Summary
从全膝关节置换术后的患者获得的原代组织为骨关节炎研究提供了一个实验模型，具有最大的临床可转化性。该协议描述了如何从七个独特的膝关节组织中鉴定，处理和分离RNA，以支持人类骨关节炎的机制研究。
Abstract
骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，最常影响膝盖。由于目前尚无治愈方法，全膝关节置换术（TKA）是一种常见的手术干预。使用从TKA获得的原代人OA组织的实验提供了研究 离体疾病机制的能力。虽然OA以前被认为主要影响软骨，但现在已知它会影响关节中的多个组织。该协议描述了来自七个独特组织的患者选择，样品处理，组织均质化，RNA提取和质量控制（基于RNA纯度，完整性和产量），以支持膝关节的疾病机制研究。经知情同意，从接受TKA治疗OA的患者处获得样本。在手术后4小时内通过闪光冷冻RNA或福尔马林固定进行组织学检查，洗涤和储存组织组织。收集的组织包括关节软骨、软骨下骨、半月板、髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜和内侧斜肌。针对每种组织类型测试RNA提取方案。最显著的修饰涉及用于低细胞、高基质、硬组织（被视为软骨、骨骼和半月板）与相对高细胞、低基质、软组织（被视为脂肪垫、韧带、滑膜和肌肉）的崩解方法。研究发现，粉碎适用于硬组织，均质化适用于软组织。观察到一些受试者倾向于在多个组织中产生比其他受试者更高的RNA完整性数（RIN）值，这表明疾病严重程度等潜在因素可能会影响RNA质量。从原代人类OA组织中分离高质量RNA的能力为复杂的基因表达实验（包括测序）提供了生理相关模型，可以导致更容易转化为患者的临床见解。
Introduction
膝关节是人体最大的滑膜关节，包括胫骨和股骨之间的胫股关节以及髌骨和股骨之间的髌股关节1。膝盖中的骨骼衬有关节软骨，并由各种结缔组织支撑，包括半月板，脂肪，韧带和肌肉，滑膜封装整个关节以形成充满滑液的腔1，2，3（图1）。健康的膝盖作为一个移动的铰链关节，允许在额平面1，3中无摩擦运动。在病理条件下，运动会受到限制和疼痛。最常见的退行性膝关节疾病是骨关节炎（OA）4。已知各种危险因素易发生OA发展，包括年龄较大，肥胖，女性，关节创伤和遗传学，除其他外5，6。目前，美国估计有1400万人患有有症状的膝关节OA，由于人口年龄和肥胖率上升，患病率增加7，8。OA最初被认为是软骨的疾病，现在被理解为整个关节的疾病9。OA中通常观察到的病理变化包括关节软骨侵蚀，骨赘形成，软骨下骨增厚和滑膜炎症9，10。由于OA没有已知的治愈方法，治疗主要集中在症状（例如，疼痛）管理11，12，并且一旦OA进展到终末期，通常需要关节置换手术13。
关节置换手术可以是部分或全膝关节置换术，全膝关节置换术（TKA）包括置换整个胫股关节和髌股关节。截至2020年，美国每年约有100万个TKA进行14。在TKA期间，整形外科医生切除胫骨平台的上部和下股骨髁（图2A，2B）以安装假体植入物。有时被患者误解，在TKA中，只有8-10毫米从每块骨头的末端切除，随后用金属覆盖或重新表面。插入的聚乙烯衬垫在两个金属植入物之间形成轴承表面（即衬垫）。此外，关节的几个软组织成分被完全或部分切除，以实现适当的关节平衡。这些组织包括内侧和外侧半月板（图2C），髌下脂肪垫（图2D），前交叉韧带（ACL;图2E）、滑膜（图2F）和内侧斜肌（VMO;图2G）虽然TKA通常对OA治疗是成功的，但大约20%的患者报告手术后疼痛复发16。除了手术的高成本和相对侵入性外，这些局限性表明需要进一步研究以确定替代疗法以减轻OA的进展。
为了探索OA中的疾病机制，这些机制可能为治疗干预提供新的途径，可以使用实验系统，包括细胞，组织外植体和动物模型。细胞通常在单层中培养，并且来源于原代人或动物组织（例如，从软骨中分离的软骨细胞）或永生化细胞（例如，ATDC517 和CHON-00118）。虽然细胞可用于在受控培养环境中操纵实验变量，但它们不能捕获已知影响细胞表型的自然关节条件19。为了更好地概括OA背后的化学，机械和细胞间通讯的复杂级联反应，在原代人或动物组织样品中发现了一种替代方案，无论是使用新鲜还是 培养的离体 作为外植体，以保留组织结构和细胞微环境20。为了研究 体内关节，小（如小鼠21）和大（如马22）动物模型对OA（如手术诱导、遗传改变或衰老）也是有用的。然而，从这些模型到人类疾病的转化可能受到解剖学，生理学和代谢差异的限制，其中包括23。考虑到实验系统的优缺点，物种特异性和维持主要人类OA组织提供的细胞外生态位的关键优势最大限度地发挥了研究结果的转化潜力。
原代人类OA组织在TKA之后可以很容易地获得，这使得TKA的高频率成为研究的宝贵资源。潜在的实验应用包括基因表达和组织学分析。为了实现初级人类OA组织在这些研究方法和其他方面的潜力，概述了以下关键考虑因素。首先，患者标本的使用受道德规范的约束，并且协议必须符合机构审查委员会（IRB）的批准24。其次，人类原发性病变组织固有的异质性以及年龄和性别等变量的影响，使得需要仔细选择患者（即，应用资格标准）和数据解释。第三，关节中不同组织的独特生物学特性（例如，软骨和半月板25的低细胞性）在实验过程中可能会带来挑战（例如，分离高质量和数量的RNA）。本报告解决了这些考虑因素，并提出了患者选择，样品处理，组织均质化，RNA提取和质量控制（即评估RNA纯度和完整性; 图 3）鼓励在研究界使用初级人类OA组织。
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Protocol
该研究方案获得批准并遵循亨利福特卫生系统机构审查委员会（IRB #13995）制定的机构指南。
1. 患者选择
- 从计划与整形外科医生一起接受TKA的患者中确定患者。
- 根据研究方案定义的合格标准选择患者。纳入标准的示例包括年满 18 周岁且确诊为膝关节骨关节炎。排除标准的例子包括接受部分膝关节置换术或确诊为类风湿性关节炎。
- 在手术前联系患者以获得知情同意。
2. 样品处理（用于RNA）
注意：在II类生物安全柜中执行所有组织处理，并遵循无菌技术。在处理人体样本时，始终佩戴适当的个人防护用品（丁腈手套、实验室外套、安全护目镜）。在TKA期间会产生几个骨碎片，大量的骨/软骨可能可用于解剖。由于疾病进展，某些骨骼部分的关节软骨变性可能更严重，这可以纳入实验设计。只有要求进行电烙术进行切除的组织才会有热边缘损伤，并且需要协同手术，用手术刀获取大多数组织，以尽量减少损伤。切除的组织必须始终使用无菌PBS保持水分。
- 用70%乙醇，RNase去污剂，DEPC处理的水以及70%乙醇对所有工作台面和设备进行消毒。用干净、不起毛的纸巾擦去残留的液体。镊子，切骨刀和手术刀在使用前高压灭菌或浸泡在70%乙醇中至少10分钟。当不立即使用时，保持设备浸没在70%乙醇中。
- 预先标记至少三个冷冻管，每个组织具有去识别的样品名称和等分试样号（例如，TKA-1软骨1）。
- 根据大小，形状，颜色和纹理的差异从标本中识别每种组织类型，如图2所示和描述。识别软骨（图2A箭头），骨骼（图2B箭头），半月板（图2C），髌下脂肪垫（图2D），前交叉韧带（图2E），滑膜（图2F）和腭内侧斜肌（图2G）。
- 隔离关节软骨。
- 选择软骨退化最小的骨骼部分。
- 使用10号手术刀，尽可能切开软骨深度，以解剖软骨层的全部厚度。
注意：10号手术刀只能穿透软骨，而不能穿透骨骼。 - 使用软骨的全厚度，解剖三个5毫米的立方体。
- 分离软骨下骨。
- 使用从中收集软骨的同一骨骼部分。
- 使用10号手术刀，从骨表面刮掉任何剩余的软骨和残留组织。
- 握住要用镊子切割的骨头部分，并使用切骨刀切割三个5毫米的立方体。
- 隔离半月板。
- 识别内侧或外侧半月板相对未受损的部分。
- 使用10号手术刀和镊子，解剖三个5毫米立方体。
- 隔离髌下脂肪垫。
- 使用10号手术刀和镊子，将组织的黄色部分切成三个大小相等且均匀的部分（每个约500mg）。
- 隔离前交叉韧带 （ACL）。
- 使用10号手术刀和镊子，解剖三个5毫米立方体。
- 隔离滑膜。
- 使用10号手术刀和镊子，通过刮掉脂肪组织，尽可能多地分离膜的粉红色细胞部分。
- 解剖三个大小相等且均质的部分（每个约200mg）。
- 隔离内侧斜肌 （VMO）。
- 使用10号手术刀和镊子，从标本中去除任何脂肪组织，只留下红肌组织。
- 解剖三个5毫米的立方体。
注意：组织的初始大小限制了部分的大小。
- 用无菌PBS冲洗组织部分，以除去任何残留物或碎屑。
- 要进行组织学检查，请按照 第3部分所述固定每个组织部分。
- 为了进行RNA提取，将三个组织部分中的每一个切成更小的块（〜1-2毫米 立方体）。
- 将较小的碎片转移到2 mL冷冻管中，紧紧固定盖子，通过浸没在液氮中30秒来快速冷冻，然后转移到-80°C冰箱中进行长期储存（在当前方案中测试长达4个月）。对所有组织的所有等分试样重复此操作。
- 继续按 第4部分所述进行组织均质化。
3. 样品处理（用于组织学）
注意：福尔马林是一种危险化学品，仅用于化学通风橱。
- 用10%福尔马林溶液填充预先标记的15 mL锥形管。
- 使用镊子将组织切片转移到福尔马林填充管中。
- 将组织在室温下固定在福尔马林中1周，同时尽可能摇动/搅拌。
- 1周后，将福尔马林丢弃到适当的化学废物处理中，用PBS冲洗组织，然后转移到含有70%乙醇的新鲜15mL锥形管中，在4°C下长期储存，直到嵌入样品进行切片。
注意：仅适用于骨骼/软骨，请按如下方式进行脱钙。 - 1周后，将福尔马林丢弃到适当的化学废物处理中，并用PBS冲洗组织。
- 将组织转移到带有45mL 10%EDTA溶液（pH 7.4）的50mL锥形管中。
- 如果无法摇晃/搅拌，则倒置试管10-15次，每日一次。
- 丢弃并更换 EDTA 溶液，每周一次。
- 每周两次，用仪器（即刮刀）或戴手套的手指测试纹理，通过观察施加压力时的变形来确认脱钙。骨组织脱钙所需的时间在4-6周的样本之间会有所不同。
- 脱钙后，用PBS冲洗组织，并转移到含有70%乙醇的新鲜15mL锥形管中，在4°C下长期储存，直到嵌入样品进行切片。
4. 组织均质化
注意：该协议使用有害化学物质苯酚。苯酚的工作必须在化学通风橱中进行。
注意：彻底清洁所有设备和表面，用70%乙醇（浸泡至少10分钟），然后使用RNase去污剂（浸泡至少10分钟），用DEPC处理的水冲洗，用干净的无绒纸巾擦拭，然后用70%乙醇重新喷洒或浸泡。
-
硬组织均质化（关节软骨、软骨下骨、半月板）
- 在均质化之前，使用液氮冷却研钵，杵和刮刀。这些必须尽可能保持低温，以防止样品解冻。
- 一次处理一个样品，将其他样品保持在-80°C直至使用。
- 使用冷却的刮刀将组织样品转移到砂浆中;将额外的液氮倒在组织顶部，让它蒸发。使用杵压碎组织。反复向组织样品中加入更多的液氮，使其蒸发，然后继续用杵研磨以制成细粉。
- 尽可能多地将组织粉末化后，转移到预冷的1.5mL微量离心管中。
- 在组织转移之前，通过浸没在液氮中30s来预冷却管。
- 向每管中加入1 mL酸性胍苯酚溶液，并将其保持在冰上。
- 对每个硬组织样品重复步骤4.1.3-4.1.5。
- 在每个组织之后，用70%乙醇，RNase去污剂，DEPC处理的水和额外的浸泡在70%乙醇中清洁研钵，杵和刮刀。用干净、无绒毛的纸巾擦拭任何残留液体。
- 将样品在冰上再孵育20分钟。
-
软组织均质化（髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜、静脉血氧运动）
- 通过运行70%乙醇，RNase去污剂，DEPC处理水和额外的70%乙醇洗涤管对均质器进行消毒，每次30秒。用干净、无绒毛的纸巾擦拭任何残留液体。在每个样品之间重复此操作。
- 为每个样品预先贴上 5 mL 圆底管的标签。向每管中加入1 mL酸性胍苯酚溶液。
- 一次处理一个样品，保持其他样品在-80°C下处理直至使用。
- 将组织转移到带有酸性胍苯酚的预标记的5 mL管中。
- 在30秒脉冲中均质化组织，在脉冲期间和脉冲之间保持在冰上。重复此步骤，直到组织在视觉上溶解或最多五个30秒脉冲。
注意：一些纤维组织（即肌肉）可能无法完全均质化。 - 将溶解的组织孵育在冰上，然后移动到下一个样品中。
- 按照步骤4.2.1中所述清洁均质器。确保组织块不会留在探针的牙齿中;如果需要，用无菌镊子取出。
- 所有样品均质后，在冰上嫳育酸性胍基苯酚20分钟。
- 将样品从圆底管转移到预先标记和预冷的1.5 mL微量离心管中。
5. 从组织中提取RNA
注意：本规程使用危险化学品，如苯酚、氯仿和异丙醇。在化学通风橱中执行所有工作。
注意：设备和试剂仅用于RNA工作，并且必须具有适当的化学等级，用于分子应用（即无菌，无核酸酶）。该协议继承了 第4.1部分 和第 4.2 部分的组织均质化方案。彻底清洁所有设备和表面，用70%乙醇使用（浸泡至少10分钟），然后使用RNase去污剂（浸泡至少10分钟）。用DEPC处理过的水冲洗，用干净的无绒纸巾擦拭残留的液体，然后用70%乙醇重新喷涂或浸泡。
- 在4°C下以10000×g离心微量离心管10分钟以沉淀碎屑。
- 将上清液转移到新鲜的1.5mL微量离心管中。
注意：对于脂肪组织，脂质层有时会出现在顶部。通过用移液器吸头刺穿管侧的层来避免转移。 - 向每个样品中每1mL酸性胍苯酚溶液加入200μL氯仿。用手用力摇晃管子30秒以混合。然后，在冰上孵育2分钟。
- 在4°C下以10000×g离心样品12分钟。
注意：离心后，将形成三层：含有RNA的水相，白色DNA间相和底部的粉红色蛋白质相。 - 将~500μL上层水相转移到新鲜的1.5mL微量离心管中。
注意：不要干扰相间和蛋白质组分。将这些相储存在-80°C，以备将来进行DNA或蛋白质分离。 - 向转移的水相中加入等体积的酸-胍-苯酚溶液，通过倒置管8-10次混合。将管子在冰上孵育20分钟。
- 向每个样品中每1mL酸性胍苯酚溶液加入200μL氯仿。用手剧烈摇晃30秒，混合，然后在冰上孵育2分钟。
- 在4°C下以10000×g离心样品12分钟。
- 将<500μL水相转移到新鲜的微量离心管中，注意不要用其他相污染样品。
注意：使用适当的危险材料处理方法丢弃剩余的相。 - 向每个样品中加入等体积（作为水相）100%异丙醇。倒置管8-10次混合。在冰上孵育5分钟。
- 向每个样品加入1μL糖原共沉淀剂，以帮助在离心后定位RNA沉淀。
- 在4°C下以12000×g离心样品25分钟。
- 在管中定位颗粒（如果使用共沉淀剂，它将显示为蓝色）。小心地倒出上清液。
- 通过向每个样品中加入1mL冰冷的75%乙醇来洗涤沉淀，涡旋以将沉淀从管的底部移开。
注意：使用分子级纯乙醇和无核酸酶水制备75%乙醇。 - 在4°C下以7000×g离心5分钟。 小心地倒出上清液。
- 再重复步骤 5.13 和 5.14 两次。
- 快速旋转（<2000 x g 持续 5 秒），将任何残留液体带到管底部。使用P20移液器从管底部除去任何残留的乙醇。
- 避免用移液器吸头接触RNA沉淀。在样品之间更换吸头。
- 打开管盖，在室温下风干样品10分钟。
注意：颗粒在干燥时可能会变得半透明。确保所有残留的乙醇蒸发将提高RNA纯度。 - 向每个管中加入25μL无核酸酶水以溶解沉淀。
- 在室温下孵育5分钟。
- 轻轻地上下移液以混合RNA。
- 将5μL样品等分到新鲜管中进行质量控制分析（第6部分）。将剩余的20μL储存在-80°C下用于基因表达测定。
6. 质量控制
- 根据制造商的说明，使用分光光度计确定RNA的浓度和纯度。
- 根据制造商的说明，使用电泳装置确定RNA完整性。
注意：将RNA稀释至在芯片检测限范围内。
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Representative Results
七种独特的人类膝关节组织可供接受TKA治疗OA的患者收集（图1）。在该协议中，这些组织中的每一个都被鉴定并在手术切除后的4小时内进行处理（图2）。按照 图3中概述的步骤，每个组织的一部分被福尔马林固定用于组织学评估（图4），而其他部分则被速冻以进行RNA分离。通过崩解方法（分别为粉碎与均质化）将硬组织与软组织分离，从每种组织类型中提取具有高完整性和纯度的RNA，具有代表性的结果如 表1（ 高质量色谱柱）所示。值得注意的是，一些受试者在多个组织中产生了较低质量的RNA（表1，低质量柱），这表明尽管优化了方法，但外部因素（例如，疾病严重程度）可能会影响组织类型的RNA质量。
图1：人类膝关节示意图，显示横向截面。 七种标记组织中的每一种都是在TKA期间收集的，并用于本方案中描述的研究目的。VMO = 内侧斜肌。图片由OpenStax College根据知识共享许可协议26访问和修改。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：从接受TKA的患者获得的七个组织中每个组织的代表性总图像。（A）股骨前部切开，箭头指向要收集的关节软骨。软骨由骨表面上发现的白色层识别。（B）股骨前部切开，箭头指向要收集的软骨下骨。（C） 半月板。避免在TKA期间收集由电烙术引起的烧焦部分。（D） 髌下脂肪垫（黄色）。（E） 前交叉韧带（白色、纤维状、海绵状组织）。（F） 滑膜。一侧会出现浅色和纤维状，通常含有脂肪组织，而另一侧会出现粉红色和纤维较少。膜的粉红色一侧包含滑膜衬里。（G） 内侧斜肌 （红色）。这通常是最小的组织部分，可能含有一些脂肪组织。比例尺 = 2 cm。请单击此处查看此图的放大版本。
图3：为收集原代人OA组织学和RNA而采取的步骤概述。 该协议描述了患者选择，组织学和RNA的样品处理，硬组织和软组织的组织均质化，RNA提取以及七个主要人类膝关节OA组织的质量控制。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：从接受TKA的患者获得的七个组织中每个组织的组织学切片。苏木精和曙红染色切片在面板A- F中以6倍放大倍率显示，在A'- F'和A面板中嵌入放大至40倍"。 （A， A'）关节软骨;（A，A"）软骨下骨;（B， B'） 半月板;（C， C'） 髌下脂肪垫;（D， D'） 前交叉韧带;（E， E'）滑膜;（F， F'） 内侧斜肌。比例尺 = A-F 为 400 μm，A'-F' 和 A 为 50 μm。"请点击此处查看此图的放大版本。
| 组织 | N | 林卡 | [核糖核酸]（ng/μL） 25 μL | A260：A280 | A260：A230 | ||||||||
| 高品质 | 低质量 | 高品质 | 低质量 | 高品质 | 低质量 | 高品质 | 低质量 | 高品质 | 低质量 | ||||
| "硬纸巾" | |||||||||||||
| 关节软骨 | 10 | 4 | 7.0 ± 0.8 | 1.3 ± 1.2 | 135 (36-243) |
46 (26-78) |
1.80 ± 0.09 | 1.47 ± 0.34 | 1.40 ± 0.36 | 0.45 ± 0.26 | |||
| 软骨下骨 | 10 | 4 | 7.8 ± 0.6 | 3.6 ± 1.1 | 514 (181-1586) |
342 (122-769) |
1.96 ± 0.05 | 1.90 ± 0.17 | 1.72 ± 0.27 | 1.12 ± 0.62 | |||
| 半月板 | 10 | 4 | 7.5 ± 0.6 | 2.4 ± 0.3 | 242 (38-1629) |
95 (60-318) |
1.91 ± 0.05 | 1.71 ± 0.15 | 1.41 ± 0.47 | 0.77 ± 0.59 | |||
| "软组织" | |||||||||||||
| 髌下脂肪垫 | 10 | 3 | 8.5 ± 0.6 | 6.1 ± 1.4 | 1905 (668-5100) |
1151 (381-2306) |
1.99 ± 0.01 | 2.02 ± 0.03 | 2.09 ± 0.17 | 1.47 ± 0.71 | |||
| 前交叉韧带 | 8 | 3 | 7.4 ± 0.4 | 5.2 ± 1.9 | 1836 (613-8456) |
727 (97-1479) |
1.97 ± 0.03 | 1.91 ± 0.18 | 1.88 ± 0.20 | 1.35 ± 0.70 | |||
| 滑膜 | 9 | 3 | 8.5 ± 0.6 | 6.2 ± 3.1 | 2239 (401-4100) |
1897 (902-3366) |
1.99 ± 0.04 | 2.00 ± 0.03 | 2.05 ± 0.11 | 1.91 ± 0.20 | |||
| Vastus Medialis Oblique | 9 | 3 | 8.5 ± 0.6 | 8.4 ± 0.7 | 1002 (377-1715) |
1097 (308-2138) |
1.96 ± 0.03 | 1.99 ± 0.03 | 1.82 ± 0.11 | 1.62 ± 0.27 | |||
表 1.从TKA患者收集的OA组织中分离的RNA的质量和数量。RIN = RNA 完整性编号。数据显示为RIN的平均值±标准偏差，A260：A280和A260：A230比率，以及RNA浓度值的平均值（范围）。高质量样本由所有组织类型产生具有RIN>6（n = 8-10）的RNA的患者组成。低质量样本由多种组织类型产生具有RIN<6（n = 3-4）的RNA的患者组成。
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Discussion
所提出的方案已被证明可以成功地收集七种主要的人类OA组织进行RNA提取（表1）和组织学处理（图4）。在收集患者样本之前，有必要建立IRB批准的方案，最好是与外科医生或手术团队合作。应用标准化的实验方案进行标本采集（例如，从一致的原位位置切除）对于最大限度地提高实验再现性至关重要。组织样本应装在无菌容器中运输到实验室，并在手术后4小时内处理，以避免降解。在组织解剖和处理过程中，所有组织都保持在无菌PBS中水分，并在新鲜，无菌的PBS中冲洗，以去除潜在的表面污染物，如生物流体和其他不需要的碎片，然后被速冻用于RNA提取或福尔马林固定用于组织学。组织学分析的一个有用应用是确认组织类型和疾病严重程度，因为这些可以通过细胞数量，分布和形态来区分，以及通过标准染色剂（如苏木精和曙红）可观察到的其他因素（图4）。
原代人类OA组织对于提取足够数量和质量的RNA提出了挑战，如纯度和完整性所定义27。RNA数量是组织整体细胞性的函数，在膝关节中，存在低细胞，高基质组织，例如软骨，骨骼和半月板，以及相对高细胞，低基质的组织，例如脂肪垫，ACL，滑膜和VMO。例如，关节透明软骨和半月板纤维软骨28都以低细胞性为特征，其细胞外基质含有不同数量的胶原蛋白，蛋白聚糖和其他糖蛋白28，29。具有较少的细胞导致每体积组织的RNA较少（减少量），并且具有更多的蛋白质导致与RNA共纯化（降低纯度）25，30。RNA纯度可以通过分光光度法测定，其中A260：A280和A260：230值<1.5反映了有机污染物（例如蛋白质）的存在，~2.0的值反映了纯RNA31。 RNA完整性反映了降解水平，无论是由实验条件（即剪切力）还是酶消化（例如核酸酶）引起的，并且通常通过电泳分析确定。RNA完整性数（RIN）为1反映了降解的RNA，RIN为10反映了完整的RNA 31，32。对于RNA测序，通常建议至少7的RIN为33，34，35。表1中显示的数据显示，与低质量RNA组的患者样本相比，高质量RNA组患者样本的所有组织中均达到了A260：A 280，A 260：A 230和RIN阈值，但一些A260：A230除外 值，这可能反映低细胞，高基质组织中RNA的蛋白质污染。虽然有许多因素可能有助于从给定患者样本中分离出的RNA的质量，但其中可能是疾病严重程度。OA组织的疾病性质表明，通过增加可以消化组织的酶水平以及RNA来发生降解过程，从而降低质量。
该RNA提取方案旨在最大限度地提高原代人OA组织的RNA数量和质量。最关键的步骤涉及组织是否通过粉碎或均质化而分解，这被发现与组织细胞性和基质组成相关。最初，所有七种组织都经过相同的方案，其中组织首先使用液氮用研钵和研杵粉碎，然后转移到酸性胍 - 苯酚溶液中，并使用手持式组织均质器进一步均质化。这种方法为脂肪垫，ACL，滑膜和VMO（统称为软组织;也是相对高细胞，低基质）产生了有利的RNA产量，纯度和完整性，但对软骨，骨骼和半月板（统称为硬组织;也是低细胞，高基质）产生了不利的结果。基于这些观察结果，将七个组织分为两组以进行进一步的方案改进。据观察，额外的均质化对硬组织粉碎成细粉后进一步分解的影响很小。相反，软组织的解离仅通过均质化成功实现，不需要粉碎。因此，消除了硬组织的均质化和软组织的粉碎。这有利于最大限度地减少剪切力、处理时间和温度波动，所有这些都可以提高RNA的完整性。对所有七个组织进行了两轮苯酚/氯仿相分离，因为据报道这可以提高RNA纯度而不会降低产量31。
该协议的一个潜在局限性是，如果实验设计需要在所有组织之间进行比较，则将组织分成两组可能产生的批处理效应。使用粉碎与均质化方法可能会改变技术（例如，加工时间）和环境（例如，温度波动）条件，从而引入可变性36。第二个限制是在识别，解剖和定向（用于组织学切片）受试者内部和受试者之间的组织方面可能存在不一致。第三个限制是我们无法在当前报告中确认患者疾病严重程度与RNA质量之间的潜在相关性。第四个限制是缺乏用于比较的健康对照组织的可用性。虽然可以从尸体中获得对照样本，但这些样本不如TKA的OA组织容易获得。规避这一点的实验策略是使用每个受试者作为他们自己的对照，无论是跨组织进行比较还是在组织内进行比较，将治疗与对照或病变与保留区域进行比较。最后，使用组织外植体进行RNA提取不允许对构成组织的单个细胞类型进行基因表达分析（例如，滑膜成纤维细胞与滑膜巨噬细胞37）。
尽管存在明显的局限性，但初级人类OA组织是研究的宝贵资源，与其他OA实验系统相比具有优势，包括保留细胞龛位23。然而，由于后勤或技术挑战，初级人类OA组织可能在研究中未得到充分利用。该协议描述了患者选择，样品处理，组织均质化，RNA提取和质量控制，以支持使用从TKA获得的样品。在样品处理之后，可以采用几种实验方法，包括基因表达和组织学等。与快速发展的组学领域最相关的是能够分离出足够数量的高质量RNA，用于RNA测序等应用38，39。可以比较具有特定疾病表型（例如，基于年龄，性别和其他OA危险因素）的受试者的组织内部和组织之间的分子谱。获得的见解可能会为新的治疗途径提供信息，这些途径可以更容易地转化为OA患者群体。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢使这项研究成为可能的研究参与者，并将本报告献给骨关节炎领域的新科学家。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
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