Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Primaire weefsels verkregen van patiënten na totale knieartroplastiek bieden een experimenteel model voor artroseonderzoek met maximale klinische vertaalbaarheid. Dit protocol beschrijft hoe RNA uit zeven unieke knieweefsels kan worden geïdentificeerd, verwerkt en geïsoleerd om mechanistisch onderzoek bij menselijke artrose te ondersteunen.

Abstract

Artrose (OA) is een chronische en degeneratieve gewrichtsaandoening die meestal de knie aantast. Omdat er momenteel geen genezing is, is totale knieartroplastiek (TKA) een veel voorkomende chirurgische ingreep. Experimenten met primaire menselijke OA-weefsels verkregen uit TKA bieden de mogelijkheid om ziektemechanismen ex vivote onderzoeken. Terwijl eerder werd gedacht dat artrose vooral het kraakbeen beïnvloedde, is nu bekend dat het meerdere weefsels in het gewricht beïnvloedt. Dit protocol beschrijft patiëntselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (gebaseerd op RNA-zuiverheid, integriteit en opbrengst) van elk van de zeven unieke weefsels ter ondersteuning van onderzoek naar ziektemechanismen in het kniegewricht. Met geïnformeerde toestemming werden monsters verkregen van patiënten die TKA voor artrose ondergingen. Weefsels werden ontleed, gewassen en opgeslagen binnen 4 uur na de operatie door flash freezing voor RNA of formaline fixatie voor histologie. Verzamelde weefsels omvatten gewrichtskraakbeen, subchondraal bot, meniscus, infrapatellair vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier. RNA-extractieprotocollen werden getest voor elk weefseltype. De belangrijkste modificatie betrof de methode van desintegratie die wordt gebruikt voor laagcellige, hoog-matrix, harde weefsels (beschouwd als kraakbeen, bot en meniscus) versus relatief hoogcellige, lage matrix, zachte weefsels (beschouwd als vetkussen, ligament, synovium en spier). Het bleek dat verpulvering geschikt was voor harde weefsels en homogenisatie geschikt was voor zachte weefsels. Een neiging voor sommige proefpersonen om hogere RNA-integriteitsgetalwaarden (RIN) op te leveren dan andere proefpersonen consistent over meerdere weefsels, wat suggereert dat onderliggende factoren zoals de ernst van de ziekte de RNA-kwaliteit kunnen beïnvloeden. Het vermogen om hoogwaardig RNA te isoleren uit primaire menselijke OA-weefsels biedt een fysiologisch relevant model voor geavanceerde genexpressie-experimenten, inclusief sequencing, die kunnen leiden tot klinische inzichten die gemakkelijker worden vertaald naar patiënten.

Introduction

De knie is het grootste synoviale gewricht in het menselijk lichaam, bestaande uit het tibiofemorale gewricht tussen het scheenbeen en het dijbeen en het patellofemorale gewricht tussen de patella en het dijbeen1. De botten in de knie zijn bekleed met gewrichtskraakbeen en worden ondersteund door verschillende bindweefsels, waaronder menisci, vet, ligamenten en spieren, en een synoviaal membraan kapselt het hele gewricht in om een met synoviale vloeistof gevulde holte1,2,3 te creëren(figuur 1). Een gezonde knie functioneert als een mobiel scharniergewricht dat wrijvingsloze beweging in het frontale vlak1,3mogelijk maakt. Onder pathologische omstandigheden kan beweging beperkt en pijnlijk worden. De meest voorkomende degeneratieve kniegewrichtsziekte is artrose (OA)4. Van een verscheidenheid aan risicofactoren is bekend dat ze vatbaar zijn voor de ontwikkeling van artrose, waaronder oudere leeftijd, obesitas, vrouwelijk geslacht, gewrichtstrauma en genetica, onder andere5,6. Er zijn momenteel naar schatting 14 miljoen mensen in de VS met symptomatische knie artrose, waarbij de prevalentie toeneemt als gevolg van de stijgende leeftijd van de bevolking en de percentages van obesitas7,8. Aanvankelijk beschouwd als een ziekte van het kraakbeen, wordt artrose nu begrepen als een ziekte van het hele gewricht9. Vaak waargenomen pathologische veranderingen in artrose omvatten gewrichtskraakbeenerosie, osteofytvorming, subchondrale botverdikking en ontsteking van het synovium9,10. Omdat er geen bekende remedie voor artrose is, richten behandelingen zich voornamelijk op symptoom (bijv. Pijn) management11,12,en zodra artrose is gevorderd tot het eindstadium, wordt gewrichtsvervangende chirurgie vaak geïndiceerd13.

Gewrichtsvervangende operaties kunnen gedeeltelijke of totale knieprothesen zijn, met totale kniearthroplastiek (TKA) inclusief het vervangen van de gehele tibiofemorale articulatie en het patellofemorale gewricht. Vanaf 2020 worden elk jaar ongeveer 1 miljoen TKAs uitgevoerd in de VS14. Tijdens TKA rekt een orthopedisch chirurg het bovenste deel van het tibiale plateau en de onderste femorale condylen (figuur 2A, 2B) om te worden uitgerust met prothetische implantaten. Soms verkeerd geïnterpreteerd door patiënten, wordt in een TKA slechts 8-10 mm gereseceerd vanaf het uiteinde van elk bot, dat vervolgens wordt afgedekt of opnieuw wordt opgedoken, met metaal. Een tussenliggende polyethyleen voering vormt het lageroppervlak (d.w.z. vulling) tussen de twee metalen implantaten. Bovendien worden verschillende zachte weefselcomponenten van het gewricht geheel of gedeeltelijk weggesneden om een goede gezamenlijke balans te bereiken. Onder deze weefsels bevinden zich de mediale en laterale menisci (figuur 2C), infrapatellaire vetkussen (figuur 2D), voorste kruisband (ACL; Figuur 2E), synovium (figuur 2F) en vastus medialis schuine spier (VMO; Figuur 2G) 15. Hoewel TKAs over het algemeen succesvol zijn voor artrosebehandeling, meldt ongeveer 20% van de patiënten herhaling van pijn na de operatie16. Samen met de hoge kosten en relatieve invasiviteit van de procedure, wijzen deze beperkingen op de noodzaak van verder onderzoek om alternatieve behandelingen te identificeren om de progressie van artrose te verminderen.

Om ziektemechanismen in artrose te onderzoeken die nieuwe wegen voor therapeutische interventie kunnen bieden, kunnen experimentele systemen, waaronder cellen, weefselexplantaten en diermodellen worden gebruikt. Cellen worden meestal gekweekt in monolaag en zijn afgeleid van primaire menselijke of dierlijke weefsels (bijv. Chondrocyten geïsoleerd uit kraakbeen) of vereeuwigde cellen (bijv. ATDC517 en CHON-00118). Hoewel cellen nuttig kunnen zijn voor het manipuleren van experimentele variabelen in een gecontroleerde kweekomgeving, vangen ze geen omstandigheden van het natuurlijke gewricht op waarvan bekend is dat ze celfenotypenbeïnvloeden 19. Om de complexe cascade van chemische, mechanische en cel-naar-cel communicatie die ten grondslag ligt aan artrose beter samen te vatten, wordt een alternatief gevonden in primaire menselijke of dierlijke weefselmonsters, ongeacht of ze vers of ex vivo als explantaten worden gebruikt, om de weefselstructuur en de celmicro-omgeving te behouden20. Om het gewricht in vivote bestuderen, zijn kleine (bijv. muis21)en grote (bijv. paard22)diermodellen voor artrose (bijv. door chirurgische inductie, genetische verandering of veroudering) ook nuttig. De vertaling van deze modellen naar menselijke ziekten kan echter worden beperkt door anatomische, fysiologische en metabole verschillen, onder andere23. Gezien de voor- en nadelen van experimentele systemen, maximaliseren de belangrijkste sterke punten van het soortspecifiek zijn en het handhaven van de extracellulaire niche die wordt aangeboden door de primaire menselijke OA-weefsels het translationele potentieel van onderzoeksresultaten.

Primaire menselijke OA-weefsels kunnen gemakkelijk worden verkregen na TKA, waardoor de hoge frequentie van TKA's een waardevolle bron voor onderzoek is. Tot de mogelijke experimentele toepassingen behoren genexpressie en histologische analyses. Om het potentieel van primaire menselijke OA-weefsels voor deze onderzoeksbenaderingen en andere te realiseren, worden de volgende belangrijke overwegingen geschetst. Ten eerste is het gebruik van patiëntspecimens onderworpen aan ethische regelgeving en moeten protocollen voldoen aan de goedkeuringen van de Institutional Review Board (IRB)24. Ten tweede creëren de inherente heterogeniteit van menselijke primaire zieke weefsels en de invloed van variabelen zoals leeftijd en geslacht, onder andere, de behoefte aan zorgvuldige patiëntenselectie (d.w.z. toepassing van subsidiabiliteitscriteria) en gegevensinterpretatie. Ten derde kunnen de unieke biologische eigenschappen van verschillende weefsels in het gewricht (bijv. Lage cellulariteit van kraakbeen en meniscus25) uitdagingen opleveren tijdens experimenten (bijvoorbeeld het isoleren van hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA). Dit rapport behandelt deze overwegingen en presenteert een protocol voor patiëntenselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (d.w.z. beoordeling van RNA-zuiverheid en -integriteit; Figuur 3) het gebruik van primaire menselijke artroseweefsels in de onderzoeksgemeenschap aan te moedigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit onderzoeksprotocol werd goedgekeurd en volgde de institutionele richtlijnen van de Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).

1. Selectie van patiënten

  1. Identificeer de patiënten uit degenen die gepland zijn om TKA te ondergaan met een orthopedisch chirurg.
  2. Selecteer de patiënten op basis van de geschiktheidscriteria die zijn gedefinieerd in het onderzoeksprotocol. Voorbeelden van inclusiecriteria zijn 18 jaar of ouder zijn en een bevestigde diagnose van knieartrose hebben. Voorbeelden van uitsluitingscriteria zijn het ondergaan van een gedeeltelijke knieprothese of het hebben van een bevestigde diagnose van reumatoïde artritis.
  3. Neem contact op met de patiënten om geïnformeerde toestemming te verkrijgen voorafgaand aan de operatie.

2. Monsterverwerking (voor RNA)

OPMERKING: Voer alle weefselverwerking uit in een klasse II bioveiligheidskast en volg steriele technieken. Draag altijd geschikte PBM's (nitrilhandschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) bij het verwerken van menselijke monsters. Tijdens TKA worden verschillende botfragmenten geproduceerd, een grote hoeveelheid bot/kraakbeen zal mogelijk beschikbaar zijn voor dissectie. Als gevolg van ziekteprogressie kan articulaire kraakbeendegeneratie ernstiger zijn op sommige botgedeelten, wat kan worden meegenomen in het experimentele ontwerp. Alleen weefsels die elektrocauterie verplicht stellen voor resectie hebben thermische randschade en er wordt een gezamenlijke chirurgische inspanning geleverd om de meeste weefsels met een scalpel te verkrijgen om schade te minimaliseren. Gereseceerde weefsels moeten te allen tijde gehydrateerd worden gehouden met steriel PBS.

  1. Desinfecteer alle werkoppervlakken en apparatuur met 70% ethanol, RNase-ontsmettingsmiddel, DEPC-behandeld water en opnieuw met 70% ethanol. Veeg achtergebleven vloeistof weg met schone, pluisvrije weefsels. Tangen, botsnijders en scalpels worden voorafgaand aan gebruik geautoclaveerd of gedrenkt in 70% ethanol gedurende ten minste 10 minuten. Houd apparatuur ondergedompeld in 70% ethanol wanneer deze niet onmiddellijk wordt gebruikt.
  2. Pre-label ten minste drie cryovialen met de naam van het geïdentificeerde monster en aliquot nummer voor elk weefsel (bijv. TKA-1 Kraakbeen 1).
    1. Identificeer elk weefseltype van het monster op basis van de verschillen in grootte, vorm, kleur en textuur zoals weergegeven en beschreven in figuur 2. Identificeer het kraakbeen(figuur 2A-pijl), bot(figuur 2B-pijl), meniscus(figuur 2C),infrapatellaire vetkussen(figuur 2D),voorste kruisband(figuur 2E),synovium(figuur 2F)en de schuine spier van de vastus medialis (figuur 2G).
  3. Isoleer het gewrichtskraakbeen.
    1. Selecteer een botgedeelte met minimale kraakbeenafbraakafbraak.
    2. Snijd met behulp van een No.10 scalpel zoveel mogelijk door de kraakbeendiepte om de volledige dikte van de kraakbeenlaag te ontleden.
      OPMERKING: Een No.10 scalpel zal alleen kraakbeen binnendringen, niet bot.
    3. Ontleed met behulp van de volledige dikte van het kraakbeen drie blokjes van 5 mm.
  4. Isoleer het subchondrale bot.
    1. Gebruik hetzelfde botgedeelte waaruit kraakbeen is verzameld.
    2. Schraap met behulp van een No.10 scalpel eventueel overgebleven kraakbeen en resterende weefsels van het botoppervlak.
    3. Houd het te snijden botgedeelte vast met een tang en gebruik de botsnijders om drie blokjes van 5 mm te snijden.
  5. Isoleer de meniscus.
    1. Identificeer een relatief onbeschadigd deel van de mediale of laterale meniscus.
    2. Ontleed met behulp van een No.10 scalpel en tang drie blokjes van 5 mm.
  6. Isoleer het infrapatellaire vetkussen.
    1. Snijd met behulp van een no.10 scalpel en een tang het gele deel van het weefsel in drie even grote en homogene porties (elk ~ 500 mg).
  7. Isoleer de voorste kruisband (ACL).
    1. Ontleed met behulp van een No.10 scalpel en tang drie blokjes van 5 mm.
  8. Isoleer het synovium.
    1. Gebruik een No.10 scalpel en tang om het roze cellulaire deel van het membraan zoveel mogelijk te isoleren door vetweefsel weg te schrapen.
    2. Ontleed drie even grote en homogene porties (~ 200 mg elk).
  9. Isoleer de vastus medialis schuine spier (VMO).
    1. Gebruik een No.10 scalpel en tang, verwijder vetweefsel uit het monster, waardoor alleen het rode spierweefsel overblijft.
    2. Ontleed drie blokjes van 5 mm.
      OPMERKING: De initiële grootte van het weefsel beperkt de grootte van de porties.
  10. Spoel de weefselgedeelten af met steriel PBS om eventuele resten of vuil te verwijderen.
  11. Om histologie uit te voeren, fixeert u elk weefselgedeelte zoals beschreven in deel 3.
  12. Om RNA-extractie uit te voeren, snijdt u elk van de drie weefselgedeelten in kleinere stukjes (blokjes van ~ 1-2   mm).
    1. Breng de kleinere stukken over naar een cryoviale, veilige doppen van 2 ml, flash freeze door 30 s ondergedompeld te worden in vloeibare stikstof en breng vervolgens over naar een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag (tot 4 maanden getest in het huidige protocol). Herhaal dit voor alle aliquots van alle weefsels.
    2. Ga verder met weefselhomogenisatie zoals beschreven in deel 4.

3. Monsterverwerking (voor histologie)

LET OP: Formaline is een gevaarlijke chemische stof, alleen te gebruiken in een chemische zuurkast.

  1. Vul voorgelabelde conische buizen van 15 ml met 10% formaline-oplossing.
  2. Breng met behulp van een tang het weefselgedeelte over naar de met formaline gevulde buizen.
  3. Fixeer de weefsels in formaline gedurende 1 week bij kamertemperatuur tijdens het schudden / roeren indien mogelijk.
  4. Gooi na 1 week de formaline weg in de juiste verwijdering van chemisch afval, spoel de weefsels met PBS en breng vervolgens over naar een verse conische buis van 15 ml met 70% ethanol voor langdurige opslag bij 4 °C totdat monsters zijn ingebed voor sectie.
    OPMERKING: Alleen voor bot/ kraakbeen, voer ontkalking als volgt uit.
  5. Gooi na 1 week de formaline weg in de juiste verwijdering van chemisch afval en spoel de weefsels met PBS.
  6. Breng het weefsel over in een conische buis van 50 ml met 45 ml 10% EDTA-oplossing (pH 7,4).
  7. Als schudden/roeren niet mogelijk is, keer de buisjes dan 10-15 keer per dag om.
  8. Gooi de EDTA-oplossing eenmaal per week weg en vervang deze.
    1. Test de textuur tweemaal per week met een instrument (d.w.z. spatel) of gehandschoende vinger om de ontkalking te bevestigen door vervorming te observeren wanneer druk wordt uitgeoefend. De tijd die nodig is om botweefsel te ontkalken varieert tussen monsters van 4-6 weken.
  9. Spoel het weefsel na ontkalking met PBS en breng het over op een verse conische buis van 15 ml met 70% ethanol voor langdurige opslag bij 4 °C totdat monsters zijn ingebed voor sectie.

4. Weefselhomogenisatie

LET OP: Het protocol maakt gebruik van de gevaarlijke chemische stof fenol. Werken met fenol moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.

OPMERKING: Reinig alle te gebruiken apparatuur en oppervlakken grondig met 70% ethanol (minimaal 10 minuten weken), gevolgd door RNase-ontsmettingsmiddel (minimaal 10 minuten weken), afspoelen met met DEPC behandeld water, afvegen met een schone, pluisvrije papieren handdoek en vervolgens overspuiten of weken met 70% ethanol.

  1. Homogenisatie van hard weefsel (gewrichtskraakbeen, subchondraal bot, meniscus)
    1. Koel vóór homogenisatie de vijzel, stamper en spatel met vloeibare stikstof. Deze moeten zo koud mogelijk worden gehouden om te voorkomen dat het monster ontdooit.
    2. Verwerk de monsters één voor één en houd de andere monsters op -80 °C totdat ze zijn gebruikt.
    3. Breng het weefselmonster over in mortel met behulp van een gekoelde spatel; giet extra vloeibare stikstof op het weefsel en laat het verdampen. Plet het weefsel met behulp van de stamper. Voeg herhaaldelijk meer vloeibare stikstof toe aan het weefselmonster, laat het verdampen en ga dan verder met malen met de stamper om een fijn poeder te maken.
    4. Breng na het zoveel mogelijk poederen van het weefsel over op een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      1. Pre-chill buizen door onderdompeling in vloeibare stikstof gedurende 30 s voorafgaand aan weefseloverdracht.
    5. Voeg 1 ml van de zuur-guanidinium-fenoloplossing toe aan elke buis en bewaar deze op ijs.
    6. Herhaal stap 4.1.3-4.1.5 voor elk hard weefselmonster.
    7. Reinig na elk weefsel de vijzel, stamper en spatel met 70% ethanol, RNase-ontsmettingsmiddel, DEPC-behandeld water en een extra week in 70% ethanol. Veeg alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel.
    8. Incubeer de monsters op ijs gedurende nog eens 20 minuten.
  2. Homogenisatie van zacht weefsel (infrapatellaire vetkussen, ACL, synovium, VMO)
    1. Desinfecteer de homogenisator door loopbuizen van 70% ethanol, RNase-ontsmettingsmiddel, DEPC-behandeld water en een extra 70% ethanolwas, elk gedurende 30 s. Veeg alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel. Herhaal dit tussen elk monster.
    2. Pre-label 5 ml ronde bodembuizen voor elk monster. Voeg 1 ml van de zuur-guanidinium-fenoloplossing toe aan elke buis.
      1. Werk aan één monster tegelijk en houd andere monsters die moeten worden verwerkt bij -80 °C tot gebruik.
    3. Breng het weefsel over in een voorgelabelde buis van 5 ml met zuur-guanidinium-fenol.
    4. Homogeniseer de weefsels in 30 s pulsen en blijf op ijs tijdens en tussen pulsen. Herhaal dit totdat het weefsel visueel is opgelost of gedurende maximaal vijf pulsen van 30 s.
      OPMERKING: Sommige vezelige weefsels (d.w.z. spieren) kunnen niet grondig homogeniseren.
    5. Incubeer het opgeloste weefsel op ijs en ga naar het volgende monster.
      1. Reinig de homogenisator zoals beschreven in stap 4.2.1. Zorg ervoor dat weefselbrokken niet in de tanden van de sonde achterblijven; verwijder indien nodig met een steriele tang.
    6. Na homogenisatie van alle monsters, incubeer op ijs in zuur-guanidinium-fenol gedurende nog eens 20 minuten.
    7. Breng de monsters over van ronde bodembuizen naar voorgelabelde en voorgekoelde microcentrifugebuizen van 1,5 ml.

5. RNA-extractie uit weefsels

LET OP: Dit protocol maakt gebruik van gevaarlijke chemicaliën zoals fenol, chloroform en isopropanol. Voer al het werk uit in een chemische zuurkast.

OPMERKING: Apparatuur en reagentia zijn alleen gereserveerd voor RNA-werk en moeten van de juiste chemische kwaliteit zijn voor moleculaire toepassingen (d.w.z. steriel, nucleasevrij). Dit protocol volgt zowel deel 4.1 als 4.2 weefselhomogenisatieprotocollen op. Reinig alle te gebruiken apparatuur en oppervlakken grondig met 70% ethanol (minimaal 10 minuten weken), gevolgd door RNase-ontsmettingsmiddel (minimaal 10 minuten weken). Spoel af met DEPC-behandeld water, veeg de resterende vloeistof af met een schone, pluisvrije papieren handdoek en spuit of week vervolgens met 70% ethanol.

  1. Centrifugeer de microcentrifugebuizen bij 10000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het vuil te pelleteren.
  2. Breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: Voor vetweefsel zal er soms een lipidelaag aanwezig zijn op de bovenkant. Vermijd het overbrengen hiervan door de laag aan de zijkant van de buis te doorboren met een pipetpunt.
  3. Voeg aan elk monster 200 μl chloroform per 1 ml zuur-guanidinium-fenoloplossing toe. Schud de buizen krachtig met de hand gedurende 30 s om te mengen. Incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs.
  4. Centrifugeer monsters bij 10000 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Na het centrifugeren zullen zich drie lagen hebben gevormd: een waterige fase met RNA, een witte DNA-interfase en een roze eiwitfase aan de onderkant.
  5. Breng ~500 μL van de bovenste, waterige fase over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: Verstoor de interfase en de eiwitfracties niet. Bewaar deze fasen bij -80 °C voor toekomstige DNA- of eiwitisolatie.
  6. Voeg een gelijk volume zuur-guanidinium-fenoloplossing toe aan de overgedragen waterige fase, meng door de buis 8-10 keer om te keren. Incubeer de buis op ijs gedurende 20 minuten.
  7. Voeg aan elk monster 200 μl chloroform per 1 ml zuur-guanidinium-fenoloplossing toe. Schud krachtig met de hand gedurende 30 s om te mengen en incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs.
  8. Centrifugeer monsters bij 10000 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C.
  9. Breng <500 μL van de waterige fase over in een verse microcentrifugebuis, waarbij u ervoor zorgt dat het monster niet met de andere fasen wordt verontreinigd.
    LET OP: Gooi de resterende fasen weg met geschikte methoden voor het verwijderen van gevaarlijke materialen.
  10. Voeg aan elk monster een gelijk volume (als waterige fase) van 100% isopropanol toe. Meng door de buis 8-10 keer om te keren. Incubeer op ijs gedurende 5 min.
    1. Voeg 1 μL glycogeencoprecipitant toe aan elk monster om te helpen bij het lokaliseren van de RNA-pellet na centrifugatie.
  11. Centrifugeer de monsters bij 12000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °C.
  12. Zoek de pellet in de buis (als u coprecipitant gebruikt, wordt deze blauw weergegeven). Giet het supernatant voorzichtig af.
  13. Was de pellet door 1 ml ijskoude 75% ethanol toe te voegen aan elk monster, vortex om de pellet van de bodem van de buis los te maken.
    OPMERKING: Bereid 75% ethanol met pure ethanol van moleculaire kwaliteit en nucleasevrij water.
  14. Centrifugeer bij 7000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Giet het supernatant voorzichtig af.
  15. Herhaal stap 5.13 en 5.14 nog twee keer.
  16. Snelle spin (<2000 x g gedurende 5 s) om eventuele resterende vloeistof naar de bodem van de buis te brengen. Gebruik een P20-pipet om eventuele resterende ethanol van de bodem van de buizen te verwijderen.
    1. Vermijd het aanraken van de RNA-pellet met een pipetpunt. Wissel tips tussen monsters.
  17. Met open buisdoppen, luchtdrogen monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Pellet kan doorschijnend worden als het droogt. Ervoor zorgen dat alle resterende ethanol is verdampt, zal de RNA-zuiverheid verbeteren.
  18. Voeg 25 μL nucleasevrij water toe aan elke buis om de pellet op te lossen.
  19. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  20. Pipetteer voorzichtig op en neer om het RNA te mengen.
  21. Aliquot 5 μL van het monster in een verse buis voor kwaliteitscontrole analyse (deel 6). Bewaar de resterende 20 μL bij -80 °C voor genexpressietests.

6. Kwaliteitscontrole

  1. Bepaal de concentratie en zuiverheid van RNA met behulp van een spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Bepaal de RNA-integriteit met behulp van een elektroforese-apparaat volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Verdun het RNA om binnen het bereik van de chipdetectielimieten te liggen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zeven unieke menselijke kniegewrichtweefsels zijn beschikbaar voor verzameling van patiënten die TKA ondergaan voor artrose(figuur 1). In dit protocol werd elk van deze weefsels geïdentificeerd en verwerkt binnen 4 uur na chirurgische verwijdering(figuur 2). Volgens de stappen in figuur 3werden delen van elk weefsel geformaliseerd voor histologische beoordeling(figuur 4),terwijl andere delen werden geflitst voor RNA-isolatie. Door harde weefsels van zachte weefsels te scheiden door middel van desintegratiemethode (respectievelijk verpulvering versus homogenisatie), werd RNA met een hoge integriteit en zuiverheid geëxtraheerd uit elk weefseltype, met representatieve resultaten in tabel 1 (kolommen van hoge kwaliteit). Met name leverden sommige proefpersonen RNA van lagere kwaliteit op over meerdere weefsels(tabel 1,kolommen van lage kwaliteit), wat suggereert dat ondanks een geoptimaliseerde methode externe factoren (bijv. Ernst van de ziekte) de RNA-kwaliteit van weefseltypen kunnen beïnvloeden.

Figure 1
Figuur 1: Schema van het menselijk kniegewricht met een zijdelingse doorsnede. Elk van de zeven gelabelde weefsels wordt verzameld tijdens TKA en gebruikt voor onderzoeksdoeleinden zoals beschreven in dit protocol. VMO = vastus medialis schuine spier. Afbeelding toegankelijk en gewijzigd van OpenStax College onder een creative commons licentie26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve brutobeelden voor elk van de zeven weefsels verkregen van patiënten die TKA ondergaan. (A) Voorste femorale bot gesneden met pijl die wijst naar gewrichtskraakbeen dat moet worden verzameld. Kraakbeen wordt geïdentificeerd door een witachtige laag op het oppervlak van het bot. B) Voorste dijbeen gesneden met pijl die wijst naar subchondraal bot dat moet worden verzameld. (C) Meniscus. Vermijd het verzamelen van verbrande secties veroorzaakt door elektrocauterisatie tijdens TKA. (D) Infrapatellar vetkussen (geel van kleur). (E) Voorste kruisband (wit, vezelig, sponsachtig weefsel). (F) Synovium. De ene kant lijkt lichtgekleurd en vezelig, vaak met vetweefsel, terwijl de andere kant roze en minder vezelig lijkt. De roze kant van het membraan bevat de synoviale voering. (G) Vastus medialis schuine spier (rood). Dit kan vaak het kleinste weefselgedeelte zijn en kan wat vetweefsel bevatten. Schaalbalk = 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Overzicht van de stappen die zijn genomen om primaire menselijke artroseweefsels te verzamelen voor histologie en RNA. Dit protocol beschrijft patiëntselectie, monsterverwerking voor histologie en RNA, weefselhomogenisatie voor harde weefsels en zachte weefsels, RNA-extractie en kwaliteitscontrole voor zeven primaire menselijke knie-OA-weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Histologische secties voor elk van de zeven weefsels verkregen van patiënten die TKA ondergaan. Hematoxyline en eosine-gekleurde secties worden weergegeven met 6x vergroting in panelen A-F met inzet vergroot tot 40x in panelen A '-F' en A ". (A, A') Gewrichtskraakbeen; (A, A ") subchondraal bot; (B, B ') meniscus; (C, C ') infrapatellaire vetkussen; (D, D ') voorste kruisband; (E, E') synovium; (F, F') vastus medialis schuine spier. Schaalbalken = 400 μm voor A-F en 50 μm voor A'-F' en A". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Weefsel N RIN [RNA] (ng/μL) in 25 μL A260:A280 A260:A230
Hoge kwaliteit Lage kwaliteit Hoge kwaliteit Lage kwaliteit Hoge kwaliteit Lage kwaliteit Hoge kwaliteit Lage kwaliteit Hoge kwaliteit Lage kwaliteit
"Harde weefsels"
Gewrichtskraakbeen 10 4 7,0 ± 0,8 1,3 ± 1,2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1,80 ± 0,09 1,47 ± 0,34 1,40 ± 0,36 0,45 ± 0,26
Subchondraal bot 10 4 7,8 ± 0,6 3,6 ± 1,1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1,96 ± 0,05 1,90 ± 0,17 1,72 ± 0,27 1,12 ± 0,62
Meniscus 10 4 7,5 ± 0,6 2,4 ± 0,3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1,91 ± 0,05 1,71 ± 0,15 1,41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
"Zachte weefsels"
Infrapatellaire Fat Pad 10 3 8,5 ± 0,6 6,1 ± 1,4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1,99 ± 0,01 2,02 ± 0,03 2,09 ± 0,17 1,47 ± 0,71
Voorste kruisband 8 3 7,4 ± 0,4 5,2 ± 1,9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1,97 ± 0,03 1,91 ± 0,18 1,88 ± 0,20 1,35 ± 0,70
Synovium 9 3 8,5 ± 0,6 6,2 ± 3,1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1,99 ± 0,04 2,00 ± 0,03 2,05 ± 0,11 1,91 ± 0,20
Vastus Medialis Schuin 9 3 8,5 ± 0,6 8,4 ± 0,7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1,96 ± 0,03 1,99 ± 0,03 1,82 ± 0,11 1,62 ± 0,27

Tabel 1. Kwaliteit en kwantiteit van RNA geïsoleerd uit OA-weefsels verzameld bij TKA-patiënten. RIN = RNA-integriteitsnummer. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie voor RIN, A260:A280 en A260:A230 verhoudingen, en gemiddelde (bereik) voor RNA-concentratiewaarden. Hoogwaardige monsters bestaan uit patiënten waarvan alle weefseltypen RNA met RIN-> 6 (n = 8-10) opleverden. Monsters van lage kwaliteit bestaan uit patiënten van wie meerdere weefseltypen RNA met RIN-< 6 (n = 3-4) opleverden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het gepresenteerde protocol is succesvol gebleken voor het verzamelen van zeven primaire menselijke OA-weefsels voorRNA-extractie( tabel 1 ) en histologische verwerking (figuur 4). Voorafgaand aan het verzamelen van patiëntmonsters, is het noodzakelijk om een IRB-goedgekeurd protocol op te stellen, idealiter in samenwerking met een chirurg of chirurgisch team. Het toepassen van een gestandaardiseerd protocol voor het verzamelen van monsters (bijv. Resectie van consistente in situ locaties) is essentieel voor het maximaliseren van experimentele reproduceerbaarheid. Weefselmonsters moeten in steriele containers naar het laboratorium worden vervoerd en binnen 4 uur na de operatie worden verwerkt om degradatie te voorkomen. Tijdens weefseldissectie en -verwerking worden alle weefsels gehydrateerd gehouden in steriel PBS en worden ze gespoeld in verse, steriele PBS om potentiële oppervlakteverontreinigingen zoals biovloeistoffen en ander ongewenst vuil te verwijderen voordat ze worden ingevroren voor RNA-extractie of formaline-gefixeerd voor histologie. Een nuttige toepassing van histologische analyse is de bevestiging van de weefseltypen en de ernst van de ziekte, omdat deze kunnen worden onderscheiden door celnummer, distributie en morfologie, naast andere factoren die waarneembaar zijn door standaardvlekken zoals hematoxyline en eosine (figuur 4).

Primaire menselijke OA-weefsels kunnen uitdagingen vormen voor het extraheren van RNA van voldoende kwantiteit en kwaliteit, zoals gedefinieerd door zuiverheid en integriteit27. RNA-hoeveelheid is een functie van de algehele cellulariteit van het weefsel, en in het kniegewricht zijn er laagcellige, hoog-matrix weefsels zoals het kraakbeen, bot en meniscus, en relatief hoogcellige, laag-matrix weefsels zoals het vetkussen, ACL, synovium en VMO. Bijvoorbeeld, zowel gewrichtshyaline kraakbeen als meniscus fibrokraakbeen28 worden gekenmerkt door een lage cellulariteit, waarbij de extracellulaire matrix verschillende hoeveelheden collageen, proteoglycanen en andere glycoproteïnen bevat28,29. Het hebben van minder cellen resulteert in minder RNA per volume weefsel (vermindering van de hoeveelheid) en het hebben van meer eiwit resulteert in co-zuivering met RNA (vermindering van de zuiverheid)25,30. RNA-zuiverheid kan worden bepaald door spectrofotometrie waarbij A260:A280 en A260:A230-waarden van <1,5 de aanwezigheid van organische verontreinigingen (bijv. Eiwit) weerspiegelen en waarden van ~ 2,0 zuiver RNA31weerspiegelen. RNA-integriteit weerspiegelt het niveau van degradatie, hetzij veroorzaakt door experimentele omstandigheden (d.w.z. schuifkrachten) of door enzymatische spijsvertering (bijv. Nucleasen), en wordt vaak bepaald door elektroforetische analyse. Een RNA-integriteitsgetal (RIN) van 1 weerspiegelt gedegradeerd RNA en een RIN van 10 weerspiegelt intact RNA31,32. Voor RNA-sequencing wordt vaak een minimale RIN van 7 aanbevolen33,34,35. Uit de gegevens in tabel 1 blijkt dat aan deze A260:A280, A260:A230en RIN-drempels werd voldaan in alle weefsels van de patiëntmonsters in de RNA-groep van hoge kwaliteit in vergelijking met patiëntenmonsters in de RNA-groep van lage kwaliteit, met uitzondering van sommige A260:A230 waarden, die eiwitverontreiniging van RNA in de laagcellige, hoogmatrixweefsels kunnen weerspiegelen. Hoewel er veel factoren zijn die kunnen bijdragen aan de kwaliteit van RNA geïsoleerd uit een bepaald patiëntmonster, kan onder hen het niveau van ernst van de ziekte zijn. De zieke aard van OA-weefsels suggereert dat degradatieve processen plaatsvinden door verhoogde niveaus van enzymen die weefsels kunnen verteren, maar ook RNA, waardoor de kwaliteit wordt verminderd.

Dit protocol voor RNA-extractie heeft tot doel de kwantiteit en kwaliteit van RNA uit primaire menselijke OA-weefsels te maximaliseren. De meest kritische stap had betrekking op de vraag of de weefsels werden gedesintegreerd door verpulvering of homogenisatie, en dit bleek te correleren met de weefselcelluliteit en matrixsamenstelling. Aanvankelijk werden alle zeven weefsels onderworpen aan hetzelfde protocol waarbij weefsels eerst werden verpulverd door mortel en stamper met behulp van vloeibare stikstof, vervolgens werden overgebracht naar zuur-guanidinium-fenoloplossing en verder werden gehomogeniseerd met behulp van een draagbare weefselhomogenisator. Deze methode produceerde een gunstige RNA-opbrengst, zuiverheid en integriteit voor het vetkussen, ACL, synovium en VMO (collectief zachte weefsels; ook relatief hoogcellig, laagmatrix), maar ongunstige resultaten voor kraakbeen, bot en meniscus (collectief harde weefsels; ook laagcellig, hoogmatrix). Op basis van deze waarnemingen werden de zeven weefsels in twee groepen verdeeld voor verdere protocolverfijning. Er werd waargenomen dat de extra homogenisatie een minimaal effect had op het verder desintegreren van de harde weefsels nadat ze waren verpulverd tot een fijn poeder. Omgekeerd werd dissociatie van de zachte weefsels met succes bereikt met homogenisatie alleen en vereiste geen verpulvering. Daarom werd de homogenisatie van de harde weefsels en verpulvering van de zachte weefsels geëlimineerd. Dit was gunstig voor het minimaliseren van schuifkrachten, verwerkingstijd en temperatuurschommelingen, die allemaal de RNA-integriteit kunnen verbeteren. Twee rondes van fenol / chloroform fasescheiding voor alle zeven weefsels werden uitgevoerd, omdat dit de RNA-zuiverheid heeft verbeterd zonder de opbrengst te verminderen31.

Een mogelijke beperking van dit protocol is het batcheffect dat kan voortvloeien uit het scheiden van de weefsels in twee groepen als het experimentele ontwerp vergelijking tussen alle weefsels vereist. Het gebruik van verpulverings- versus homogenisatiemethoden kan technische (bijv. verwerkingstijd) en omgevingscondities (bijv. temperatuurschommelingen) veranderen die variabiliteit kunnen introduceren36. Een tweede beperking is de mogelijke inconsistentie in het identificeren, ontleden en oriënteren (voor histologische sectie) van de weefsels binnen en tussen proefpersonen. Een derde beperking is ons onvermogen om potentiële correlaties tussen de ernst van de ziekte van de patiënt en de RNA-kwaliteit in het huidige rapport te bevestigen. Een vierde beperking is het gebrek aan beschikbaarheid van gezonde controleweefsels ter vergelijking. Hoewel controlemonsters beschikbaar kunnen zijn van kadavers, zijn deze minder gemakkelijk beschikbaar dan OA-weefsels van TKA. Een experimentele strategie om dit te omzeilen is om elk onderwerp als hun eigen controle te gebruiken, of het nu gaat om het maken van vergelijkingen tussen weefsels of binnen weefsels die de behandeling vergelijken met controle of laesie aan geconserveerde gebieden. Ten slotte staat het gebruik van weefselexplantaten voor RNA-extractie geen genexpressieanalyse toe van de individuele celtypen waaruit de weefsels bestaan (bijv. Synoviale fibroblasten versus synoviale macrofagen37).

Ondanks de opgemerkte beperkingen zijn primaire menselijke OA-weefsels een waardevolle bron voor onderzoek en bieden ze voordelen ten opzichte van andere experimentele systemen voor OA, waaronder het behoud van de celniche23. Primaire menselijke artroseweefsels kunnen echter onderbenut worden in onderzoek als gevolg van logistieke of technische uitdagingen. Dit protocol beschrijft patiëntselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole ter ondersteuning van het gebruik van de monsters verkregen uit TKA. Na monsterverwerking kunnen verschillende experimentele benaderingen worden gevolgd, waaronder genexpressie en histologie. Het meest relevant voor het snel evoluerende omics-veld is het vermogen om voldoende hoeveelheden hoogwaardig RNA te isoleren voor toepassingen zoals RNA-sequencing38,39. Moleculaire profielen kunnen worden vergeleken in en tussen weefsels van proefpersonen met specifieke ziektefenotypen (bijvoorbeeld op basis van leeftijd, geslacht en andere OA-risicofactoren). Verkregen inzichten kunnen nieuwe therapeutische wegen informeren die gemakkelijker kunnen worden vertaald naar de OA-patiëntenpopulatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgments

De auteurs bedanken de studiedeelnemers die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt en dragen dit rapport op aan nieuwe wetenschappers op het gebied van artrose.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Tags

Biologie Nummer 173
Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter