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Biology

Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

I tessuti primari ottenuti da pazienti dopo artroplastica totale del ginocchio forniscono un modello sperimentale per la ricerca sull'osteoartrite con la massima traducibilità clinica. Questo protocollo descrive come identificare, elaborare e isolare l'RNA da sette tessuti del ginocchio unici per supportare l'indagine meccanicistica nell'osteoartrite umana.

Abstract

L'osteoartrite (OA) è una malattia articolare cronica e degenerativa che colpisce più spesso il ginocchio. Poiché attualmente non esiste una cura, l'artroplastica totale del ginocchio (TKA) è un intervento chirurgico comune. Esperimenti che utilizzano tessuti OA umani primari ottenuti da TKA forniscono la capacità di studiare i meccanismi della malattia ex vivo. Mentre in precedenza si pensava che l'OA impattasse principalmente sulla cartilagine, ora è noto che ha un impatto su più tessuti nell'articolazione. Questo protocollo descrive la selezione del paziente, l'elaborazione dei campioni, l'omogeneizzazione dei tessuti, l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità (basato sulla purezza, l'integrità e la resa dell'RNA) da ciascuno dei sette tessuti unici per supportare l'indagine del meccanismo della malattia nell'articolazione del ginocchio. Con il consenso informato, i campioni sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a TKA per OA. I tessuti sono stati sezionati, lavati e conservati entro 4 ore dall'intervento chirurgico mediante congelamento flash per la fissazione dell'RNA o della formalina per l'istologia. I tessuti raccolti includevano cartilagine articolare, osso subcondrale, menisco, cuscinetto di grasso infrapatellare, legamento crociato anteriore, sinovia e muscolo obliquo vastus medialis. I protocolli di estrazione dell'RNA sono stati testati per ogni tipo di tessuto. La modifica più significativa ha coinvolto il metodo di disintegrazione utilizzato per i tessuti duri a bassa cellula, ad alta matrice (considerati come cartilagine, ossa e menisco) rispetto ai tessuti molli relativamente ad alta cellula, a bassa matrice (considerati come cuscinetto di grasso, legamento, sinovia e muscolo). Si è scoperto che la polverizzazione era appropriata per i tessuti duri e l'omogeneizzazione era appropriata per i tessuti molli. È stata osservata una propensione per alcuni soggetti a produrre valori più elevati di numero di integrità dell'RNA (RIN) rispetto ad altri soggetti in modo coerente su più tessuti, suggerendo che fattori sottostanti come la gravità della malattia possono influire sulla qualità dell'RNA. La capacità di isolare RNA di alta qualità dai tessuti OA umani primari fornisce un modello fisiologicamente rilevante per sofisticati esperimenti di espressione genica, incluso il sequenziamento, che possono portare a intuizioni cliniche che sono più facilmente tradotte per i pazienti.

Introduction

Il ginocchio è la più grande articolazione sinoviale del corpo umano, comprendente l'articolazione tibiofemorale tra la tibia e il femore e l'articolazione femoro-rotula tra la rotula e il femore1. Le ossa del ginocchio sono rivestite con cartilagine articolare e supportate da vari tessuti connettivi, tra cui menischi, grasso, legamenti e muscoli, e una membrana sinoviale incapsula l'intera articolazione per creare una cavità piena di liquido sinoviale1,2,3 ( Figura1). Un ginocchio sano funziona come un'articolazione a cerniera mobile che consente un movimento senza attrito nel piano frontale1,3. In condizioni patologiche, il movimento può diventare limitato e doloroso. La malattia degenerativa dell'articolazione del ginocchio più comune è l'osteoartrite (OA)4. Una varietà di fattori di rischio sono noti per predisporre allo sviluppo di OA, tra cui età avanzata, obesità, sesso femminile, traumi articolari e genetica, tra gli altri5,6. Attualmente ci sono circa 14 milioni di persone negli Stati Uniti con OA sintomatica del ginocchio, con la prevalenza in aumento a causa dell'aumento dell'età della popolazione e dei tassi di obesità7,8. Inizialmente considerata una malattia della cartilagine, l'OA è ora intesa come una malattia dell'intera articolazione9. I cambiamenti patologici comunemente osservati nell'OA includono l'erosione della cartilagine articolare, la formazione di osteofiti, l'ispessimento osseo subcondrale e l'infiammazione della sinovia9,10. Poiché non esiste una cura nota per l'OA, i trattamenti si concentrano principalmente sulla gestione dei sintomi (ad esempio, dolore)11,12e una volta che l'OA è progredito allo stadio finale, la chirurgia di sostituzione articolare è spesso indicata13.

Gli interventi chirurgici di sostituzione articolare possono essere sostituzioni parziali o totali del ginocchio, con artroplastica totale del ginocchio (TKA) che include la sostituzione dell'intera articolazione tibiofemorale e dell'articolazione femoro-rotula. A partire dal 2020, circa 1 milione di TKA vengono eseguiti negli Stati Uniti ogni anno14. Durante la TKA, un chirurgo ortopedico risente la porzione superiore del plateau tibiale e i condili femorali inferiori(Figura 2A,2B)per essere dotato di impianti protesici. A volte male interpretato dai pazienti, in un TKA, solo 8-10 mm vengono resecati dall'estremità di ciascun osso, che viene successivamente tappato o riaffiolato, con metallo. Un rivestimento in polietilene interposto forma la superficie del cuscinetto (cioè l'imbottitura) tra i due impianti metallici. Inoltre, diversi componenti dei tessuti molli dell'articolazione vengono completamente o parzialmente asportati per ottenere un corretto equilibrio articolare. Tra questi tessuti ci sono i menisci mediali e laterali (Figura 2C), cuscinetto di grasso infrapatellare (Figura 2D), legamento crociato anteriore (LCA; Figura 2E), sinovia (Figura 2F) e muscolo obliquo vastus medialis (VMO; Figura 2G) 15. Sebbene i TCA siano generalmente efficaci per il trattamento con OA, circa il 20% dei pazienti riferisce il ripetersi del dolore dopo l'intervento chirurgico16. Insieme all'alto costo e alla relativa invasività della procedura, queste limitazioni indicano la necessità di ulteriori ricerche per identificare trattamenti alternativi per mitigare la progressione dell'OA.

Per esplorare i meccanismi di malattia nell'OA che possono presentare nuove strade per l'intervento terapeutico, possono essere utilizzati sistemi sperimentali, tra cui cellule, espianti tissutali e modelli animali. Le cellule sono tipicamente coltivate in monostrato e sono derivate da tessuti primari umani o animali (ad esempio, condrociti isolati dalla cartilagine) o cellule immortalizzate (ad esempio, ATDC517 e CHON-00118). Mentre le cellule possono essere utili per manipolare variabili sperimentali in un ambiente di coltura controllato, non catturano le condizioni dell'articolazione naturale che sono note per avere un impatto sui fenotipi cellulari19. Per ricapitolare meglio la complessa cascata di comunicazione chimica, meccanica e cellula-cellula alla base dell'OA, un'alternativa si trova nei campioni primari di tessuto umano o animale, utilizzati freschi o coltivati ex vivo come espianti, per preservare la struttura tissutale e il microambiente cellulare20. Per studiare l'articolazione in vivo,sono utili anche modelli animali piccoli (ad esempio, topo21) e grandi (ad esempio, cavallo22) per OA (ad esempio, attraverso l'induzione chirurgica, l'alterazione genetica o l'invecchiamento). Tuttavia, la traduzione da questi modelli alla malattia umana può essere limitata da differenze anatomiche, fisiologiche e metaboliche, tra gli altri23. Considerando i vantaggi e gli svantaggi dei sistemi sperimentali, i punti di forza chiave di essere specie-specifici e mantenere la nicchia extracellulare offerta dai tessuti OA umani primari massimizzano il potenziale traslazionale dei risultati della ricerca.

I tessuti OA umani primari possono essere facilmente ottenuti dopo TKA, rendendo l'alta frequenza di TKA una risorsa preziosa per la ricerca. Tra le potenziali applicazioni sperimentali ci sono l'espressione genica e le analisi istologiche. Per realizzare il potenziale dei tessuti OA umani primari per questi approcci di ricerca e altri, delineati sono le seguenti considerazioni chiave. In primo luogo, l'uso di campioni di pazienti è soggetto a regolamentazione etica e i protocolli devono soddisfare le approvazioni dell'Institutional Review Board (IRB)24. In secondo luogo, l'eterogeneità intrinseca dei tessuti primari umani malattia e l'influenza di variabili come l'età e il sesso, tra gli altri, creano la necessità di un'attenta selezione del paziente (cioè l'applicazione di criteri di ammissibilità) e l'interpretazione dei dati. In terzo luogo, le proprietà biologiche uniche di diversi tessuti dell'articolazione (ad esempio, bassa cellularità della cartilagine e del menisco25)possono presentare sfide durante gli esperimenti (ad esempio, isolando alta qualità e quantità di RNA). Questo rapporto affronta queste considerazioni e presenta un protocollo per la selezione del paziente, l'elaborazione dei campioni, l'omogeneizzazione dei tessuti, l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità (cioè la valutazione della purezza e dell'integrità dell'RNA; Figura 3) incoraggiare l'uso di tessuti OA umani primari nella comunità di ricerca.

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Protocol

Questo protocollo di studio è stato approvato e ha seguito le linee guida istituzionali stabilite dall'Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).

1. Selezione del paziente

  1. Identificare i pazienti tra quelli programmati per sottoporsi a TKA con un chirurgo ortopedico.
  2. Selezionare i pazienti in base ai criteri di ammissibilità definiti dal protocollo di studio. Esempi di criteri di inclusione includono avere almeno 18 anni di età e avere una diagnosi confermata di osteoartrosi del ginocchio. Esempi di criteri di esclusione includono la sostituzione parziale del ginocchio o una diagnosi confermata di artrite reumatoide.
  3. Contattare i pazienti per ottenere il consenso informato prima dell'intervento chirurgico.

2. Elaborazione del campione (per RNA)

NOTA: Eseguire tutta la lavorazione dei tessuti in un armadio di biosicurezza di classe II e seguire tecniche sterili. Indossare sempre DPI appropriati (guanti in nitrile, camice da laboratorio, occhiali di sicurezza) durante l'elaborazione di campioni umani. Diversi frammenti ossei vengono prodotti durante il TKA, una grande quantità di osso / cartilagine sarà potenzialmente disponibile per la dissezione. A causa della progressione della malattia, la degenerazione della cartilagine articolare può essere più grave su alcune porzioni ossee, che possono essere prese in considerazione nella progettazione sperimentale. Solo i tessuti che impongono l'elettrocauteria per la resezione hanno danni al bordo termico e viene fatto uno sforzo chirurgico concertato per procurare la maggior parte dei tessuti con un bisturi per ridurre al minimo i danni. I tessuti resecati devono essere mantenuti idratati in ogni momento con PBS sterile.

  1. Disinfettare tutte le superfici di lavoro e le attrezzature con etanolo al 70%, decontaminante RNasi, acqua trattata con DEPC e di nuovo con etanolo al 70%. Pulire il liquido residuo con tessuti puliti e privi di lanugine. Pinzuppe, tagliaossa e bisturi sono autoclavati o imbevuti di etanolo al 70% per almeno 10 minuti prima dell'uso. Mantenere le apparecchiature immerse nel 70% di etanolo quando non sono in uso immediato.
  2. Pre-etichettare almeno tre crioviali con nome del campione de-identificato e numero di aliquote per ciascun tessuto (ad esempio, TKA-1 Cartilagine 1).
    1. Identificare ogni tipo di tessuto dal campione in base alle differenze di dimensioni, forma, colore e consistenza come mostrato e descritto nella Figura 2. Identificare la cartilagine (Figura 2A freccia), l'osso (Figura 2B freccia ), il menisco (Figura 2C), il cuscinetto di grasso infrapatellare (Figura 2D), il legamento crociato anteriore (Figura 2E), la sinovia (Figura 2F) e il muscolo obliquo vastus medialis (Figura 2G).
  3. Isolare la cartilagine articolare.
    1. Selezionare una porzione ossea con degradazione minima della cartilagine.
    2. Usando un bisturi No.10, tagliare la profondità della cartilagine il più lontano possibile per sezionare l'intero spessore dello strato cartilagineo.
      NOTA: un bisturi No.10 penetrerà solo nella cartilagine, non nell'osso.
    3. Utilizzando l'intero spessore della cartilagine, sezionare tre cubi da 5 mm.
  4. Isolare l'osso subcondrale.
    1. Utilizzare la stessa sezione ossea da cui è stata raccolta la cartilagine.
    2. Utilizzando un bisturi No.10, raschiare la cartilagine rimanente e i tessuti residui dalla superficie ossea.
    3. Tenere la porzione ossea da tagliare con una pinca e utilizzare le frese per tagliare tre cubi da 5 mm.
  5. Isolare il menisco.
    1. Identificare una porzione relativamente intatta del menisco mediale o laterale.
    2. Usando un bisturi e una pinze No.10, seziona tre cubi da 5 mm.
  6. Isolare il cuscinetto di grasso infrapatellare.
    1. Usando un bisturi e una pinze No.10, tagliare la porzione gialla del tessuto in tre porzioni di dimensioni uguali e omogenee (~ 500 mg ciascuna).
  7. Isolare il legamento crociato anteriore (LCA).
    1. Usando un bisturi e una pinze No.10, seziona tre cubi da 5 mm.
  8. Isolare la sinovia.
    1. Usando un bisturi e una pinze No.10, isolare il più possibile la porzione cellulare rosa della membrana raschiando via il tessuto adiposo.
    2. Sezionare tre porzioni di uguali dimensioni e omogenee (~ 200 mg ciascuna).
  9. Isolare il muscolo obliquo vastus medialis (VMO).
    1. Utilizzando un bisturi e una pinze No.10, rimuovere qualsiasi tessuto adiposo dal campione, lasciando solo il tessuto muscolare rosso.
    2. Sezionare tre cubi da 5 mm.
      NOTA: La dimensione iniziale del tessuto limita la dimensione delle porzioni.
  10. Risciacquare le porzioni di tessuto con PBS sterile per rimuovere eventuali residui o detriti.
  11. Per eseguire l'istologia, fissare ogni porzione di tessuto come descritto nella Parte 3.
  12. Per eseguire l'estrazione dell'RNA, tagliare ciascuna delle tre porzioni di tessuto in pezzi più piccoli (cubi ~ 1-2   mm).
    1. Trasferire i pezzi più piccoli in un tappo crioviale da 2 ml e fissare saldamente, congelare il flash immergendoli in azoto liquido per 30 s, quindi trasferire in un congelatore a -80 °C per la conservazione a lungo termine (fino a 4 mesi testati nel protocollo corrente). Ripeti questo per tutte le aliquote di tutti i tessuti.
    2. Continuare con l'omogeneizzazione dei tessuti come descritto nella Parte 4.

3. Elaborazione del campione (per l'istologia)

ATTENZIONE: La formalina è una sostanza chimica pericolosa, utilizzata solo in una cappa aspirante chimica.

  1. Riempire tubi conici pre-etichettati da 15 mL con soluzione di formalina al 10%.
  2. Usando la pinetta, trasferire la sezione del tessuto ai tubi riempiti di formalina.
  3. Fissare i tessuti in formalina per 1 settimana a temperatura ambiente mentre si agita / agita se possibile.
  4. Dopo 1 settimana, scartare la formalina nel corretto smaltimento dei rifiuti chimici, sciacquare i tessuti con PBS e quindi trasferire in un tubo conico fresco da 15 ml contenente il 70% di etanolo per la conservazione a lungo termine a 4 °C fino a quando i campioni non vengono incorporati per il sezionamento.
    NOTA: Solo per osso/cartilagine, eseguire la decalcificazione come segue.
  5. Dopo 1 settimana, scartare la formalina nel corretto smaltimento dei rifiuti chimici e risciacquare i tessuti con PBS.
  6. Trasferire il tessuto in un tubo conico da 50 mL con 45 mL di soluzione di EDTA al 10% (pH 7,4).
  7. Se l'agitazione / agitazione non è possibile, invertire i tubi 10-15 volte al giorno.
  8. Scartare e sostituire la soluzione EDTA una volta alla settimana.
    1. Due volte alla settimana, testare la trama con uno strumento (ad es. spatola) o un dito guantato per confermare la decalcificazione osservando la deformazione quando viene applicata la pressione. Il tempo necessario per decalcificare il tessuto osseo varia tra i campioni da 4-6 settimane.
  9. Una volta decalcificato, sciacquare il tessuto con PBS e trasferirlo in un tubo conico fresco da 15 ml contenente il 70% di etanolo per la conservazione a lungo termine a 4 °C fino a quando i campioni non vengono incorporati per il sezionamento.

4. Omogeneizzazione dei tessuti

ATTENZIONE: Il protocollo utilizza il fenolo chimico pericoloso. Il lavoro con fenolo deve essere eseguito in una cappa chimica.

NOTA: Pulire accuratamente tutte le attrezzature e le superfici da utilizzare con etanolo al 70% (immergere per un minimo di 10 minuti), seguito da decontaminante RNase (immergere per un minimo di 10 minuti), risciacquare con acqua trattata con DEPC, pulire con un tovagliolo di carta pulito e privo di lanugine, quindi rispolverare o immergere con etanolo al 70%.

  1. Omogeneizzazione dei tessuti duri (cartilagine articolare, osso subcondrale, menisco)
    1. Prima dell'omogeneizzazione, raffreddare il mortaio, il pestello e la spatola usando azoto liquido. Questi devono essere mantenuti il più freddo possibile per evitare il disgelo del campione.
    2. Elaborare i campioni uno alla volta, mantenendo gli altri campioni a -80 °C fino all'utilizzo.
    3. Trasferire il campione di tessuto in malta usando una spatola refrigerata; versare ulteriore azoto liquido sulla parte superiore del tessuto e lasciarlo evaporare. Schiacciare il tessuto usando il pestello. Aggiungere ripetutamente più azoto liquido al campione di tessuto, lasciarlo evaporare e quindi continuare a macinare con il pestello per produrre una polvere fine.
    4. Dopo aver polverizzato il tessuto il più possibile, trasferire in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml pre-refrigerato.
      1. Tubi pre-raffreddamento immergendoli in azoto liquido per 30 s prima del trasferimento tissutale.
    5. Aggiungere 1 mL di soluzione acido-guanidinio-fenolo a ciascun tubo e tenerlo sul ghiaccio.
    6. Ripetere i passaggi 4.1.3-4.1.5 per ogni campione di tessuto duro.
    7. Dopo ogni tessuto, pulire il mortaio, il pestello e la spatola con etanolo al 70%, decontaminante RNasi, acqua trattata con DEPC e un ulteriore ammollo in etanolo al 70%. Pulire qualsiasi liquido residuo con un tessuto pulito e privo di lanugine.
    8. Incubare i campioni sul ghiaccio per altri 20 minuti.
  2. Omogeneizzazione dei tessuti molli (cuscinetto di grasso infrapatellare, LCA, sinovia, VMO)
    1. Disinfettare l'omogeneizzatore facendo scorrere tubi di etanolo al 70%, decontaminante RNasi, acqua trattata con DEPC e un ulteriore lavaggio con etanolo al 70%, ciascuno per 30 s. Pulire qualsiasi liquido residuo con un tessuto pulito e privo di lanugine. Ripetere questa operazione tra ogni campione.
    2. Pre-etichettare 5 mL di provette rotonde per ogni campione. Aggiungere 1 mL della soluzione acido-guanidinio-fenolo a ciascun tubo.
      1. Lavorare su un campione alla volta, mantenendo gli altri campioni da lavorare a -80 °C fino all'uso.
    3. Trasferire il tessuto in un tubo da 5 ml pre-etichettato con acido-guanidinio-fenolo.
    4. Omogeneizzare i tessuti in impulsi di 30 s, mantenendosi sul ghiaccio durante e tra gli impulsi. Ripetere fino a quando il tessuto è visivamente disciolto o per un massimo di cinque impulsi da 30 s.
      NOTA: Alcuni tessuti fibrosi (cioè muscoli) potrebbero non omogeneizzarsi completamente.
    5. Incubare il tessuto disciolto sul ghiaccio e passare al campione successivo.
      1. Pulire l'omogeneizzatore come descritto al punto 4.2.1. Assicurarsi che i pezzi di tessuto non rimangano nei denti della sonda; rimuovere con pinp sterile se necessario.
    6. Dopo l'omogeneizzazione di tutti i campioni, incubare su ghiaccio in acido-guanidinio-fenolo per altri 20 minuti.
    7. Trasferire i campioni da tubi a fondo tondo a tubi microcentrifuga da 1,5 mL pre-etichettati e pre-refrigerati.

5. Estrazione dell'RNA dai tessuti

ATTENZIONE: Questo protocollo utilizza sostanze chimiche pericolose come fenolo, cloroformio e isopropanolo. Esegui tutto il lavoro in una cappa aspirante chimica.

NOTA: le apparecchiature e i reagenti sono riservati solo al lavoro sull'RNA e devono essere di grado chimico appropriato per applicazioni molecolari (cioè sterili, privi di nucleasi). Questo protocollo succede sia alle parti 4.1 che ai protocolli di omogeneizzazione dei tessuti 4.2. Pulire accuratamente tutte le attrezzature e le superfici da utilizzare con etanolo al 70% (immergere per un minimo di 10 minuti), seguito da decontaminante RNasi (immergere per un minimo di 10 minuti). Risciacquare con acqua trattata con DEPC, pulire il liquido residuo con un asciugamano di carta pulito e privo di lanugine, quindi riverniciare o immergere con etanolo al 70%.

  1. Centrifugare i tubi microcentrifuga a 10000 x g per 10 min a 4 °C per pellettizzare i detriti.
  2. Trasferire il surnatante in un tubo microcentrifuga fresco da 1,5 ml.
    NOTA: Per i tessuti grassi, a volte sarà presente uno strato lipidico sulla parte superiore. Evitare di trasferirlo perforando lo strato sul lato del tubo con una punta della pipetta.
  3. Aggiungere 200 μL di cloroformio per 1 mL di soluzione acido-guanidinio-fenolo a ciascun campione. Agitare energicamente i tubi a mano per 30 s da mescolare. Quindi, incubare sul ghiaccio per 2 minuti.
  4. Centrifugare i campioni a 10000 x g per 12 min a 4 °C.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, si saranno formati tre strati: una fase acquosa contenente RNA, un'interfase di DNA bianco e una fase proteica rosa nella parte inferiore.
  5. Trasferire ~ 500 μL della fase acquosa superiore in un tubo microcentrifuga fresco da 1,5 mL.
    NOTA: Non disturbare l'interfase e le frazioni proteiche. Conservare queste fasi a -80 °C per un futuro isolamento del DNA o delle proteine.
  6. Aggiungere un volume uguale di soluzione acido-guanidinio-fenolo alla fase acquosa trasferita, mescolare invertendo il tubo 8-10 volte. Incubare il tubo sul ghiaccio per 20 min.
  7. Aggiungere 200 μL di cloroformio per 1 mL di soluzione acido-guanidinio-fenolo a ciascun campione. Agitare energicamente a mano per 30 s per mescolare e poi incubare sul ghiaccio per 2 minuti.
  8. Centrifugare i campioni a 10000 x g per 12 min a 4 °C.
  9. Trasferire <500 μL della fase acquosa in un tubo microcentrifuga fresco, facendo attenzione a non contaminare il campione con le altre fasi.
    ATTENZIONE: Scartare le fasi rimanenti con metodi appropriati di smaltimento dei materiali pericolosi.
  10. Aggiungere un volume uguale (come fase acquosa) di isopropanolo al 100% a ciascun campione. Mescolare invertendo il tubo 8-10 volte. Incubare su ghiaccio per 5 min.
    1. Aggiungere 1 μL di coprecipitant di glicogeno a ciascun campione per aiutare a localizzare il pellet di RNA dopo la centrifugazione.
  11. Centrifugare i campioni a 12000 x g per 25 min a 4 °C.
  12. Individuare il pellet nel tubo (se si utilizza coprecipitant, apparirà blu). Versare con attenzione il surnatante.
  13. Lavare il pellet aggiungendo 1 mL di etanolo ghiacciato al 75% a ciascun campione, vortice per rimuovere il pellet dal fondo del tubo.
    NOTA: Preparare etanolo al 75% utilizzando etanolo puro di grado molecolare e acqua priva di nucleasi.
  14. Centrifugare a 7000 x g per 5 min a 4 °C. Versare con attenzione il surnatante.
  15. Ripetere i passaggi 5.13 e 5.14 altre due volte.
  16. Rotazione rapida (<2000 x g per 5 s) per portare l'eventuale liquido residuo sul fondo del tubo. Utilizzare una pipetta P20 per rimuovere l'etanolo residuo dal fondo dei tubi.
    1. Evitare di toccare il pellet di RNA con una punta di pipetta. Cambia i suggerimenti tra i campioni.
  17. Con i tappi del tubo aperti, asciugare all'aria i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti.
    NOTA: il pellet può diventare traslucido mentre si asciuga. Garantire che tutto l'etanolo residuo sia evaporato migliorerà la purezza dell'RNA.
  18. Aggiungere 25 μL di acqua priva di nucleasi a ciascun tubo per sciogliere il pellet.
  19. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  20. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare l'RNA.
  21. Aliquota 5 μL del campione in un tubo fresco per l'analisi del controllo qualità (Parte 6). Conservare i restanti 20 μL a -80 °C per i test di espressione genica.

6. Controllo qualità

  1. Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro secondo le istruzioni del produttore.
  2. Determinare l'integrità dell'RNA utilizzando un dispositivo di elettroforesi secondo le istruzioni del produttore.
    NOTA: diluire l'RNA in modo che rientri nell'intervallo dei limiti di rilevamento del chip.

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Representative Results

Sette tessuti unici dell'articolazione del ginocchio umano sono disponibili per la raccolta da pazienti sottoposti a TKA per OA (Figura 1). In questo protocollo, ciascuno di questi tessuti è stato identificato ed elaborato entro 4 ore dalla rimozione chirurgica (Figura 2). Seguendo i passaggi descritti nella Figura 3,porzioni di ciascun tessuto sono state fissate in formalina per la valutazione istologica (Figura 4), mentre altre porzioni sono state congelate per l'isolamento dell'RNA. Separando i tessuti duri dai tessuti molli mediante il metodo di disintegrazione (polverizzazione contro omogeneizzazione, rispettivamente), l'RNA di elevata integrità e purezza è stato estratto da ciascun tipo di tessuto, con risultati rappresentativi mostrati nella Tabella 1 (Colonne di alta qualità). In particolare, alcuni soggetti hanno prodotto RNA di qualità inferiore su più tessuti(Tabella 1,Colonne di bassa qualità), suggerendo che, nonostante un metodo ottimizzato, fattori esterni (ad esempio, la gravità della malattia) possono influire sulla qualità dell'RNA tra i tipi di tessuto.

Figure 1
Figura 1: Schema dell'articolazione del ginocchio umano che mostra una sezione trasversale laterale. Ciascuno dei sette tessuti etichettati viene raccolto durante TKA e utilizzato per scopi di ricerca come descritto in questo protocollo. VMO = muscolo obliquo vastus medialis. Immagine accessibile e modificata da OpenStax College sotto una licenza creative commons26. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini lorde rappresentative per ciascuno dei sette tessuti ottenuti da pazienti sottoposti a TKA. (A) Osso femorale anteriore tagliato con freccia che indica la cartilagine articolare da raccogliere. La cartilagine è identificata da uno strato biancastro trovato sulla superficie dell'osso. (B) Osso femorale anteriore tagliato con freccia che indica l'osso subcondrale da raccogliere. (C) Menisco. Evitare di raccogliere sezioni bruciate causate dall'elettrocauterizzazione durante TKA. (D) Cuscinetto di grasso infrapellare (di colore giallo). (E) Legamento crociato anteriore (tessuto bianco, fibroso, spugnoso). (F) Sinovia. Un lato apparirà di colore chiaro e fibroso, spesso contenente tessuto adiposo, mentre il lato opposto apparirà rosato e meno fibroso. Il lato rosa della membrana contiene il rivestimento sinoviale. (G) Muscolo obliquo Vastus medialis (rosso). Questa può spesso essere la porzione di tessuto più piccola e può contenere del tessuto adiposo. Barra della scala = 2 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Panoramica delle misure adottate per raccogliere tessuti OA umani primari per l'istologia e l'RNA. Questo protocollo descrive la selezione del paziente, l'elaborazione dei campioni per l'istologia e l'RNA, l'omogeneizzazione dei tessuti per tessuti duri e tessuti molli, l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità per sette tessuti OA primari del ginocchio umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Sezioni istologiche per ciascuno dei sette tessuti ottenuti da pazienti sottoposti a TKA. Le sezioni macchiate di ematossilina ed eosina sono mostrate con ingrandimento 6x nei pannelli A-F con inserto ingrandito a 40x nei pannelli A'-F' e A". (A, A') Cartilagine articolare; (A, A") osso subcondrale; (B, B') menisco; (C, C') cuscinetto di grasso infrapatellare; (D, D') legamento crociato anteriore; (E, E') sinovia; (F, F') muscolo obliquo vastus medialis. Barre di scala = 400 μm per A-F e 50 μm per A'-F' e A". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fazzoletto N RIN [RNA] (ng/μL) in 25 μL A260:A280 A260:A230
Alta qualità Bassa qualità Alta qualità Bassa qualità Alta qualità Bassa qualità Alta qualità Bassa qualità Alta qualità Bassa qualità
"Tessuti duri"
Cartilagine articolare 10 4 7.0 ± 0.8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1,80 ± 0,09 1,47 ± 0,34 1,40 ± 0,36 0,45 ± 0,26
Osso subcondrale 10 4 7,8 ± 0,6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1,96 ± 0,05 1,90 ± 0,17 1,72 ± 0,27 1,12 ± 0,62
Menisco 10 4 7,5 ± 0,6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1,91 ± 0,05 1,71 ± 0,15 1,41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
"Tessuti molli"
Cuscinetto di grasso infrapellare 10 3 8,5 ± 0,6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1,99 ± 0,01 2,02 ± 0,03 2,09 ± 0,17 1,47 ± 0,71
Legamento crociato anteriore 8 3 7,4 ± 0,4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1,97 ± 0,03 1,91 ± 0,18 1,88 ± 0,20 1,35 ± 0,70
Sinovia 9 3 8,5 ± 0,6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1.99 ± 0.04 2.00 ± 0.03 2,05 ± 0,11 1,91 ± 0,20
Vasto Medialis Obliquo 9 3 8,5 ± 0,6 8,4 ± 0,7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1,96 ± 0,03 1,99 ± 0,03 1,82 ± 0,11 1,62 ± 0,27

Tabella 1. Qualità e quantità di RNA isolato da tessuti OA raccolti da pazienti TKA. RIN = Numero di integrità dell'RNA. I dati presentati come ± deviazione standard media per i rapporti RIN, A260:A280 e A260:A230 e media (intervallo) per i valori di concentrazione dell'RNA. I campioni di alta qualità sono costituiti da pazienti da cui tutti i tipi di tessuto hanno prodotto RNA con RIN > 6 (n = 8-10). I campioni di bassa qualità sono costituiti da pazienti da cui più tipi di tessuto hanno prodotto RNA con RIN < 6 (n = 3-4).

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Discussion

Il protocollo presentato si è dimostrato efficace per la raccolta di sette tessuti OA umani primari per l'estrazione dell'RNA (Tabella 1) e l'elaborazione istologica (Figura 4). Prima di raccogliere i campioni dei pazienti, è necessario stabilire un protocollo approvato dall'IRB, idealmente in collaborazione con un chirurgo o un team chirurgico. L'applicazione di un protocollo standardizzato per la raccolta dei campioni (ad esempio, la resezione da posizioni coerenti in situ) è essenziale per massimizzare la riproducibilità sperimentale. I campioni di tessuto devono essere trasportati in laboratorio in contenitori sterili e trattati entro 4 ore dall'intervento chirurgico per evitare la degradazione. Durante la dissezione e la lavorazione dei tessuti, tutti i tessuti vengono mantenuti idratati in PBS sterili e vengono risciacquati in PBS freschi e sterili per rimuovere potenziali contaminanti superficiali come biofluidi e altri detriti indesiderati prima di essere congelati per l'estrazione dell'RNA o fissati con formalina per l'istologia. Un'utile applicazione dell'analisi istologica è la conferma dei tipi di tessuto e della gravità della malattia poiché questi possono essere distinti per numero di cellule, distribuzione e morfologia, tra gli altri fattori osservabili da macchie standard come ematossilina ed eosina (Figura 4).

I tessuti OA umani primari possono presentare sfide per l'estrazione di RNA di quantità e qualità sufficienti, come definito da purezza e integrità27. La quantità di RNA è una funzione della cellularità complessiva del tessuto e, nell'articolazione del ginocchio, ci sono tessuti a bassa cellula e ad alta matrice come la cartilagine, l'osso e il menisco e tessuti relativamente ad alta e bassa matrice come il cuscinetto adiposo, l'ACL, la sinovia e il VMO. Ad esempio, sia la cartilagine ialina articolare che la fibrocartilagine meniscale28 sono caratterizzate da bassa cellularità, con la matrice extracellulare contenente quantità variabili di collageni, proteoglicani e altre glicoproteine28,29. Avere meno cellule si traduce in meno RNA per volume di tessuto (riducendo la quantità) e avere più proteine si traduce in co-purificazione con RNA (riducendo la purezza)25,30. La purezza dell'RNA può essere determinata mediante spettrofotometria dove A260:A280 e A260:A230 valori di <1,5 riflettono la presenza di contaminanti organici (ad esempio, proteine) e valori di ~ 2,0 riflettono RNA puro31. L'integrità dell'RNA riflette il livello di degradazione, sia causato da condizioni sperimentali (cioè forze di taglio) o dalla digestione enzimatica (ad esempio, nucleasi), ed è spesso determinato dall'analisi elettroforetica. Un RNA Integrity Number (RIN) di 1 riflette l'RNA degradato e un RIN di 10 riflette l'RNAintatto31,32. Per il sequenziamento dell'RNA, un RIN minimo di 7 è spesso raccomandato33,34,35. I dati presentati nella Tabella 1 rivelano che queste soglie A260:A280, A260:A230e RIN sono state soddisfatte in tutti i tessuti dei campioni di pazienti nel gruppo RNA di alta qualità rispetto ai campioni di pazienti nel gruppo RNA di bassa qualità, ad eccezione di alcuni A260:A230 valori, che possono riflettere la contaminazione proteica dell'RNA nei tessuti a bassa e alta matrice. Mentre ci sono molti fattori che potrebbero contribuire alla qualità dell'RNA isolato da un determinato campione di paziente, tra questi può esserci il livello di gravità della malattia. La natura malata dei tessuti OA suggerisce che i processi degradativi si verificano attraverso un aumento dei livelli di enzimi che possono digerire i tessuti, ma anche l'RNA, riducendo così la qualità.

Questo protocollo per l'estrazione dell'RNA mira a massimizzare la quantità e la qualità dell'RNA dai tessuti OA umani primari. Il passo più critico riguardava il fatto che i tessuti fossero disintegrati dall'essere polverizzati o omogeneizzati, e questo è risultato correlato alla cellularità del tessuto e alla composizione della matrice. Inizialmente, tutti e sette i tessuti sono stati sottoposti allo stesso protocollo in cui i tessuti sono stati prima polverizzati da mortaio e pestello usando azoto liquido, quindi trasferiti in soluzione acido-guanidinio-fenolo e ulteriormente omogeneizzati utilizzando un omogeneizzatore tissutale portatile. Questo metodo ha prodotto resa, purezza e integrità favorevoli dell'RNA per il cuscinetto adiposo, ACL, sinovia e VMO (collettivamente tessuti molli; anche, cellule relativamente alte, bassa matrice), ma risultati sfavorevoli per cartilagine, osso e menisco (collettivamente tessuti duri; anche, a bassa cellula, ad alta matrice). Sulla base di queste osservazioni, i sette tessuti sono stati divisi in due gruppi per un ulteriore perfezionamento del protocollo. È stato osservato che l'omogeneizzazione aggiuntiva ha avuto un effetto minimo sull'ulteriore disintegrazione dei tessuti duri dopo che erano stati polverizzati in una polvere fine. Al contrario, la dissociazione dei tessuti molli è stata ottenuta con successo con la sola omogeneizzazione e non ha richiesto la polverizzazione. Pertanto, l'omogeneizzazione dei tessuti duri e la polverizzazione dei tessuti molli sono state eliminate. Ciò è stato utile per ridurre al minimo le forze di taglio, il tempo di elaborazione e le fluttuazioni di temperatura, che possono migliorare l'integrità dell'RNA. Sono stati eseguiti due cicli di separazione di fase fenolo/cloroformio per tutti e sette i tessuti, poiché è stato riportato che questo migliora la purezza dell'RNA senza ridurre la resa31.

Una potenziale limitazione di questo protocollo è l'effetto batch che può derivare dalla separazione dei tessuti in due gruppi se il disegno sperimentale richiede il confronto tra tutti i tessuti. L'uso della polverizzazione rispetto ai metodi di omogeneizzazione può alterare le condizioni tecniche (ad esempio, il tempo di elaborazione) e ambientali (ad esempio, le fluttuazioni di temperatura) che possono introdurre variabilità36. Una seconda limitazione è la potenziale incoerenza nell'identificare, sezionare e orientare (per il sezionamento istologico) i tessuti all'interno e tra i soggetti. Una terza limitazione è la nostra incapacità di confermare le potenziali correlazioni tra la gravità della malattia del paziente e la qualità dell'RNA nel rapporto attuale. Una quarta limitazione è la mancanza di disponibilità di tessuti di controllo sani per il confronto. Sebbene i campioni di controllo possano essere disponibili dai cadaveri, questi sono meno facilmente disponibili rispetto ai tessuti OA di TKA. Una strategia sperimentale per aggirare questo è quella di utilizzare ogni soggetto come proprio controllo, sia che si facciano confronti tra tessuti o all'interno di tessuti confrontando il trattamento con il controllo o lesionati con le aree preservate. Infine, l'utilizzo di espianti tissutali per l'estrazione dell'RNA non consente l'analisi dell'espressione genica dei singoli tipi cellulari che compongono i tessuti (ad esempio, fibroblasti sinoviali contro macrofagi sinoviali37).

Nonostante i limiti noti, i tessuti OA umani primari sono una risorsa preziosa per la ricerca, offrendo vantaggi rispetto ad altri sistemi sperimentali per OA, tra cui la conservazione della nicchia cellulare23. Tuttavia, i tessuti OA umani primari possono essere sottoutilizzati nella ricerca a causa di sfide logistiche o tecniche. Questo protocollo descrive la selezione del paziente, l'elaborazione dei campioni, l'omogeneizzazione dei tessuti, l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità per supportare l'uso dei campioni ottenuti da TKA. Dopo l'elaborazione del campione, è possibile perseguire diversi approcci sperimentali, tra cui l'espressione genica e l'istologia, tra gli altri. Più rilevante per il campo omico in rapida evoluzione è la capacità di isolare quantità sufficienti di RNA di alta qualità per applicazioni come il sequenziamento dell'RNA38,39. I profili molecolari possono essere confrontati all'interno e tra i tessuti di soggetti con fenotipi di malattia specifici (ad esempio, in base all'età, al sesso e ad altri fattori di rischio OA). Le intuizioni acquisite possono informare nuove vie terapeutiche che possono essere più facilmente tradotte nella popolazione di pazienti OA.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano i partecipanti allo studio che hanno reso possibile questa ricerca e dedicano questo rapporto a nuovi scienziati nel campo dell'osteoartrite.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

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Biologia Numero 173
Raccolta dei tessuti ed estrazione dell'RNA dall'articolazione del ginocchio osteoartritico umano
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Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

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