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Biology

인간 골관절염 무릎 관절에서 조직 수집 및 RNA 추출

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

총 무릎 관절 성형술 다음 환자에서 얻은 1 차 조직은 최대 임상 과격성관절염 연구를위한 실험 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 인간 골관절염에 있는 기계론적인 조사를 지원하기 위하여 7개의 유일한 무릎 조직에서 RNA를 확인, 프로세스 및 격리하는 방법을 설명합니다.

Abstract

골관절염 (OA)은 만성 및 퇴행성 관절 질환으로 무릎에 가장 자주 영향을 미칩니다. 현재 치료법이 없기 때문에 총 무릎 관절 성형술 (TKA)은 일반적인 외과 적 개입입니다. TKA에서 얻은 1 차적인 인간 OA 조직을 이용한 실험은 질병 기계장치 ex vivo를조사하는 기능을 제공한다. OA는 이전에 주로 연골에 영향을 미칠 것으로 생각 되었지만, 지금은 관절에 있는 다중 조직에 영향을 미칠 것으로 알려져 있습니다. 이 프로토콜은 무릎 관절에서 질병 메커니즘 조사를 지원하기 위해 7 개의 고유 조직에서 환자 선택, 샘플 처리, 조직 균질화, RNA 추출 및 품질 관리 (RNA 순도, 무결성 및 수율기준)를 설명합니다. 정보에 입각한 동의로, 샘플은 OA를 위한 TKA를 겪고 있는 환자에게서 얻어졌습니다. 조직은 RNA 또는 조직학을 위한 포르말린 고정을 위한 플래시 동결에 의해 수술4 시간 안에 해부, 세척 및 저장되었습니다. 수집된 조직에는 관절 연골, 연골 뼈, 반월상연골, 반골 관절 지방 패드, 전방 십자 인대, 시노비움 및 광대 한 내측 경사 근육이 포함되었습니다. RNA 추출 프로토콜은 각 조직 유형에 대해 테스트되었다. 가장 중요한 수정은 낮은 세포에 사용되는 붕괴의 방법을 포함, 높은 매트릭스, 하드 조직 (연골으로 간주, 뼈, 그리고 반월 상 연골) 상대적으로 높은 세포 대, 낮은 매트릭스, 연조직 (지방 패드로 간주, 인대, 시노비움, 근육). 분쇄가 단단한 조직에 적합하다는 것을 발견되었고, 균질화는 연조직에 적합했다. 몇몇 과목에 대한 성향은 여러 조직에 걸쳐 일관되게 다른 과목보다 더 높은 RNA 무결성 수 (RIN) 값을 산출하는 것이 관찰되었다, 질병 심각도와 같은 기본 요인이 RNA 품질에 영향을 미칠 수 있음을 시사. 1 차인간 OA 조직에서 고품질 RNA를 격리하는 기능은 환자에게 더 쉽게 번역되는 임상 통찰력으로 이어질 수 있는 시퀀싱을 포함하여 정교한 유전자 발현 실험을 위한 생리학적으로 관련된 모델을 제공합니다.

Introduction

무릎은 유골과 대퇴골 사이의 경골 관절과 슬개골과 대퇴골1사이의 파텔로페모랄 관절을 포함하는 인체에서 가장 큰 연동 관절이다. 무릎의 뼈는 관절 연골로 줄지어 있으며, 반월상, 지방, 인대 및 근육을 포함한 다양한 결합 조직에 의해 지원되며, 활막막은 전체 관절을 캡슐화하여 활액충충1,2,3(도 1)을생성한다. 건강한 무릎은 전두엽 비행기1,3에서마찰없는 움직임을 허용하는 모바일 힌지 조인트역할을 한다. 병리학적 조건하에서 이동은 제한되고 고통스러울 수 있습니다. 가장 흔한 퇴행성 무릎 관절 질환은 골관절염 (OA)4입니다. 다양한 위험 요소는 노년기, 비만, 여성 성, 관절 외상 및 유전학을 포함한 OA 발달에 걸리기 쉬운 것으로 알려져 있으며, 그중에서도 5,6. 현재 미국에서 약 1,400만 명이 증상 무릎 OA를 가지고 있으며, 인구 연령 상승과비만률7,8로인해 보급이 증가하고 있다. 처음에 연골의 질병으로 간주, OA는 이제 전체 관절9의질병으로 이해된다. OA에서 일반적으로 관찰된 병리학적 변화는 관절 연골 침식, 골체 형성, 아촌건조골 두껍게, 및 시노비움9,10의염증을 포함한다. OA에 대한 알려진 치료법이 없기 때문에, 치료는 주로 증상 (예를 들어, 통증) 관리에 초점을 맞추고11,12,그리고 일단 OA가 최종 단계로 진행되면, 관절 교체 수술은 종종13을표시한다.

관절 교체 수술은 부분 또는 총 무릎 교체 될 수 있습니다,총 무릎 관절 성형술 (TKA) 전체 경유 관절과 patellofemoral 관절을 교체 포함. 2020년 현재 미국에서는 매년14일약 100만 개의 TK가 공연된다. TKA 동안 정형 외과 의사는 유골 고원의 상부와 하부 대퇴동체(도 2A,2B)를보철 임플란트와 함께 장착합니다. 때때로 환자에 의해 잘못 해석, TKA에서, 만 8-10 mm는 금속으로, 나중에 덮여 또는 다시 표면각 뼈의 끝에서 절제된다. 분리된 폴리에틸렌 라이너는 두 금속 임플란트 사이에 베어링 표면(즉, 패딩)을 형성합니다. 또한, 관절의 몇몇 연조직 성분은 적절한 관절 균형을 달성하기 위해 완전히 또는 부분적으로 절제된다. 이들 조직 중에는 내측 및 횡월경(도2C),적외선 지방패드(도 2D),전방 십자 인대(ACL; 도 2E),시노비움(도2F),및 광두스 내측 경사 근육(VMO; 도 2G) 15. . TKA는 일반적으로 OA 치료에 성공하지만 환자의 약 20 %가 수술 후 통증의 재발을보고합니다16. 절차의 높은 비용 및 상대적 침략과 함께, 이러한 제한은 OA의 진행을 완화하기 위해 대체 치료를 식별하기 위해 추가 연구의 필요성을 가리킵니다.

치료 적 개입을위한 새로운 방법을 제시 할 수있는 OA에서 질병 메커니즘을 탐구하기 위해, 세포, 조직 각종 및 동물 모델을 포함한 실험 시스템을 사용할 수 있습니다. 세포는 전형적으로 단층에서 배양되고 1차 인간 또는 동물 조직(예를 들어, 연골으로부터 분리된 연골세포) 또는 불멸의 세포(예를 들어, ATDC517 및 CHON-00118)에서유래된다. 세포는 통제된 배양 환경에서 실험 변수를 조작하는 데 유용할 수 있지만, 세포표현형(19)에영향을 미치는 것으로 알려진 천연 조인트 조건을 포착하지 않는다. OA의 근본적인 화학, 기계 및 세포 간 통신의 복잡한 폭포를 더 잘 회수하기 위해, 조직 구조 및 세포 미세환경을보존하기 위해 신선하거나 배양된 전 생체 를 항축으로 사용하든 간에 1 차적인 인간 또는 동물 조직 샘플에서 대안이 발견된다. 생체 내에서관절을 연구하기 위해서는, 작은(예를 들어,마우스(21)과대형(예를 들어, 말22)OA에 대한 동물 모델(예를 들어, 외과 유도, 유전적 변화 또는 노화를 통해)도 유용하다. 그러나, 이러한 모델에서 인간 질환으로의 번역은 해부학적, 생리학적 및 대사적 차이에 의해 제한될 수 있으며, 그 외23. 실험 시스템의 장점과 단점을 고려, 종 특정 되 고 기본 인간 OA 조직에 의해 제공 하는 세포 외 틈새 시장을 유지의 주요 강점 연구 결과의 번역 잠재력을 극대화.

1 차적인 인간 OA 조직은 TKA 다음 쉽게 얻을 수 있습니다, 연구를 위한 귀중한 자원TAs의 고주파를 만들기. 잠재적인 실험 응용 프로그램 중 유전자 발현 및 조직 분석. 이러한 연구 접근 방식과 다른 사람에 대한 기본 인간 OA 조직의 잠재력을 실현하기 위해, 설명은 다음과 같은 주요 고려 사항입니다. 첫째, 환자 표본의 사용은 윤리적 규제의 대상이 되며, 프로토콜은 기관 검토 위원회(IRB)승인(24)을충족해야 한다. 둘째, 인간 1차 질병의 본질적인 이질성과 나이와 성별과 같은 변수의 영향은 신중한 환자 선택(즉, 자격 기준 적용) 및 데이터 해석에 대한 필요성을 조성합니다. 셋째, 관절에서 다른 조직의 고유한 생물학적 특성(예를 들어, 연골 및 반월 상연연연골(25)의낮은 세포성)은 실험 중(예: 고품질 및 RNA의 양을 격리)하는 동안 과제를 제시할 수 있다. 이 보고서는 이러한 고려 사항을 해결하고 환자 선택, 샘플 처리, 조직 균질화, RNA 추출 및 품질 관리(즉, RNA 순도 및 무결성평가)에 대한 프로토콜을 제시합니다. 그림 3) 연구 커뮤니티에서 1 차적인 인간 OA 조직의 사용을 격려하기 위하여.

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Protocol

이 연구 프로토콜승인 하 고 헨리 포드 건강 시스템 기관 검토 위원회에 의해 설정 된 기관 지침을 따랐다 (IRB #13995).

1. 환자 선택

  1. 정형 외과 의사와 TKA를 받아야 할 예정 중 환자를 식별합니다.
  2. 연구 프로토콜에 의해 정의된 자격 기준에 따라 환자를 선택합니다. 포함 기준의 예는 포함 18 세 이상의 나이와 무릎 관절염의 확인 된 진단을 갖는. 배제 기준의 예는 부분 적인 무릎 교체를 겪고 또는 류 마치성 관절염의 확인 된 진단을 포함.
  3. 수술 전에 정보에 입각한 동의를 얻으려면 환자에게 연락하십시오.

2. 샘플 처리 (RNA용)

참고: 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 모든 조직 처리를 수행하고 멸균 기술을 따릅니다. 인간의 샘플을 처리 할 때 항상 적절한 PPE (니트릴 장갑, 실험실 코트, 안전 고글)를 착용하십시오. 여러 뼈 조각은 TKA 동안 생성되며, 많은 양의 뼈 /연골이 해부에 잠재적으로 사용할 수 있습니다. 질병 진행으로 인해, 관절 연골 변성은 실험 설계로 고려 될 수있는 일부 뼈 부분에 더 심각 할 수있다. 절제술을 위해 전기 카우터리를 의무화하는 조직만 열 에지 손상을 가지며, 손상을 최소화하기 위해 메스로 대부분의 조직을 조달하기 위해 협조된 외과 적 노력이 이루어집니다. 절제된 조직은 멸균 PBS를 통해 항상 수분을 유지해야 합니다.

  1. 70% 에탄올, RNase 데온타미넌트, DEPC 처리 된 물, 그리고 다시 70 %의 에탄올로 모든 작업 표면 및 장비를 소독하십시오. 깨끗하고 보풀이 없는 조직으로 잔류 액체를 닦아냅니다. 집게, 뼈 커터 및 메스는 사용하기 전에 적어도 10 분 동안 70 % 에탄올에 자동 으로 젖거나 담근다. 즉시 사용하지 않을 때 장비가 70% 에탄올에 잠수하십시오.
  2. 각 조직에 대해 식별되지 않은 샘플 이름과 알리쿼트 번호로 적어도 3개의 극저온을 사전 라벨링합니다(예를 들어, TKA-1 연골 1).
    1. 그림 2에기재된 바와 같이 크기, 모양, 색상 및 질감의 차이에 기초하여 시편으로부터 각 조직 유형을 식별한다. 연골(도2A 화살표),뼈(도 2B 화살표), 반월상 연골(도 2C), 반월상연(도2D),전방 십자 인대(도2E),시노비움(도2F),및 광액 내측 경사 근육(그림2G)을식별한다.
  3. 관절 연골을 분리합니다.
    1. 연골 분해가 최소화된 뼈 부분을 선택합니다.
    2. No.10 메스를 사용하여 연골 층의 전체 두께를 해부하기 위해 가능한 한 연골 깊이를 잘라냅니다.
      참고: No.10 메스는 뼈가 아닌 연골을 관통합니다.
    3. 연골의 전체 두께를 사용하여 세 개의 5mm 큐브를 해부합니다.
  4. 아전드랄 뼈를 분리합니다.
    1. 연골이 수집된 것과 동일한 골격 섹션을 사용합니다.
    2. No.10 메스를 사용하여 뼈 표면에서 남은 연골과 잔류 조직을 긁어냅니다.
    3. 뼈 부분을 잡아 서 집게로 잘라 뼈 커터를 사용 하 여 세 개의 5 mm 큐브를 잘라.
  5. 반월 상 연골을 분리합니다.
    1. 내측 또는 측면 반월 상 연골의 상대적으로 손상되지 않은 부분을 식별합니다.
    2. No.10 메스와 집게를 사용하여 3개의 5mm 큐브를 해부합니다.
  6. 인프라 지방 패드를 분리합니다.
    1. No.10 메스와 집게를 사용하여 조직의 노란색 부분을 3개의 동등한 크기와 균질한 부분(각각~500 mg)으로 자른다.
  7. 전방 십자 인대 (ACL)를 분리합니다.
    1. No.10 메스와 집게를 사용하여 3개의 5mm 큐브를 해부합니다.
  8. 시노비움을 분리합니다.
    1. No.10 메스와 집게를 사용하여 지방 조직을 긁어 내어 멤브레인의 분홍색 세포 부분을 가능한 한 많이 분리합니다.
    2. 세 개의 동일한 크기와 균질한 부분 (~200 mg 각)을 해부하십시오.
  9. 광대 한 내측 경사 근육을 분리 (VMO).
    1. No.10 메스와 집게를 사용하여 표본에서 지방 조직을 제거하여 붉은 근육 조직만 남깁니다.
    2. 3개의 5mm 큐브를 해부합니다.
      참고: 조직의 초기 크기는 부분의 크기를 제한합니다.
  10. 멸균 PBS로 조직 부분을 헹구어 잔류물이나 이물질을 제거합니다.
  11. 조직학을 수행하려면 3부에설명된 대로 각 조직 부분을 수정합니다.
  12. RNA 추출을 수행하려면 세 가지 조직 부분 각각을 작은 조각 (~1-2 mm   큐브)으로 자른다.
    1. 작은 조각을 2mL 극저온으로 옮기고, 단단히 캡을 고정하고, 30초 동안 액체 질소에 침수하여 플래시 동결을 한 다음 장기 저장을 위해 -80°C 냉동고로 전송합니다(현재 프로토콜에서 최대 4개월 테스트). 모든 조직의 모든 알리쿼트에 대해 이 것을 반복합니다.
    2. 4부에설명된 바와 같이 조직 균질화를 계속한다.

3. 샘플 처리 (히스토로지용)

주의: 포르말린은 유해 화학 물질이며 화학 연기 후드에만 사용됩니다.

  1. 10% 포르말린 용액으로 사전 라벨이 부착된 15mL 원문 튜브를 채웁니다.
  2. 집게를 사용하여 조직 섹션을 포르말린 튜브로 옮기십시오.
  3. 가능하면 흔들리고 동요하면서 실온에서 1 주일 동안 포르말린의 조직을 수정하십시오.
  4. 1주 후, 포르말린을 적절한 화학 폐기물 처리로 폐기하고, PBS로 조직을 헹구고, 시료가 단면에 포함될 때까지 4°C에서 장기 보관을 위해 70% 에탄올을 함유한 신선한 15mL 원콘튜브로 이송한다.
    참고: 뼈/연골의 경우 다음과 같이 탈균화를 수행합니다.
  5. 1 주 후, 적절한 화학 폐기물 처리로 포르말린을 버리고 PBS로 조직을 헹구십시오.
  6. 조직을 10% EDTA 용액(pH 7.4)의 45mL로 50mL 원내 튜브로 이송한다.
  7. 흔들림/동요가 불가능한 경우 매일 튜브를 10-15회 반전시하십시오.
  8. 매주 한 번 EDTA 솔루션을 폐기하고 교체하십시오.
    1. 매주 두 번, 악기(즉, 주걱) 또는 장갑을 낀 손가락으로 텍스처를 테스트하여 압력이 가을될 때 변형을 관찰하여 탈하를 확인합니다. 뼈 조직을 탈칼로시화하는 데 필요한 시간은 4-6 주에서 샘플 마다 다릅니다.
  9. 일단 탈화되면, PBS로 조직을 헹구고 시료가 단면에 포함될 때까지 4°C에서 장기 저장을 위해 70% 에탄올을 함유하는 신선한 15mL 원콘 튜브로 이송한다.

4. 조직 균질화

주의: 프로토콜은 유해 화학 페놀을 사용합니다. 페놀과 함께 작업하는 것은 화학 연기 후드에서 수행해야합니다.

참고: 70% 에탄올(최소 10분 간 담그기)으로 사용할 모든 장비와 표면을 철저히 청소하고, RNase 데온타미넌트(최소 10분 간 담그세요), DEPC 처리물로 헹구고, 깨끗하고 보풀이 없는 종이 타월로 닦은 다음 70%의 이탄올로 재스프레이하거나 담가 둡니다.

  1. 단단한 조직 균질화 (관절 연골, 부전건조뼈, 반월 상 연골)
    1. 균질화하기 전에 액체 질소를 사용하여 박격포, 유봉 및 주걱을 식힙니다. 이들은 견본 해동을 방지하기 위하여 가능한 한 차갑게 유지되어야 합니다.
    2. 샘플을 한 번에 하나씩 처리하고 다른 샘플을 -80°C로 유지하여 사용할 때까지 처리합니다.
    3. 차가운 주걱을 사용하여 티슈 샘플을 박격포로 옮기십시오. 조직의 상단에 추가 액체 질소를 부어 증발 할 수 있습니다. 페일을 사용하여 조직을 분쇄하십시오. 반복적으로 조직 샘플에 더 많은 액체 질소를 추가, 증발 할 수 있도록, 다음 미세 분말을 만들기 위해 유봉과 연삭을 계속.
    4. 조직을 가능한 한 많이 가루한 후, 미리 냉각된 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮춥니다.
      1. 조직 전달 전에 30 s용 액체 질소에 침수하여 미리 냉각튜브.
    5. 각 튜브에 산-구안디늄 페놀 용액 1mL을 넣고 얼음 위에 보관하십시오.
    6. 각 경단 조직 샘플에 대해 4.1.3-4.1.5 단계를 반복합니다.
    7. 각 조직 후, 박격포, 유봉 및 주걱을 70 % 에탄올, RNase 데온타미넌트, DEPC 처리 된 물 및 70 %의 에탄올에 추가 담가 십시오. 깨끗하고 보풀이 없는 티슈로 잔류 액체를 닦아냅니다.
    8. 얼음에 샘플을 추가로 20분 간 배양합니다.
  2. 연조직 균질화(인프라파텔라 지방 패드, ACL, 시노비움, VMO)
    1. 70% 에탄올, RNase 데온타미넌트, DEPC 처리된 물, 그리고 30s에 대해 각각 70%의 에탄올 세척을 실행하여 균질화를 소독합니다. 깨끗하고 보풀이 없는 티슈로 잔류 액체를 닦아냅니다. 각 샘플 간에 이 것을 반복합니다.
    2. 각 샘플에 대해 5mL 원형 하단 튜브를 사전 라벨로 지정합니다. 각 튜브에 산-구니듐 페놀 용액 1mL를 추가합니다.
      1. 한 번에 하나의 샘플에서 작업하여 다른 샘플을 사용전까지 -80°C에서 처리하도록 유지합니다.
    3. 산 구니디늄 페놀과 사전 표지 된 5 mL 튜브로 조직을 전송합니다.
    4. 30초 펄스로 조직을 균질화하여 펄스 중과 사이에 얼음을 유지합니다. 조직이 시각적으로 용해될 때까지 또는 최대 5 개의 30 s 펄스를 반복하십시오.
      참고: 일부 섬유 조직 (즉, 근육)은 완전히 균질화되지 않을 수 있습니다.
    5. 얼음에 용해 된 조직을 배양 하 고 다음 샘플로 이동 합니다.
      1. 4.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 균질화제를 청소한다. 조직 덩어리가 프로브의 치아에 남아 있지 않도록하십시오. 필요한 경우 멸균 포셉으로 제거하십시오.
    6. 모든 시료의 균질화 후 산과 구니디늄 페놀의 얼음에 20분 간 배양합니다.
    7. 샘플을 원형 하단 튜브에서 미리 표지되고 미리 냉각된 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 전송합니다.

5. 조직에서 RNA 추출

주의: 이 프로토콜은 페놀, 클로로폼 및 이소프로파놀과 같은 유해 화학 물질을 사용합니다. 화학 연기 후드에서 모든 작업을 수행합니다.

참고: 장비 및 시약은 RNA 작동을 위해서만 예약되며 분자 응용(즉, 멸균, 뉴클레아제 프리)에 적합한 화학 등급이어야 합니다. 이 프로토콜은 부품 4.1 및 4.2 조직 균질화 프로토콜을 모두 성공시습니다. 70% 에탄올(최소 10분 동안 담그기)으로 사용할 모든 장비와 표면을 철저히 청소한 다음, RNase 데온타미닌트(최소 10분 동안 담가 주세요). DEPC 처리된 물로 헹구고, 깨끗하고 보풀이 없는 종이 타월로 잔류 액체를 닦은 다음 70%의 에탄올로 다시 스프레이하거나 담가 둡니다.

  1. 4°C에서 10분 동안 10000 x g의 미세원심분리기 튜브를 원심분리하여 이물질을 펠릿합니다.
  2. 상신을 신선한 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브로 옮기.
    참고: 지방 조직의 경우 지질 층이 때때로 상단에 나타납니다. 파이펫 끝으로 튜브 측면의 레이어를 관통하여 전송하지 마십시오.
  3. 각 시료에 산-구니디늄 페놀 용액의 1mL당 200 μL의 클로로폼을 추가합니다. 튜브를 손으로 힘차게 흔들어 30s를 섞습니다. 그런 다음 얼음에 2 분 동안 배양하십시오.
  4. 원심분리기 샘플은 4°C에서 12분 동안 10000 x g에서 샘플링합니다.
    참고: 원심분리 후, RNA를 포함하는 수성 상, 백색 DNA interphase 및 바닥에 있는 분홍색 단백질 상: 3개의 층이 형성될 것입니다.
  5. 상류의 ~500 μL을 신선한 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 옮기.
    참고: 단계 간 및 단백질 분획을 방해하지 마십시오. 향후 DNA 또는 단백질 절연을 위해 -80°C에서 이러한 단계를 저장합니다.
  6. 전달된 수성 상에 산-구아니니움 페놀 용액의 동일한 볼륨을 넣고 튜브를 8-10회 반전시켜 혼합합니다. 20 분 동안 얼음에 튜브를 배양.
  7. 각 시료에 산-구니디늄 페놀 용액의 1mL당 200 μL의 클로로폼을 추가합니다. 30초가 섞이도록 손으로 힘차게 흔들어 서 2분 간 얼음에 배양합니다.
  8. 원심분리기 샘플은 4°C에서 12분 동안 10000 x g에서 샘플링합니다.
  9. 수성 상<500 μL을 신선한 미세원심분리기 튜브로 전송하여 다른 단계로 샘플을 오염시키지 않도록 주의하십시오.
    주의: 적절한 유해 물질 처리 방법으로 나머지 단계를 폐기하십시오.
  10. 각 샘플에 100% 이소프로판올의 동일한 볼륨(수성 상)을 추가합니다. 튜브를 8-10 번 반전시켜 섞는다. 얼음에 5분 동안 배양하십시오.
    1. 각 시료에 글리코겐 계수1μL을 추가하여 원심분리 후 RNA 펠릿을 찾는 데 도움을 주십시오.
  11. 4°C에서 25분 동안 12000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
  12. 튜브에서 펠릿을 찾습니다(coprecipitant를 사용하는 경우 파란색으로 나타납니다). 상체를 조심스럽게 부어.
  13. 각 샘플에 1mL의 얼음-차가운 75% 에탄올을 추가하여 펠릿을 세척하고, 소용돌이는 튜브 바닥에서 펠릿을 빼냅니다.
    참고: 분자등급 순수 에탄올과 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 75% 에탄올을 준비한다.
  14. 4°C에서 5분 동안 7000 x g의 원심분리기. 상체를 조심스럽게 부어.
  15. 5.13 및 5.14 단계를 두 번 더 반복합니다.
  16. 튜브 의 바닥에 잔류 액체를 가지고 빠른 스핀 (<2000 x g 5 s). P20 파이펫을 사용하여 튜브 바닥에서 잔류 에탄올을 제거합니다.
    1. 파이펫 팁으로 RNA 펠릿을 만지지 마십시오. 샘플 간에 팁을 변경합니다.
  17. 튜브 캡을 열어 실온에서 10 분 동안 공기 건조 샘플을 마수합니다.
    참고: 펠릿이 건조되면 반투명해질 수 있습니다. 모든 잔류 에탄올이 증발하도록 보장하면 RNA 순도가 향상됩니다.
  18. 각 튜브에 25μL의 핵을 첨가하여 펠릿을 녹입니다.
  19. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
  20. RNA를 혼합하기 위해 위아래로 부드럽게 파이펫을 합니다.
  21. 품질 관리 분석을 위해 시료의 Aliquot 5 μL을 신선한 튜브로분석합니다(6부). 유전자 발현 검사에 대해 나머지 20 μL을 -80°C에 저장합니다.

6. 품질 관리

  1. 제조업체의 지침에 따라 분광계를 사용하여 RNA의 농도와 순도를 결정합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 전기 전광 장치를 사용하여 RNA 무결성을 결정합니다.
    참고: RNA를 칩 검출 한계 범위 내에 있는 것으로 희석합니다.

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Representative Results

7개의 독특한 인간 무릎 관절 조직은 OA에 대한 TKA를 겪고 있는 환자로부터 수집할 수있다(그림 1). 이 프로토콜에서, 이들 조직은 각각4h의 수술 제거(그림2)내에서 확인및 처리되었다. 도 3에설명된 단계에 따라, 각 조직의 일부는 조직학적 평가를 위해 포르말린 고정(도4)였으며,다른 부분은 RNA 절연을 위해 플래시 동결되었다. 경조직으로부터 경조직을 분해하는 방법으로 (각각 균질화 대 분쇄), 고무결성 및 순도의 RNA를 각 조직 유형에서 추출하였으며 표 1(고품질 컬럼)에 표시된 대표적인 결과를 보였다. 특히, 몇몇 과목은 다중 조직에 걸쳐 더 낮은 질 RNA를 산출했습니다(표 1,낮은 질 컬럼), 최적화된 방법에도 불구하고, 외부 요인 (예를 들면, 질병 엄격)는 조직 모형에 걸쳐 RNA 질에 영향을 미칠 수 있다는 것을 건의합니다.

Figure 1
도 1: 측면 단면을 나타내는 인간 무릎 관절의 회로도. 7개의 표지된 조직각각은 TKA 도중 집합되고 이 프로토콜에 기술된 것과 같이 연구 목적을 위해 이용됩니다. VMO = 광대 한 내측 경사 근육. 이미지 액세스 및 창조적 인 공용 라이센스에 따라 OpenStax 대학에서 수정26. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: TKA를 앓고있는 환자로부터 얻은 7 개의 조직에 대한 대표 총 이미지. (A)관절 연골을 가리키는 화살표로 절단된 전방 대퇴골 뼈를 수집한다. 연골은 뼈의 표면에 있는 희끄무레한 층에 의해 확인됩니다. (B)자궁내부막뼈를 가리키는 화살표로 절단된 전방 대퇴골뼈를 채취한다. (C)반월 상 연골. TKA 동안 전기 카우터화로 인한 탄 부분을 수집하지 마십시오. (D)인프라 슬래플러 지방 패드 (노란색 색상). (E)전방 십자 인대 (흰색, 섬유, 해면 조직). (F)시노비움. 한쪽은 밝은 색깔과 섬유질, 종종 지방 조직을 포함하는 나타납니다, 반대쪽은 분홍빛이 않고 덜 섬유 나타납니다 동안. 멤브레인의 분홍색 면에는 끈적 끈적한 안감이 들어 있습니다. (G)바스타스 내측 경사 근육 (빨간색). 이것은 수시로 가장 작은 조직 부분일지도 모르고 몇몇 지방 조직을 포함할 수 있습니다. 배율 막대 = 2cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 조직학 및 RNA를 위한 1차 인간 OA 조직을 수집하기 위하여 취한 단계의 개요. 이 프로토콜은 환자 선택, 조직학 및 RNA를 위한 샘플 처리, 단단한 조직 및 연조직을 위한 조직 균질화, RNA 추출 및 7개의 1차 인간 무릎 OA 조직을 위한 품질 관리를 기술합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: TKA를 앓고 있는 환자로부터 얻은 7개의 조직에 대한 조직학적 섹션. Hematoxylin 및 eosin 염색 섹션은 패널 A - 패널 A- 패널 A-F에서 40배로 확대된F의 6배 배율로 표시됩니다. (A, A') 관절 연골; (A, A") 아전드랄 뼈; (B, B') 반월 상 연골; (C, C')인프라슬란아 지방 패드; (D, D') 전방 십자 인대; (E, E')시노비움; (F, F') 광대 한 내측 경사 근육. 스케일 바 = A-F용 400 μm, A'-F 및 A용 50 μm". 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조직 N 린 [RNA] (ng/μL) 25 μL A260:A280 A260:A230
고품질 낮은 품질 고품질 낮은 품질 고품질 낮은 품질 고품질 낮은 품질 고품질 낮은 품질
"단단한 조직"
관절 연골 10 4 7.0 ± 0.8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1.80 ± 0.09 1.47 ± 0.34 1.40 ± 0.36 0.45 ± 0.26
서브콘드리아 뼈 10 4 7.8 ± 0.6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1.96 ± 0.05 1.90 ± 0.17 1.72 ± 0.27 1.12 ± 0.62
반월 상 연골 10 4 7.5 ± 0.6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1.91 ± 0.05 1.71 ± 0.15 1.41 ± 0.47 0.77 ± 0.59
"연조직"
인프라 파텔라 지방 패드 10 3 8.5 ± 0.6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1.99 ± 0.01 2.02 ± 0.03 2.09 ± 0.17 1.47 ± 0.71
전방 십자 인대 8 3 7.4 ± 0.4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1.97 ± 0.03 1.91 ± 0.18 1.88 ± 0.20 1.35 ± 0.70
시노비움 9 3 8.5 ± 0.6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1.99 ± 0.04 2.00 ± 0.03 2.05 ± 0.11 1.91 ± 0.20
바스타스 중내 경사 9 3 8.5 ± 0.6 8.4 ± 0.7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1.96 ± 0.03 1.99 ± 0.03 1.82 ± 0.11 1.62 ± 0.27

표 1. TKA 환자로부터 수집된 OA 조직에서 분리된 RNA의 질 및 양. RIN = RNA 무결성 번호. RIN, A260 : A280 및 A260:RNA농도 값에 대한평균 ± 표준 편차로 제시된 데이터. 고품질 샘플은 모든 조직 유형이 RIN > 6 (n = 8-10)으로 RNA를 산출한 환자로 구성됩니다. 저품질 샘플은 다중 조직 유형이 RIN < 6 (n = 3-4)로 RNA를 산출한 환자로 구성됩니다.

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Discussion

제시된 프로토콜은 RNA추출(표 1)및 조직학적 처리(도4)를위한 7개의 1차 인간 OA 조직을 수집하는 데 성공한 것으로 입증되었다. 환자 샘플을 수집하기 전에 외과 의사 또는 외과 팀과 협력하여 IRB 승인 프로토콜을 수립해야합니다. 시편 수집을 위한 표준화된 프로토콜(예: 시상 위치에서 일관된 절제)을 적용하면 실험 재현성을 극대화하는 데 필수적입니다. 조직 샘플은 멸균 용기에 실험실로 이송되어야하며 분해를 방지하기 위해 수술의 4 시간 이내에 처리해야합니다. 조직 해부 및 처리 하는 동안, 모든 조직은 멸균 PBS에 수화 하 고 신선한에서 헹구어, 살균 PBS는 RNA 추출 또는 조직학에 대 한 포머틴 고정에 대 한 플래시 동결 되기 전에 생물 유체 및 기타 원치 않는 파편 등 잠재적인 표면 오염 물질을 제거 하기 위해 헹구는 PBS에 헹구어. 조직학적 분석의 유용한 적용은 혈소클린 및 에오신(도4)과같은 표준 얼룩에 의해 관찰가능한 다른 요인 들 중 세포 수, 분포 및 형태학에 의해 구별될 수 있기 때문에 조직 유형 및 질병 중증도의 확인이다.

1 차적인 인간 OA 조직은 순도 및 무결성 에 의해 정의된 대로 충분한 양과 질의 RNA를 추출하기위한 도전을 제시 할 수있습니다(27). RNA 수량은 조직의 전반적인 세포성의 기능이며, 무릎 관절에는 연골, 뼈 및 반월 상연과 같은 낮은 세포, 고매트릭스 조직이 있으며, 지방 패드, ACL, synovium 및 VMO와 같은 상대적으로 높은 세포, 저매트릭스 조직이 있다. 예를 들어, 관절 형질 연골 과 반월 상연골(28)은 콜라겐, 프로테오글리칸 및 기타당단백질(28)및29의다양한 양을 포함하는 세포외 매트릭스와 함께 낮은 세포성을 특징으로 한다. 적은 세포를 갖는 것은 조직의 부피 당 적은 RNA를 초래 (양을 감소) RNA와 공동 정제에 더 많은 단백질 결과를 갖는 (순도 감소)25,30. RNA 순도는 A 260 : A280 및 A260: 230 값 <의230 값은 유기 오염 물질 (예를 들어, 단백질) 및 ~2.0의 값이 순수RNA(31)를반영하는 분광성측정에 의해 결정될 수 있다. RNA 무결성은 실험 조건(즉, 전단력)에 의한 또는 효소 소화(예를 들어, 뉴클레아제)에 의한 분해 수준을 반영하며, 종종 전기전구 분석에 의해 결정됩니다. 1의 RNA 무결성 번호(RIN)는 저하된 RNA를 반사하고 10의 RIN은 그대로RNA(31,32)를반사한다. RNA-시퀀싱의 경우 최소 RIN 7은 종종33,34,35를권장합니다. 표 1에 제시된 데이터는 이러한 A260 :A280, A260 :A230,및 RIN 임계값이 일부 A260을제외하고, 저품질 RNA 군에서 환자 샘플에 비해 고품질 RNA 군내 환자 샘플로부터 모든 조직에 걸쳐 충족되었다는 것을 알 수 있습니다:A230 낮은 세포, 고매트릭스 조직에서 RNA의 단백질 오염을 반영할 수 있는 값. 주어진 환자 샘플에서 분리 된 RNA의 품질에 기여할 수있는 많은 요인이 있지만, 그 중 질병 심각도의 수준이 될 수 있습니다. OA 조직의 병들면 성질은 조직을 소화할 수 있는 효소의 증가수준을 통해 분해 과정이 발생하고 있음을 시사합니다, 그러나 또한 RNA, 그 으로 질을 감소시킵니다.

RNA 추출을 위한 이 프로토콜은 1차 인간 OA 조직에서 RNA 양 그리고 질을 최대화하는 것을 목표로 합니다. 조직이 분쇄되거나 균질화됨으로써 분해되었는지 여부에 관한 가장 중요한 단계는 조직 세포성 및 매트릭스 조성과 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 처음에는 7개의 조직이 액체 질소를 사용하여 박격포와 유봉에 의해 먼저 분쇄된 다음 산-구아니디늄-페놀 용액으로 옮겨지고, 핸드헬드 조직 균질화를 사용하여 균질화되는 동일한 프로토콜을 적용하였다. 이 방법은 지방 패드, ACL, 시노비움 및 VMO (집단적으로 연조직; 상대적으로 높은 세포, 저매트릭스)에 대한 유리한 RNA 수율, 순도 및 무결성을 생산하지만 연골, 뼈 및 반월 상 연골 (집단적으로 단단한 조직; 또한, 저세포, 고매트릭스)에 대한 불리한 결과를 생성했습니다. 이러한 관찰에 기초하여, 7개의 조직은 추가 프로토콜 개선을 위한 2개의 단으로 분할되었습니다. 추가 균질화는 미세 분말로 분쇄 된 후 하드 조직을 더 붕괴시키는 데 최소한의 영향을 미쳤습니다. 반대로, 연조직의 해리는 균질화만으로는 성공적으로 이루어졌으며 분쇄를 요구하지 않았다. 따라서, 연조직의 단단한 조직의 균질화및 분쇄는 제거되었다. 이것은 전단력, 처리 시간 및 온도 변동을 최소화하는 데 도움이되었으며, 모두 RNA 무결성을 향상시킬 수 있습니다. 7개의 조직을 위한 페놀/클로로폼 상 분리의 2라운드가 수행되었으며, 이는수율(31)을감소시켜 내지 않고 RNA 순도를 개선하는 것으로 보고되었다.

이 프로토콜의 잠재적 인 제한은 실험 설계가 모든 조직 간의 비교가 필요한 경우 조직을 두 그룹으로 분리하여 발생할 수있는 배치 효과입니다. 분쇄 및 균질화 방법의 사용은가변성(36)을도입할 수 있는 기술적(예를 들어, 처리 시간) 및 환경(예를 들어, 온도 변동) 조건을 변경할 수 있다. 두 번째 제한은 피사체 안팎에서 조직을 식별, 해부 및 지향(조직학적 단면)에 있는 잠재적 불일치입니다. 세 번째 제한은 현재 보고서에서 환자 질환 심각도와 RNA 품질 사이의 잠재적 상관 관계를 확인할 수 없다는 것입니다. 네 번째 제한은 비교를 위한 건강한 통제 조직의 가용성의 부족입니다. 제어 샘플은 시체에서 사용할 수 있지만 TKA에서 OA 조직보다 덜 쉽게 사용할 수 있습니다. 이를 우회하는 실험 전략은 각 주제를 조직 전반에 걸쳐 비교하든, 또는 보존된 영역에 대한 치료 또는 병변을 비교하는 조직 내에서 비교하든, 각 주제를 자신의 통제로 사용하는 것입니다. 마지막으로, RNA 추출을 위한 조직 박리세포를 사용하면 조직을 구성하는 개별 세포 유형의 유전자 발현 분석을 허용하지 않는다(예를 들어, 활모 섬유아세포 대 용액세포세포(37).

지적 된 한계에도 불구하고, 기본 인간 OA 조직은 연구를위한 귀중한 자원입니다, OA에 대한 다른 실험 시스템에 비해 장점을 제공, 세포 틈새 시장을 보존 포함(23). 그러나, 1 차적인 인간 OA 조직은 물류 또는 기술적인 도전 때문에 연구에서 활용되지 않을 수 있습니다. 이 프로토콜은 환자 선택, 샘플 처리, 조직 균질화, RNA 추출 및 품질 관리를 설명하여 TKA로부터 얻은 샘플의 사용을 지원합니다. 샘플 처리에 이어 유전자 발현 및 히스토로지 등 여러 가지 실험적 접근법을 추구할 수 있다. 빠르게 진화하는 오믹스 필드와 가장 관련성이 높은 것은 RNA-시퀀싱38,39와같은 응용 분야에 대해 충분한 양의 고품질 RNA를 분리하는 능력이다. 분자 단면도는 특정 질병 표현형을 가진 피험자에서 조직 내 및 조직에서 비교될 수 있습니다 (예를 들면, 나이, 성별 및 그밖 OA 위험 요소에 근거를 두십시오). 얻은 통찰력은 OA 환자 인구로 더 쉽게 번역 될 수있는 새로운 치료 방법을 알릴 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는 이 연구를 가능하게 하고 골관절염 필드에 있는 새로운 과학자에게 이 보고를 헌정한 연구 참가자에게 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

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생물학 제 173
인간 골관절염 무릎 관절에서 조직 수집 및 RNA 추출
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Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

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