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Biology

Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Les tissus primaires obtenus chez les patients après une arthroplastie totale du genou fournissent un modèle expérimental pour la recherche sur l’arthrose avec une translatabilité clinique maximale. Ce protocole décrit comment identifier, traiter et isoler l’ARN de sept tissus uniques du genou pour soutenir la recherche mécaniste dans l’arthrose humaine.

Abstract

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire chronique et dégénérative qui affecte le plus souvent le genou. Comme il n’existe actuellement aucun remède, l’arthroplastie totale du genou (ATK) est une intervention chirurgicale courante. Des expériences utilisant des tissus d’arthrose humaine primaires obtenus à partir de TKA fournissent la capacité d’étudier les mécanismes de la maladie ex vivo. Alors que l’arthrose était auparavant considérée comme ayant un impact principalement sur le cartilage, on sait maintenant qu’elle affecte plusieurs tissus de l’articulation. Ce protocole décrit la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (basé sur la pureté, l’intégrité et le rendement de l’ARN) de chacun des sept tissus uniques pour soutenir l’investigation du mécanisme de la maladie dans l’articulation du genou. Avec le consentement éclairé, des échantillons ont été prélevés sur des patients souffrant d’ATK pour l’arthrose. Les tissus ont été disséqués, lavés et stockés dans les 4 heures qui ont suivi la chirurgie par congélation éclair pour la fixation de l’ARN ou du form formel pour l’histologie. Les tissus prélevés comprenaient le cartilage articulaire, l’os sous-chondral, le ménisque, le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, la synoviale et le muscle oblique vastus medialis. Des protocoles d’extraction d’ARN ont été testés pour chaque type de tissu. La modification la plus importante concernait la méthode de désintégration utilisée pour les tissus durs à cellules basses et à matrice élevée (considérés comme cartilage, os et ménisque) par rapport aux tissus mous à cellules relativement hautes et à matrice basse (considérés comme coussinet adipeux, ligament, synoviale et muscle). Il a été constaté que la pulvérisation était appropriée pour les tissus durs et que l’homogénéisation était appropriée pour les tissus mous. Une propension de certains sujets à produire des valeurs de nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) plus élevées que d’autres sujets de manière cohérente dans plusieurs tissus a été observée, suggérant que des facteurs sous-jacents tels que la gravité de la maladie peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN. La capacité d’isoler de l’ARN de haute qualité à partir de tissus humains primaires d’arthrose fournit un modèle physiologiquement pertinent pour des expériences sophistiquées d’expression génique, y compris le séquençage, qui peuvent conduire à des connaissances cliniques qui sont plus facilement traduites pour les patients.

Introduction

Le genou est la plus grande articulation synoviale du corps humain, comprenant l’articulation tibofemorale entre le tibia et le fémur et l’articulation fémoro-patellaire entre la rotule et le fémur1. Les os du genou sont tapissés de cartilage articulaire et soutenus par divers tissus conjonctifs, y compris les méniques, la graisse, les ligaments et les muscles, et une membrane synoviale encapsule toute l’articulation pour créer une cavité remplie de liquide synovial1,2,3 ( Figure1). Un genou sain fonctionne comme une articulation de charnière mobile qui permet un mouvement sans friction dans le plan frontal1,3. Dans des conditions pathologiques, les mouvements peuvent devenir restreints et douloureux. La maladie dégénérative de l’articulation du genou la plus courante est l’arthrose (OA)4. Une variété de facteurs de risque sont connus pour prédisposer au développement de l’arthrose, y compris l’âge avancé, l’obésité, le sexe féminin, les traumatismes articulaires et la génétique, entre autres5,6. On estime actuellement à 14 millions le nombre de personnes atteintes d’arthrose symptomatique du genou aux États-Unis, la prévalence augmentant en raison de l’augmentation de l’âge de la population et des taux d’obésité7,8. Initialement considérée comme une maladie du cartilage, l’arthrose est maintenant comprise comme une maladie de l’ensemble de l’articulation9. Les changements pathologiques couramment observés dans l’arthrose comprennent l’érosion du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, l’épaississement osseux sous-chondral et l’inflammation de la synoviale9,10. Comme il n’existe pas de remède connu pour l’arthrose, les traitements se concentrent principalement sur la gestion des symptômes (par exemple, la douleur)11,12, et une fois que l’arthrose a progressé au stade final, la chirurgie de remplacement articulaire est souvent indiquée13.

Les chirurgies de remplacement articulaire peuvent être des arthroplasties partielles ou totales du genou, avec une arthroplastie totale du genou (TKA), y compris le remplacement de toute l’articulation tibofémorale et de l’articulation fémoro-patellaire. En 2020, environ 1 million de TKA sont effectuées aux États-Unis chaque année14. Au cours de l’ATK, un chirurgien orthopédiste réséque la partie supérieure du plateau tibial et les condyles fémoraux inférieurs(Figure 2A,2B)à équiper d’implants prothétiques. Parfois mal interprété par les patients, dans un TKA, seulement 8-10 mm sont réséqués à partir de l’extrémité de chaque os, qui est ensuite coiffé ou resurfacé, avec du métal. Une doublure en polyéthylène interposée forme la surface de roulement (c.-à-d. le rembourrage) entre les deux implants métalliques. En outre, plusieurs composants des tissus mous de l’articulation sont entièrement ou partiellement excisés pour atteindre un bon équilibre articulaire. Parmi ces tissus figurent les ménesques médiaux et latéraux(Figure 2C),le coussinet adipeux infrapellaire(Figure 2D),le ligament croisé antérieur (LCA; Figure 2E), synoviale (Figure 2F) et muscle oblique vastus medialis (VMO; Figure 2G) 15. Bien que les ENTK réussissent généralement pour le traitement de l’arthrose, environ 20% des patients signalent une réapparition de la douleur après la chirurgie16. En plus du coût élevé et du caractère relativement invasif de la procédure, ces limites soulignent la nécessité de recherches supplémentaires pour identifier d’autres traitements afin d’atténuer la progression de l’arthrose.

Pour explorer les mécanismes pathologiques de l’arthrose qui peuvent présenter de nouvelles voies d’intervention thérapeutique, des systèmes expérimentaux, y compris des cellules, des explants tissulaires et des modèles animaux, peuvent être utilisés. Les cellules sont généralement cultivées en monocouche et sont dérivées de tissus humains ou animaux primaires (par exemple, des chondrocytes isolés du cartilage) ou de cellules immortalisées (par exemple, ATDC517 et CHON-00118). Bien que les cellules puissent être utiles pour manipuler des variables expérimentales dans un environnement de culture contrôlée, elles ne capturent pas les conditions de l’articulation naturelle qui sont connues pour avoir un impact sur les phénotypes cellulaires19. Pour mieux récapituler la cascade complexe de communication chimique, mécanique et cellulaire à cellule sous-jacente à l’arthrose, une alternative est trouvée dans les échantillons de tissus humains ou animaux primaires, qu’ils soient utilisés frais ou cultivés ex vivo comme explants, pour préserver la structure tissulaire et le microenvironnement cellulaire20. Afin d’étudier l’articulation in vivo,de petits modèles animaux (p. ex., souris21) et grands (p. ex., cheval22)pour l’arthrose (p. ex., induction chirurgicale, altération génétique ou vieillissement) sont également utiles. Cependant, la traduction de ces modèles à la maladie humaine peut être limitée par des différences anatomiques, physiologiques et métaboliques, entre autres23. Compte tenu des avantages et des inconvénients des systèmes expérimentaux, les principaux atouts d’être spécifiques à l’espèce et de maintenir la niche extracellulaire offerte par les principaux tissus humains d’arthrose maximisent le potentiel translationnel des résultats de la recherche.

Les tissus humains primaires d’arthrose peuvent être facilement obtenus après l’ATK, ce qui fait de la fréquence élevée des ATK une ressource précieuse pour la recherche. Parmi les applications expérimentales potentielles figurent l’expression génique et les analyses histologiques. Pour réaliser le potentiel des tissus humains primaires d’arthrose pour ces approches de recherche et d’autres, les considérations clés suivantes sont décrites. Premièrement, l’utilisation d’échantillons de patients est assujettie à une réglementation éthique, et les protocoles doivent être conformes aux approbations de la Commission d’examen institutionnel(CISR) 24. Deuxièmement, l’hétérogénéité inhérente des tissus humains primaires malades et l’influence de variables telles que l’âge et le sexe, entre autres, créent la nécessité d’une sélection minutieuse des patients (c.-à-d. l’application de critères d’admissibilité) et d’une interprétation des données. Troisièmement, les propriétés biologiques uniques de différents tissus de l’articulation (p. ex., faible cellularité du cartilage et du ménisque25)peuvent présenter des défis lors d’expériences (p. ex., isoler une qualité et une quantité élevées d’ARN). Le présent rapport aborde ces considérations et présente un protocole pour la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (c.-à-d. évaluation de la pureté et de l’intégrité de l’ARN; Graphique 3) encourager l’utilisation de tissus humains primaires d’arthrose dans le milieu de la recherche.

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Protocol

Ce protocole d’étude a été approuvé et a suivi les lignes directrices institutionnelles établies par le Henry Ford Health System Institutional Review Board (CISR no 13995).

1. Sélection des patients

  1. Identifiez les patients parmi ceux qui doivent subir une ATK avec un chirurgien orthopédiste.
  2. Sélectionnez les patients en fonction des critères d’éligibilité définis par le protocole de l’étude. Des exemples de critères d’inclusion comprennent le fait d’être âgé de 18 ans ou plus et d’avoir un diagnostic confirmé d’arthrose du genou. Des exemples de critères d’exclusion comprennent le remplacement partiel du genou ou le fait d’avoir un diagnostic confirmé de polyarthrite rhumatoïde.
  3. Communiquez avec les patients pour obtenir un consentement éclairé avant la chirurgie.

2. Traitement de l’échantillon (pour l’ARN)

REMARQUE: Effectuer tous les traitements tissulaires dans une armoire de biosécurité de classe II et suivre des techniques stériles. Portez toujours un EPI approprié (gants en nitrile, blouse de laboratoire, lunettes de sécurité) lors du traitement des échantillons humains. Plusieurs fragments d’os sont produits pendant l’ATK, une grande quantité d’os / cartilage sera potentiellement disponible pour la dissection. En raison de la progression de la maladie, la dégénérescence du cartilage articulaire peut être plus grave sur certaines parties osseuses, ce qui peut être pris en compte dans la conception expérimentale. Seuls les tissus qui imposent l’électrocautérisation pour la résection ont des dommages aux bords thermiques, et un effort chirurgical concerté est fait pour obtenir la plupart des tissus avec un scalpel afin de minimiser les dommages. Les tissus réséqués doivent être maintenus hydratés en tout temps avec du PBS stérile.

  1. Désinfectez toutes les surfaces de travail et l’équipement avec de l’éthanol à 70 %, du décontaminant RNase, de l’eau traitée au DEPC, et encore une fois avec de l’éthanol à 70 %. Essuyez le liquide résiduel avec des tissus propres et non pelucheux. Les pinces, les coupe-os et les scalpels sont autoclavés ou trempés dans de l’éthanol à 70% pendant au moins 10 minutes avant utilisation. Gardez l’équipement immergé dans de l’éthanol à 70 % lorsqu’il n’est pas utilisé immédiatement.
  2. Pré-étiqueter au moins trois cryoviaux avec le nom de l’échantillon anonymié et le numéro aliquote pour chaque tissu (p. ex., TKA-1 Cartilage 1).
    1. Identifiez chaque type de tissu de l’échantillon en fonction des différences de taille, de forme, de couleur et de texture, comme indiqué et décrit à la figure 2. Identifier le cartilage(Flèche de la figure 2A), l’os (flèchede la figure 2B), le ménisque(figure 2C),le coussinet adipeux infrapacellaire(figure 2D),le ligament croisé antérieur(figure 2E),la synoviale(figure 2F)et le muscle oblique vastus medialis(figure 2G).
  3. Isoler le cartilage articulaire.
    1. Sélectionnez une partie osseuse avec une dégradation minimale du cartilage.
    2. À l’aide d’un scalpel n° 10, coupez à travers la profondeur du cartilage autant que possible pour disséquer toute l’épaisseur de la couche de cartilage.
      REMARQUE: Un scalpel n ° 10 ne pénètre que dans le cartilage, pas dans les os.
    3. En utilisant toute l’épaisseur du cartilage, disséquez trois cubes de 5 mm.
  4. Isoler l’os sous-chondral.
    1. Utilisez la même section osseuse à partir de laquelle le cartilage a été recueilli.
    2. À l’aide d’un scalpel n° 10, grattez tout le cartilage restant et les tissus résiduels de la surface osseuse.
    3. Tenez la partie osseuse à couper avec une pince et utilisez les coupe-os pour couper trois cubes de 5 mm.
  5. Isolez le ménisque.
    1. Identifier une partie relativement intacte du ménisque médial ou latéral.
    2. À l’aide d’un scalpel et d’une pince No.10, disséquez trois cubes de 5 mm.
  6. Isolez le coussinet adipeux infrapacellaire.
    1. À l’aide d’un scalpel n° 10 et d’une pince, coupez la partie jaune du tissu en trois portions homogènes et de taille égale (~ 500 mg chacune).
  7. Isoler le ligament croisé antérieur (LCA).
    1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince No.10, disséquez trois cubes de 5 mm.
  8. Isolez la synoviale.
    1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince n° 10, isolez autant que possible la partie cellulaire rose de la membrane en grattant le tissu adipeux.
    2. Disséquez trois portions homogènes et de taille égale (~200 mg chacune).
  9. Isoler le muscle oblique vastus medialis (VMO).
    1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince n° 10, retirez tout tissu adipeux de l’échantillon, en ne laissant que le tissu musculaire rouge.
    2. Disséquer trois cubes de 5 mm.
      REMARQUE: La taille initiale du tissu limite la taille des portions.
  10. Rincez les portions de tissu avec du PBS stérile pour éliminer tout résidu ou débris.
  11. Pour effectuer l’histologie, fixez chaque portion de tissu comme décrit dans la partie 3.
  12. Pour effectuer l’extraction de l’ARN, coupez chacune des trois parties de tissu en plus petits morceaux (~ cubes de 1-2   mm).
    1. Transférer hermétiquement les plus petits morceaux dans un bouchon cryovial sécurisé de 2 mL, congeler en s’immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 s, puis transférer dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme (jusqu’à 4 mois testés dans le protocole actuel). Répétez ceci pour toutes les aliquotes de tous les tissus.
    2. Continuer à Homogénéisation tissulaire telle que décrite dans la partie 4.

3. Traitement des échantillons (pour l’histologie)

ATTENTION: Le forgé est un produit chimique dangereux, utilisé uniquement dans une hotte chimique.

  1. Remplissez des tubes coniques pré-marqués de 15 mL avec une solution de forme à 10%.
  2. À l’aide de pinces, transférez la section de tissu dans les tubes remplis de for formel.
  3. Fixez les tissus dans le for formel pendant 1 semaine à température ambiante tout en secouant / agitant si possible.
  4. Après 1 semaine, jeter le forme dans l’élimination appropriée des déchets chimiques, rincer les tissus avec du PBS, puis transférer dans un tube conique frais de 15 ml contenant 70% d’éthanol pour un stockage à long terme à 4 ° C jusqu’à ce que les échantillons soient incorporés pour le sectionnement.
    REMARQUE: Pour les os / cartilage uniquement, effectuez la décalcification comme suit.
  5. Après 1 semaine, jeter le forme dans une élimination appropriée des déchets chimiques et rincer les tissus avec du PBS.
  6. Transférer le tissu dans un tube conique de 50 mL avec 45 mL de solution d’EDTA à 10 % (pH 7,4).
  7. Si l’agitation n’est pas possible, inverser les tubes 10 à 15 fois par jour.
  8. Jetez et remplacez la solution EDTA une fois par semaine.
    1. Deux fois par semaine, testez la texture avec un instrument (c.-à-d. une spatule) ou un doigt ganté pour confirmer la décalcification en observant la déformation lorsque la pression est appliquée. Le temps nécessaire pour décalcifier le tissu osseux variera entre les échantillons de 4 à 6 semaines.
  9. Une fois décalcifié, rincer le tissu avec du PBS et transférer dans un tube conique frais de 15 mL contenant 70 % d’éthanol pour un stockage à long terme à 4 °C jusqu’à ce que les échantillons soient incorporés pour le sectionnement.

4. Homogénéisation tissulaire

ATTENTION : Le protocole utilise le phénol chimique dangereux. Le travail avec du phénol doit être effectué dans une hotte chimique.

REMARQUE: Nettoyez soigneusement tout l’équipement et les surfaces à utiliser avec de l’éthanol à 70% (tremper pendant au moins 10 min), suivi d’un décontaminant RNase (tremper pendant au moins 10 min), rincer à l’eau traitée au DEPC, essuyer avec une serviette en papier propre et non pelucheuse, puis repulvériser ou tremper avec de l’éthanol à 70%.

  1. Homogénéisation des tissus durs (cartilage articulaire, os sous-chondral, ménisque)
    1. Avant l’homogénéisation, refroidissez le mortier, le pilon et la spatule à l’aide d’azote liquide. Ceux-ci doivent être conservés aussi froids que possible pour éviter le dégel des échantillons.
    2. Traiter les échantillons un à la fois, en gardant les autres échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
    3. Transférer l’échantillon de tissu dans le mortier à l’aide d’une spatule réfrigérée; versez de l’azote liquide supplémentaire sur le tissu et laissez-le s’évaporer. Écrasez le tissu à l’aide du pilon. Ajoutez à plusieurs reprises plus d’azote liquide à l’échantillon de tissu, laissez-le s’évaporer, puis continuez à broyer avec le pilon pour faire une poudre fine.
    4. Après avoir poudré le tissu autant que possible, transférer dans un tube de microcentrifugation pré-réfrigéré de 1,5 mL.
      1. Pré-refroidissement des tubes en s’immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 s avant le transfert tissulaire.
    5. Ajouter 1 mL de la solution acide-guanidinium-phénol à chaque tube et le garder sur la glace.
    6. Répétez les étapes 4.1.3 à 4.1.5 pour chaque échantillon de tissu dur.
    7. Après chaque tissu, nettoyez le mortier, le pilon et la spatule avec de l’éthanol à 70%, du décontaminant RNase, de l’eau traitée au DEPC et un trempage supplémentaire dans de l’éthanol à 70%. Essuyez tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux.
    8. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 minutes supplémentaires.
  2. Homogénéisation des tissus mous (coussinet adipeux infrapellaire, LCA, synoviale, VMO)
    1. Désinfectez l’homogénéisateur en faisant couler des tubes d’éthanol à 70 %, de décontaminant RNase, d’eau traitée au DEPC et d’un lavage supplémentaire à l’éthanol à 70 %, chacun pendant 30 s. Essuyez tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux. Répétez cette opération entre chaque échantillon.
    2. Pré-étiqueter des tubes à fond rond de 5 mL pour chaque échantillon. Ajouter 1 mL de la solution acide-guanidinium-phénol dans chaque tube.
      1. Travailler sur un échantillon à la fois, en gardant les autres échantillons à traiter à -80 °C jusqu’à leur utilisation.
    3. Transférer le tissu dans un tube pré-marqué de 5 mL avec acide-guanidinium-phénol.
    4. Homogénéiser les tissus en impulsions de 30 s, en restant sur la glace pendant et entre les impulsions. Répétez jusqu’à ce que le tissu soit dissous visuellement ou pendant un maximum de cinq impulsions de 30 s.
      REMARQUE: Certains tissus fibreux (c.-à-d. les muscles) peuvent ne pas s’homogénéiser complètement.
    5. Incuber le tissu dissous sur de la glace et passer à l’échantillon suivant.
      1. Nettoyez l’homogénéisateur comme décrit à l’étape 4.2.1. Assurez-vous que les morceaux de tissu ne restent pas dans les dents de la sonde; retirer avec des pinces stériles si nécessaire.
    6. Après homogénéisation de tous les échantillons, incuber sur de la glace dans de l’acide-guanidinium-phénol pendant 20 minutes supplémentaires.
    7. Transférer les échantillons des tubes à fond rond vers des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pré-étiquetés et pré-réfrigérés.

5. Extraction de l’ARN des tissus

ATTENTION : Ce protocole utilise des produits chimiques dangereux tels que le phénol, le chloroforme et l’isopropanol. Effectuez tout le travail dans une hotte chimique.

REMARQUE : L’équipement et les réactifs sont réservés au travail de l’ARN seulement et doivent être de qualité chimique appropriée pour les applications moléculaires (c.-à-d. stériles, sans nucléase). Ce protocole succède aux protocoles d’homogénéisation tissulaire des parties 4.1 et 4.2. Nettoyez soigneusement tous les équipements et surfaces à utiliser avec de l’éthanol à 70% (tremper pendant au moins 10 min), suivi d’un décontaminant RNase (tremper pendant au moins 10 min). Rincer à l’eau traitée au DEPC, essuyer le liquide résiduel avec une serviette en papier propre et non pelucheuse, puis repulvérir ou tremper avec de l’éthanol à 70 %.

  1. Centrifuger les tubes de microcentrifugation à 10000 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les débris.
  2. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL.
    REMARQUE: Pour les tissus adipeux, une couche lipidique sera parfois présente sur le dessus. Évitez de transférer cela en perçant la couche sur le côté du tube avec une pointe de pipette.
  3. Ajouter 200 μL de chloroforme pour 1 mL de solution acide-guanidinium-phénol à chaque échantillon. Serrez vigoureusement les tubes à la main pendant 30 s pour mélanger. Ensuite, incuber sur de la glace pendant 2 min.
  4. Échantillons de centrifugeuse à 10000 x g pendant 12 min à 4 °C.
    NOTE: Après centrifugation, trois couches se seront formées: une phase aqueuse contenant de l’ARN, une interphase d’ADN blanc et une phase de protéine rose au fond.
  5. Transférer environ 500 μL de la phase aqueuse supérieure dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL.
    REMARQUE: Ne pas perturber l’interphase et les fractions protéiques. Stockez ces phases à -80 °C pour un futur isolement de l’ADN ou des protéines.
  6. Ajouter un volume égal de solution acide-guanidinium-phénol à la phase aqueuse transférée, mélanger en inversant le tube 8-10 fois. Incuber le tube sur de la glace pendant 20 min.
  7. Ajouter 200 μL de chloroforme pour 1 mL de solution acide-guanidinium-phénol à chaque échantillon. Serrer vigoureusement à la main pendant 30 s pour mélanger puis incuber sur de la glace pendant 2 min.
  8. Échantillons de centrifugeuse à 10000 x g pendant 12 min à 4 °C.
  9. Transférer <500 μL de la phase aqueuse dans un tube de microcentrifugation frais, en prenant soin de ne pas contaminer l’échantillon avec les autres phases.
    ATTENTION : Jetez les phases restantes avec des méthodes appropriées d’élimination des matières dangereuses.
  10. Ajouter un volume égal (en phase aqueuse) de 100% d’isopropanol à chaque échantillon. Mélanger en inversant le tube 8 à 10 fois. Incuber sur de la glace pendant 5 min.
    1. Ajouter 1 μL de coprécipitant de glycogène à chaque échantillon pour aider à localiser la pastille d’ARN après la centrifugation.
  11. Centrifuger les échantillons à 12000 x g pendant 25 min à 4 °C.
  12. Localisez la pastille dans le tube (si vous utilisez un coprécipitant, elle apparaîtra bleue). Versez délicatement le surnageant.
  13. Lavez la pastille en ajoutant 1 mL d’éthanol glacé à 75 % à chaque échantillon, vortex pour déloger la pastille du fond du tube.
    REMARQUE: Préparez de l’éthanol à 75% en utilisant de l’éthanol pur de qualité moléculaire et de l’eau sans nucléase.
  14. Centrifuger à 7000 x g pendant 5 min à 4 °C. Versez délicatement le surnageant.
  15. Répétez les étapes 5.13 et 5.14 deux fois de plus.
  16. Rotation rapide (<2000 x g pendant 5 s) pour amener tout liquide résiduel au fond du tube. Utilisez une pipette P20 pour éliminer tout éthanol résiduel du fond des tubes.
    1. Évitez de toucher la pastille d’ARN avec une pointe de pipette. Modifier les conseils entre les échantillons.
  17. Avec les bouchons de tube ouverts, sécher à l’air les échantillons à température ambiante pendant 10 min.
    REMARQUE: Le granulé peut devenir translucide à mesure qu’il sèche. S’assurer que tout l’éthanol résiduel s’est évaporé améliorera la pureté de l’ARN.
  18. Ajouter 25 μL d’eau sans nucléase dans chaque tube pour dissoudre la pastille.
  19. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
  20. Pipettez doucement de haut en bas pour mélanger l’ARN.
  21. Aliquote 5 μL de l’échantillon dans un tube frais pour l’analyse du contrôle de la qualité (Partie 6). Conserver les 20 μL restants à -80 °C pour les tests d’expression génique.

6. Contrôle de la qualité

  1. Déterminez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre conformément aux instructions du fabricant.
  2. Déterminez l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un appareil d’électrophorèse conformément aux instructions du fabricant.
    REMARQUE: Diluer l’ARN pour qu’il se situe dans la plage des limites de détection de la puce.

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Representative Results

Sept tissus uniques de l’articulation du genou humain sont disponibles pour la collecte de patients souffrant d’ATK pour l’arthrose (Figure 1). Dans ce protocole, chacun de ces tissus a été identifié et traité dans les 4 heures suivant l’ablation chirurgicale (Figure 2). En suivant les étapes décrites à la figure 3,des parties de chaque tissu ont été fixées au for formel pour l’évaluation histologique (figure 4), tandis que d’autres parties ont été congelées pour l’isolement de l’ARN. En séparant les tissus durs des tissus mous par méthode de désintégration (pulvérisation versus homogénéisation, respectivement), de l’ARN de haute intégrité et pureté a été extrait de chaque type de tissu, avec des résultats représentatifs présentés dans le tableau 1 (colonnes de haute qualité). Notamment, certains sujets ont produit de l’ARN de qualité inférieure sur plusieurs tissus(Tableau 1, Colonnes de faible qualité), ce qui suggère que malgré une méthode optimisée, des facteurs externes (par exemple, la gravité de la maladie) peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN dans tous les types de tissus.

Figure 1
Figure 1: Schéma de l’articulation du genou humain montrant une section transversale latérale. Chacun des sept tissus marqués est prélevé pendant l’ATK et utilisé à des fins de recherche, comme décrit dans le présent protocole. VMO = muscle oblique vastus medialis. Image consultée et modifiée à partir d’OpenStax College sous une licence Creative Commons26. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Images brutes représentatives pour chacun des sept tissus obtenus chez des patients subissant une ATK. (A) Os fémoral antérieur coupé avec flèche pointant vers le cartilage articulaire à recueillir. Le cartilage est identifié par une couche blanchâtre trouvée à la surface de l’os. (B) Coupe de l’os fémoral antérieur avec flèche pointant vers l’os sous-chondral à recueillir. C)Ménisque. Évitez de ramasser les sections brûlées causées par l’électrocautérisation pendant l’ATK. (D) Coussinet adipeux infrapacellaire (de couleur jaune). (E) Ligament croisé antérieur (tissu blanc, fibreux, spongieux). F) Synoviale. Un côté apparaîtra de couleur claire et fibreuse, contenant souvent du tissu adipeux, tandis que le côté opposé apparaîtra rosâtre et moins fibreux. Le côté rose de la membrane contient la muqueuse synoviale. (G) Muscle oblique vastus medialis (rouge). Cela peut souvent être la plus petite partie de tissu et peut contenir du tissu adipeux. Barre d’échelle = 2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Aperçu des mesures prises pour prélever des tissus humains primaires d’arthrose pour l’histologie et l’ARN. Ce protocole décrit la sélection des patients, le traitement des échantillons pour l’histologie et l’ARN, l’homogénéisation des tissus pour les tissus durs et mous, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité pour sept tissus humains primaires d’arthrose du genou. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Coupes histologiques pour chacun des sept tissus obtenus chez des patients subissant une ATK. Les sections colorées à l’hématoxyline et à l’éosine sont représentées à un grossissement de 6x dans les panneaux A-F avec un encart agrandi à 40x dans les panneaux A'-F' et A « . (A, A ') Cartilage articulaire; (A, A « ) os sous-chondral; (B, B') ménisque; (C, C ') coussinet de graisse infrapacellaire; (D, D ') ligament croisé antérieur; (E, E') synoviale; (F, F ') muscle oblique vastus medialis. Barres d’échelle = 400 μm pour A-F et 50 μm pour A'-F' et A ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tissu N RIN [ARN] (ng/μL) dans 25 μL A260:A280 A260:A230
Haute qualité Faible qualité Haute qualité Faible qualité Haute qualité Faible qualité Haute qualité Faible qualité Haute qualité Faible qualité
« Tissus durs »
Cartilage articulaire 10 4 7,0 ± 0,8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1,80 ± 0,09 1,47 ± 0,34 1,40 ± 0,36 0,45 ± 0,26
Os sous-chondral 10 4 7,8 ± 0,6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1,96 ± 0,05 1,90 ± 0,17 1,72 ± 0,27 1,12 ± 0,62
Ménisque 10 4 7,5 ± 0,6 2,4 ± 0,3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1,91 ± 0,05 1,71 ± 0,15 1,41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
« Tissus mous »
Coussin adipeux infrapacellaire 10 3 8,5 ± 0,6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1,99 ± 0,01 2,02 ± 0,03 2,09 ± 0,17 1,47 ± 0,71
Ligament croisé antérieur 8 3 7,4 ± 0,4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1,97 ± 0,03 1,91 ± 0,18 1,88 ± 0,20 1,35 ± 0,70
Synoviale 9 3 8,5 ± 0,6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1,99 ± 0,04 2,00 ± 0,03 2,05 ± 0,11 1,91 ± 0,20
Vastus Medialis Oblique 9 3 8,5 ± 0,6 8,4 ± 0,7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1,96 ± 0,03 1,99 ± 0,03 1,82 ± 0,11 1,62 ± 0,27

Tableau 1. Qualité et quantité d’ARN isolés à partir de tissus arthroses prélevés chez des patients atteints d’ATK. RIN = Numéro d’intégrité de l’ARN. Données présentées sous forme de rapports moyens ± écart-type pour rin, A260:A280 et A260:A230, et moyenne (plage) pour les valeurs de concentration d’ARN. Les échantillons de haute qualité sont constitués de patients dont tous les types de tissus ont produit de l’ARN avec RIN > 6 (n = 8-10). Les échantillons de faible qualité sont constitués de patients dont plusieurs types de tissus ont produit de l’ARN avec RIN < 6 (n = 3-4).

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Discussion

Le protocole présenté s’est avéré efficace pour la collecte de sept tissus humains primaires d’arthrose pour l’extraction de l’ARN (Tableau 1) et le traitement histologique (Figure 4). Avant de prélever des échantillons de patients, il est nécessaire d’établir un protocole approuvé par la CISR, idéalement en collaboration avec un chirurgien ou une équipe chirurgicale. L’application d’un protocole normalisé pour le prélèvement d’échantillons (p. ex., résection à partir d’emplacements in situ cohérents) est essentielle pour maximiser la reproductibilité expérimentale. Les échantillons de tissus doivent être transportés au laboratoire dans des récipients stériles et traités dans les 4 heures suivant la chirurgie pour éviter toute dégradation. Pendant la dissection et le traitement des tissus, tous les tissus sont maintenus hydratés dans du PBS stérile et sont rincés dans du PBS frais et stérile pour éliminer les contaminants de surface potentiels tels que les biofluides et autres débris indésirables avant d’être congelés pour l’extraction de l’ARN ou fixés au forçin pour l’histologie. Une application utile de l’analyse histologique est la confirmation des types de tissus et de la gravité de la maladie, car ceux-ci peuvent être distingués par le nombre de cellules, la distribution et la morphologie, entre autres facteurs observables par des taches standard telles que l’hématoxyline et l’éosine (Figure 4).

Les tissus humains primaires d’arthrose peuvent présenter des défis pour l’extraction d’ARN de quantité et de qualité suffisantes, telles que définies par la pureté et l’intégrité27. La quantité d’ARN est fonction de la cellularité globale du tissu, et dans l’articulation du genou, il existe des tissus à faible cellule et à matrice élevée tels que le cartilage, l’os et le ménisque, et des tissus à cellules relativement élevées et à matrice basse tels que le coussinet adipeux, le LCA, la synoviale et l’OVV. Par exemple, le cartilage hyalin articulaire et le fibrocartilage méniscale28 sont caractérisés par une faible cellularité, la matrice extracellulaire contenant des quantités variables de collagènes, de protéoglycanes et d’autres glycoprotéines28,29. Avoir moins de cellules entraîne moins d’ARN par volume de tissu (réduction de la quantité) et avoir plus de protéines entraîne une co-purification avec l’ARN (réduction de la pureté)25,30. La pureté de l’ARN peut être déterminée par spectrophotométrie où A260:A280 et A260:A230 valeurs de <1,5 reflètent la présence de contaminants organiques (par exemple, protéine) et des valeurs de ~2,0 reflètent l’ARN pur31. L’intégrité de l’ARN reflète le niveau de dégradation, qu’elle soit causée par des conditions expérimentales (c.-à-d. les forces de cisaillement) ou par la digestion enzymatique (p. ex., les nucléases), et est souvent déterminée par une analyse électrophorétique. Un numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) de 1 reflète l’ARN dégradé et un RIN de 10 reflète l’ARNintact 31,32. Pour le séquençage de l’ARN, un RIN minimum de 7 est souvent recommandé33,34,35. Les données présentées dans le tableau 1 révèlent que ces seuils A260:A280, A260:A230et RIN ont été atteints sur tous les tissus des échantillons de patients du groupe ARN de haute qualité par rapport aux échantillons de patients du groupe ARN de faible qualité, à l’exception de certains A260:A230 , qui peuvent refléter une contamination protéique de l’ARN dans les tissus à matrice basse et cellulaire élevée. Bien que de nombreux facteurs puissent contribuer à la qualité de l’ARN isolé à partir d’un échantillon de patient donné, parmi eux peut être le niveau de gravité de la maladie. La nature malade des tissus arthroses suggère que les processus de dégradation se produisent par le biais de niveaux accrus d’enzymes qui peuvent digérer les tissus, mais aussi l’ARN, réduisant ainsi la qualité.

Ce protocole d’extraction de l’ARN vise à maximiser la quantité et la qualité de l’ARN des tissus humains primaires de l’arthrose. L’étape la plus critique concernait la question de savoir si les tissus étaient désintégrés en étant pulvérisés ou homogénéisés, et cela s’est avéré corrélé avec la cellularité tissulaire et la composition de la matrice. Initialement, les sept tissus ont été soumis au même protocole où les tissus ont d’abord été pulvérisés par mortier et pilon à l’aide d’azote liquide, puis transférés dans une solution acide-guanidinium-phénol, puis homogénéisés à l’aide d’un homogénéisateur de tissus portatif. Cette méthode a produit un rendement, une pureté et une intégrité d’ARN favorables pour le coussinet adipeux, le LCA, la synoviale et le VMO (collectivement les tissus mous; aussi, des cellules relativement élevées, à matrice basse), mais des résultats défavorables pour le cartilage, les os et le ménisque (collectivement les tissus durs; aussi, les cellules basses, la matrice haute). Sur la base de ces observations, les sept tissus ont été divisés en deux groupes pour affiner davantage le protocole. Il a été observé que l’homogénéisation supplémentaire avait un effet minimal sur la désintégration des tissus durs après leur pulvérisation en poudre fine. Inversement, la dissociation des tissus mous a été réalisée avec succès avec l’homogénéisation seule et n’a pas nécessité de pulvérisation. Par conséquent, l’homogénéisation des tissus durs et la pulvérisation des tissus mous ont été éliminées. Cela a été bénéfique pour minimiser les forces de cisaillement, le temps de traitement et les fluctuations de température, ce qui peut améliorer l’intégrité de l’ARN. Deux cycles de séparation de phase phénol/chloroforme pour les sept tissus ont été effectués, car il a été rapporté que cela améliorait la pureté de l’ARN sans réduire le rendement31.

Une limitation potentielle de ce protocole est l’effet de lot qui peut découler de la séparation des tissus en deux groupes si la conception expérimentale exige une comparaison entre tous les tissus. L’utilisation de méthodes de pulvérisation par rapport à des méthodes d’homogénéisation peut modifier les conditions techniques (p. ex., le temps de traitement) et environnementales (p. ex., fluctuations de température) qui peuvent introduire de la variabilité36. Une deuxième limite est l’incohérence potentielle dans l’identification, la dissection et l’orientation (pour la section histologique) des tissus à l’intérieur et entre les sujets. Une troisième limite est notre incapacité à confirmer les corrélations potentielles entre la gravité de la maladie du patient et la qualité de l’ARN dans le présent rapport. Une quatrième limite est le manque de disponibilité de tissus témoins sains à des fins de comparaison. Bien que des échantillons de contrôle puissent être disponibles à partir de cadavres, ceux-ci sont moins facilement disponibles que les tissus d’arthrose de TKA. Une stratégie expérimentale pour contourner cela consiste à utiliser chaque sujet comme son propre contrôle, qu’il s’agisse de faire des comparaisons entre les tissus ou au sein des tissus en comparant le traitement au contrôle ou en faisant des lésions dans des zones préservées. Enfin, l’utilisation d’explants tissulaires pour l’extraction de l’ARN ne permet pas l’analyse de l’expression génique des différents types de cellules qui composent les tissus (par exemple, les fibroblastes synoviaux par rapport aux macrophages synoviaux37).

Malgré les limites notées, les tissus humains primaires d’arthrose sont une ressource précieuse pour la recherche, offrant des avantages par rapport à d’autres systèmes expérimentaux pour l’arthrose, y compris la préservation de la niche cellulaire23. Cependant, les tissus humains primaires d’arthrose peuvent être sous-utilisés dans la recherche en raison de défis logistiques ou techniques. Ce protocole décrit la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité pour soutenir l’utilisation des échantillons obtenus à partir de TKA. Après le traitement des échantillons, plusieurs approches expérimentales peuvent être poursuivies, y compris l’expression des gènes et l’histologie, entre autres. Le plus pertinent pour le domaine omique en évolution rapide est la capacité d’isoler des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour des applications telles que le séquençage de l’ARN38,39. Les profils moléculaires peuvent être comparés à l’intérieur et entre les tissus de sujets présentant des phénotypes de maladie spécifiques (par exemple, en fonction de l’âge, du sexe et d’autres facteurs de risque d’arthrose). Les connaissances acquises peuvent éclairer de nouvelles avenues thérapeutiques qui peuvent être plus facilement traduites dans la population de patients atteints d’arthrose.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs remercient les participants à l’étude qui ont rendu cette recherche possible et dévouent ce rapport à de nouveaux scientifiques dans le domaine de l’arthrose.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

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Biologie numéro 173
Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou
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Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

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