.
  3. Добавьте 200 мкл хлороформа на 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола к каждому образцу. Энергично встряхните трубки вручную в течение 30 с, чтобы перемешать. Затем высиживают на льду в течение 2 мин.
  4. Центрифужные образцы при 10000 х г в течение 12 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования образуются три слоя: водный, содержащий РНК, белая интерфаза ДНК и фаза розового белка внизу.
  5. Перенесите ~500 мкл верхней водной фазы в свежую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте межфазную и белковую фракции. Храните эти фазы при -80 °C для будущего выделения ДНК или белка.
  6. Добавьте равный объем раствора кислоты-гуанидиний-фенола в перенесенную водный фазу, перемешайте путем переворачивания трубки 8-10 раз. Высиживать трубку на льду в течение 20 мин.
  7. Добавьте 200 мкл хлороформа на 1 мл раствора кислоты-гуанидиний-фенола к каждому образцу. Энергично встряхните вручную в течение 30 с, чтобы перемешать, а затем инкубировать на льду в течение 2 минут.
  8. Центрифужные образцы при 10000 х г в течение 12 мин при 4 °C.
  9. Перенесите <500 мкл водной фазы в свежую микроцентрифужную трубку, стараясь не загрязнить образец другими фазами.
    ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Откажитесь от остальных этапов с использованием соответствующих методов удаления опасных материалов.
  10. Добавьте равный объем (в виде водной фазы) 100% изопропанола в каждый образец. Перемешать, перевернутый тюбик 8-10 раз. Насиживать на льду в течение 5 мин.
    1. Добавьте 1 мкл копреципитатора гликогена к каждому образцу, чтобы помочь в обнаружении гранул РНК после центрифугирования.
  11. Центрифугировать образцы при 12000 х г в течение 25 мин при 4 °C.
  12. Распоставь гранулу в пробирке (если использовать копреципитант, она будет выглядеть синей). Осторожно вылейте супернатант.
  13. Промыть гранулу, добавив 1 мл ледяного 75% этанола к каждому образцу, вихрь, чтобы выбить гранулу со дна трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 75% этанола, используя чистый этанол молекулярного класса и воду без нуклеазы.
  14. Центрифуга при 7000 х г в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно вылейте супернатант.
  15. Повторите шаги 5.13 и 5.14 еще два раза.
  16. Быстрое отжим (<2000 х г в течение 5 с) для приведения любой остаточной жидкости на дно трубки. Используйте пипетку P20, чтобы удалить любой остаточный этанол из нижней части трубок.
    1. Избегайте прикосновения к грануле РНК наконечником пипетки. Меняйте подсказки между образцами.
  17. С открытыми крышками трубок, сухие на воздухе образцы при комнатной температуре в течение 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы могут стать полупрозрачными по мере высыхания. Обеспечение того, чтобы весь остаточный этанол испарился, улучшит чистоту РНК.
  18. Добавьте 25 мкл воды без нуклеазы в каждую трубку, чтобы растворить гранулу.
  19. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
  20. Аккуратно пипетку вверх и вниз, чтобы смешать РНК.
  21. Аликвота 5 мкл образца в свежую пробирку для анализа контроля качества(Часть 6). Хранить оставшиеся 20 мкл при -80 °C для анализа экспрессии генов.

6. Контроль качества

  1. Определить концентрацию и чистоту РНК можно с помощью спектрофотометра согласно инструкции производителя.
  2. Определить целостность РНК с помощью устройства электрофореза согласно инструкции производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавляем РНК, чтобы она была в пределах диапазона пределов обнаружения чипа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Семь уникальных тканей коленного сустава человека доступны для сбора у пациентов, проходящих TKA для ОА(рисунок 1). В этом протоколе каждая из этих тканей была идентифицирована и обработана в течение 4 ч после хирургического удаления(рисунок 2). Следуя шагам, описанным на рисунке 3,части каждой ткани были закреплены формалином для гистологической оценки(рисунок 4),в то время как другие части были заморожены во вспышке для выделения РНК. Отделяя твердые ткани от мягких тканей методом дезинтеграции (измельчение против гомогенизации соответственно), РНК высокой целостности и чистоты извлекалась из каждого типа тканей, причем репрезентативные результаты показаны в таблице 1 (Столбцы высокого качества). Примечательно, что некоторые субъекты дали РНК более низкого качества в нескольких тканях(Таблица 1,Столбцы низкого качества), предполагая, что, несмотря на оптимизированный метод, внешние факторы (например, тяжесть заболевания) могут влиять на качество РНК по типам тканей.

Figure 1
Рисунок 1:Схема коленного сустава человека, показывающая боковое поперечное сечение. Каждая из семи меченых тканей собирается во время TKA и используется в исследовательских целях, как описано в этом протоколе. VMO = vastus medialis косая мышца. Изображение получено и изменено из OpenStax College под лицензией creative commons26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Репрезентативные грубые изображения для каждой из семи тканей, полученных от пациентов, перенесших ТКА. (A) Переднийсрез бедренной кости стрелкой, указывающей на суставной хрящ, который необходимо собрать. Хрящ идентифицируется по беловатым слою, обнаруженного на поверхности кости. (B) Передняя бедренная кость, разрезанная стрелкой, указывающей на субхондральную кость, которую необходимо собрать. (C) Мениск. Избегайте сбора сгоревших участков, вызванных электрокаутеризацией во время TKA. (D) Инфрапателларная жировая подушка (желтого цвета). (E)Передняя крестообразная связка (белая, фиброзная, губчатая ткань). (F) Синовиум. Одна сторона будет казаться светлой и волокнистой, часто содержащей жировую ткань, в то время как противоположная сторона будет казаться розоватой и менее волокнистой. Розовая сторона мембраны содержит синовиальную оболочку. (G) Vastus medialis косая мышца (красная). Это часто может быть самая маленькая часть ткани и может содержать некоторую жировую ткань. Шкала = 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Обзор шагов, предпринятых для сбора первичных тканей ОА человека для гистологии и РНК. Этот протокол описывает отбор пациентов, обработку образцов для гистологии и РНК, гомогенизацию тканей для твердых тканей и мягких тканей, экстракцию РНК и контроль качества для семи первичных тканей ОА коленного сустава человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Гистологические срезы для каждой из семи тканей, полученных от пациентов, перенесших ТКА. Гематоксилиновые и эозиновые окрашенные участки показаны при 6-кратном увеличении в панелях A-F со вставкой, увеличенной до 40x в панелях A'-F' и A". (А, А') Суставной хрящ; (A, A") субхондральная кость; (B, B') мениск; (C, C') инфрапателларная жировая подушка; (D, D') передняя крестообразная связка; (E, E') синовий; (F, F') vastus medialis косая мышца. Шкала стержней = 400 мкм для A-F и 50 мкм для A'-F' и A". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Ткань N РИН [РНК] (нг/мкл) в 25 мкл A260:A280 A260:A230
Высокое качество Низкое качество Высокое качество Низкое качество Высокое качество Низкое качество Высокое качество Низкое качество Высокое качество Низкое качество
"Твердые ткани"
Суставной хрящ 10 4 7.0 ± 0.8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1.80 ± 0.09 1.47 ± 0.34 1.40 ± 0.36 0,45 ± 0,26
Субхондральная кость 10 4 7.8 ± 0.6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1.96 ± 0.05 1.90 ± 0.17 1.72 ± 0.27 1.12 ± 0.62
Мениск 10 4 7.5 ± 0.6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1.91 ± 0.05 1.71 ± 0.15 1.41 ± 0.47 0.77 ± 0.59
"Мягкие ткани"
Инфрапателларная жировая подушка 10 3 8.5 ± 0.6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1.99 ± 0.01 2.02 ± 0.03 2.09 ± 0.17 1.47 ± 0.71
Передняя крестообразная связка 8 3 7.4 ± 0.4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1.97 ± 0.03 1.91 ± 0.18 1.88 ± 0.20 1.35 ± 0.70
Синовиум 9 3 8.5 ± 0.6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1.99 ± 0.04 2.00 ± 0.03 2.05 ± 0.11 1.91 ± 0.20
Вастус Медиалис Косой 9 3 8.5 ± 0.6 8.4 ± 0.7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1.96 ± 0.03 1.99 ± 0.03 1.82 ± 0.11 1.62 ± 0.27

Таблица 1. Качество и количество РНК, выделенной из тканей ОА, собранных у пациентов с ТКА. RIN = Число целостности РНК. Данные, представленные в виде среднего ± стандартное отклонение для RIN, A260:A280 и A260:A230 ratios и среднее (диапазон) для значений концентрации РНК. Высококачественные образцы состоят из пациентов, у которых все типы тканей давали РНК с RIN > 6 (n = 8-10). Образцы низкого качества состоят из пациентов, у которых несколько типов тканей дали РНК с RIN < 6 (n = 3-4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленный протокол оказался успешным для сбора семи первичных тканей ОА человека для экстракции РНК(таблица 1)и гистологической обработки(рисунок 4). Перед сбором образцов пациента необходимо установить протокол, одобренный IRB, в идеале в сотрудничестве с хирургом или хирургической командой. Применение стандартизированного протокола для сбора образцов (например, резекция из последовательных мест in situ) имеет важное значение для максимизации экспериментальной воспроизводимости. Образцы тканей должны быть транспортированы в лабораторию в стерильных контейнерах и обработаны в течение 4 ч после операции, чтобы избежать деградации. Во время рассечения и обработки тканей все ткани увлажняются в стерильном PBS и промываются в свежем, стерильном PBS для удаления потенциальных поверхностных загрязнений, таких как биожидкость и другой нежелательный мусор, прежде чем быть замороженными во вспышке для экстракции РНК или формалин-фиксированным для гистологии. Полезным применением гистологического анализа является подтверждение типов тканей и тяжести заболевания, поскольку их можно различить по количеству клеток, распределению и морфологии, среди других факторов, наблюдаемых стандартными пятнами, такими как гематоксилин и эозин(рисунок 4).

Первичные ткани ОА человека могут представлять проблемы для извлечения РНК достаточного количества и качества, как определено чистотой и целостностью27. Количество РНК является функцией общей клеточности ткани, и в коленном суставе есть низкоклеточные ткани с высоким матриксом, такие как хрящ, кость и мениск, и относительно высококлеточные, низкоматричные ткани, такие как жировая подушка, ACL, синовий и VMO. Например, как суставной гиалиновый хрящ, так и фиброхрящ мениска28 характеризуются низкой клеточностью, при этом внеклеточный матрикс содержит различное количество коллагенов, протеогликанов и других гликопротеинов28,29. Наличие меньшего количества клеток приводит к меньшему количеству РНК на объем ткани (уменьшение количества), а наличие большего количества белка приводит к совместной очистке с РНК (снижение чистоты)25,30. Чистота РНК может быть определена с помощью спектрофотометрии, где A260:A280 и A260:A230 значения <1,5 отражают присутствие органических загрязнителей (например, белка), а значения ~ 2,0 отражают чистую РНК31. Целостность РНК отражает уровень деградации, вызванной экспериментальными условиями (т.е. сдвиговыми силами) или ферментативным пищеварением (например, нуклеазами), и часто определяется электрофоретическим анализом. Число целостности РНК (RIN) 1 отражает деградивированную РНК, а RIN 10 отражает неповрежденную РНК31,32. Для РНК-секвенирования часто рекомендуется минимум RIN 733,34,35. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что эти пороги A260:A280, A260:A230и RIN были достигнуты во всех тканях из образцов пациента в группе высококачественной РНК по сравнению с образцами пациентов в группе РНК низкого качества, за исключением некоторых A260:A230 значения, которые могут отражать белковое загрязнение РНК в низкоклеточных, высокотриксных тканях. Хотя есть много факторов, которые могут способствовать качеству РНК, выделенной из данного образца пациента, среди них может быть уровень тяжести заболевания. Болезненная природа тканей ОА предполагает, что деградационные процессы происходят из-за повышенного уровня ферментов, которые могут переваривать ткани, а также РНК, тем самым снижая качество.

Этот протокол для экстракции РНК направлен на максимизацию количества и качества РНК из первичных тканей ОА человека. Наиболее важный этап касался того, были ли ткани распылены в результате измельчения или гомогенизации, и было обнаружено, что это коррелирует с клеточностью ткани и составом матрицы. Первоначально все семь тканей подвергали одному и тому же протоколу, где ткани сначала измывались раствором и пестиком с использованием жидкого азота, затем переносились в раствор кислоты-гуанидиний-фенола и далее гомогенизировали с использованием ручного гомогенизатора тканей. Этот метод дал благоприятный выход РНК, чистоту и целостность для жировой подушки, ACL, синовиума и VMO (в совокупности мягкие ткани; также, относительно высококлеточные, с низким матриксом), но неблагоприятные результаты для хряща, кости и мениска (в совокупности твердые ткани; также, низкоклеточные, высокоматричные). На основании этих наблюдений семь тканей были разделены на две группы для дальнейшего уточнения протокола. Было отмечено, что дополнительная гомогенизация оказывает минимальное влияние на дальнейшее разрушение твердых тканей после того, как они были измельчены в мелкий порошок. И наоборот, диссоциация мягких тканей была успешно достигнута только гомогенизацией и не требовала измельчения. Поэтому гомогенизация твердых тканей и измельчение мягких тканей были устранены. Это было полезно для минимизации сил сдвига, времени обработки и колебаний температуры, которые могут улучшить целостность РНК. Было выполнено два раунда разделения фаз фенола / хлороформа для всех семи тканей, поскольку сообщалось, что это улучшает чистоту РНК без снижения выхода31.

Потенциальным ограничением этого протокола является эффект партии, который может возникнуть при разделении тканей на две группы, если экспериментальный дизайн требует сравнения между всеми тканями. Использование методов измельчения в сравнении с методами гомогенизации может изменить технические (например, время обработки) и экологические (например, колебания температуры) условия, которые могут привести к изменчивости36. Вторым ограничением является потенциальная непоследовательность в идентификации, рассечении и ориентации (для гистологического сечения) тканей внутри и между субъектами. Третьим ограничением является наша неспособность подтвердить потенциальную корреляцию между тяжестью заболевания пациента и качеством РНК в текущем отчете. Четвертым ограничением является отсутствие наличия здоровых контрольных тканей для сравнения. Хотя контрольные образцы могут быть доступны из трупов, они менее доступны, чем ткани ОА из TKA. Экспериментальная стратегия, чтобы обойти это, заключается в использовании каждого субъекта в качестве своего собственного контроля, будь то сравнение между тканями или внутри тканей, сравнивающих лечение с контролем или поражение с сохраненными областями. Наконец, использование тканевых эксплантов для экстракции РНК не позволяет проводить анализ экспрессии генов отдельных типов клеток, которые составляют ткани (например, синовиальные фибробласты против синовиальных макрофагов37).

Несмотря на отмеченные ограничения, первичные ткани ОА человека являются ценным ресурсом для исследований, предлагая преимущества перед другими экспериментальными системами для ОА, включая сохранение клеточной ниши23. Тем не менее, первичные ткани ОА человека могут быть недостаточно использоваться в исследованиях из-за логистических или технических проблем. Этот протокол описывает отбор пациентов, обработку образцов, гомогенизацию тканей, экстракцию РНК и контроль качества для поддержки использования образцов, полученных из TKA. После обработки образцов можно использовать несколько экспериментальных подходов, включая экспрессию генов и гистологию, среди прочих. Наиболее актуальной для быстро развивающейся области омики является способность выделять достаточное количество высококачественной РНК для таких применений, как секвенирование РНК38,39. Молекулярные профили могут быть сопоставлены внутри и между тканями субъектов с определенными фенотипами заболевания (например, на основе возраста, пола и других факторов риска ОА). Полученные идеи могут помочь в новых терапевтических путях, которые могут быть более легко переведены обратно в популяцию пациентов с ОА.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят участников исследования, которые сделали это исследование возможным, и посвящают этот отчет новым ученым в области остеоартрита.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Tags

Биология выпуск 173
Сбор тканей и извлечение РНК из остеоартритного коленного сустава человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter