Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

רקמות ראשוניות המתקבלות מחולים בעקבות ארתרופלסטיקה כוללת בברך מספקות מודל ניסיוני למחקר דלקת מפרקים ניוונית עם תרגום קליני מקסימלי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לזהות, לעבד ולבודד RNA משבע רקמות ברכיים ייחודיות כדי לתמוך בחקירה מכנית בדלקת מפרקים ניוונית אנושית.

Abstract

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלת מפרקים כרונית וניוונית המשפיעה לרוב על הברך. מכיוון שאין כרגע תרופה, ארתרופלסטיקה מוחלטת בברך (TKA) היא התערבות כירורגית נפוצה. ניסויים באמצעות רקמות OA אנושיות ראשוניות המתקבלות מ- TKA מספקים את היכולת לחקור מנגנוני מחלה ex vivo. בעוד OA נחשב בעבר להשפיע בעיקר על הסחוס, זה ידוע עכשיו להשפיע על רקמות מרובות במפרק. פרוטוקול זה מתאר בחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (המבוססת על טוהר RNA, שלמות ותשואה) מכל אחת משבע רקמות ייחודיות לתמיכה בחקירת מנגנון המחלה במפרק הברך. בהסכמה מדעת, התקבלו דגימות מחולים שעברו TKA עבור OA. רקמות נותחו, נשטפו ואוחסנו תוך 4 שעות מהניתוח על ידי הקפאת הבזק עבור RNA או קיבעון פורמלין להצטולוגיה. רקמות שנאספו כללו סחוס מפרקי, עצם תת-כונדרלית, מניסקוס, כרית שומן אינפר-פטלר, רצועה צולבת, סינוביום ושריר האלכסוני vastus medialis. פרוטוקולי מיצוי RNA נבדקו עבור כל סוג רקמה. השינוי המשמעותי ביותר כלל את שיטת ההתפוררות המשמשת לרקמות קשות בעלות תאים נמוכים, גבוהים, (הנחשבים לסחוס, עצם ומניסקוס) לעומת תאים גבוהים יחסית, מטריצה נמוכה, רקמות רכות (נחשבות כרית שומן, רצועה, סינוביום ושרירים). נמצא כי ריכוך היה מתאים לרקמות קשות, והומוגניזציה מתאימה לרקמות רכות. נצפתה נטייה של נבדקים מסוימים להניב ערכי שלמות RNA גבוהים יותר (RIN) מאשר נבדקים אחרים באופן עקבי על פני רקמות מרובות, דבר המצביע על כך שגורמים הבסיסיים כגון חומרת המחלה עשויים להשפיע על איכות ה- RNA. היכולת לבודד RNA באיכות גבוהה מרקמות OA אנושיות ראשוניות מספקת מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לניסויי ביטוי גנים מתוחכמים, כולל רצף, שיכול להוביל לתובנות קליניות שתורגמו בקלות רבה יותר לחולים.

Introduction

הברך היא המפרק הסינוביאלי הגדול ביותר בגוף האדם, הכולל את מפרק הטיביו-דימורל בין השוקה לירך ומפרק הפטלו-מורל בין פיקת הברך לירך1. העצמות בברך מרופדים בסחוס מפרקי ונתמכות על ידי רקמות חיבור שונות, כולל מנישי, שומן, רצועות ושרירים, וממברנה סינוביאלית מתמצתת את כל המפרק כדי ליצור חלל מלא נוזלים סינוביאלי1,2,3 ( איור1). ברך בריאה מתפקדת כמפרק ציר נייד המאפשר תנועה ללא חיכוך במישור הקדמי1,3. בתנאים פתולוגיים, התנועה יכולה להיות מוגבלת וכואבת. מחלת מפרק הברך הניוונית הנפוצה ביותר היא דלקת מפרקים ניוונית (OA)4. מגוון גורמי סיכון ידועים נטייה להתפתחות OA, כולל גיל מבוגר יותר, השמנת יתר, מין נשי, טראומה משותפת, וגנטיקה, בין היתר5,6. ישנם כיום כ -14 מיליון אנשים בארה"ב עם OA ברך סימפטומטי, עם השכיחות גדלה עקב עלייה בגיל האוכלוסייה ושיעורי השמנת יתר7,8. בתחילה נחשב למחלה של הסחוס, OA הוא עכשיו הבין כמחלה של המפרק כולו9. שינויים פתולוגיים שנצפו בדרך כלל ב- OA כוללים שחיקת סחוס מפרקי, היווצרות אוסטאופית, עיבוי עצם תת-ביתית ודלקת של הסינוביום9,10. מאז אין תרופה ידועה עבור OA, טיפולים מתמקדים בעיקר סימפטום (למשל, כאב) ניהול11,12, ולאחר OA התקדם לשלב הסופי, ניתוח החלפת מפרקים הוא ציין לעתים קרובות13.

ניתוחי החלפת מפרקים יכולים להיות חלקיים או כוללים של החלפת ברך, עם ארתרופלסטיקה כוללת בברך (TKA) כולל החלפת כל הניסוח הטיביו-מורלי והמפרק הפטלו-מורלי. נכון לשנת 2020, כמיליון TKAs מבוצעים בארה"ב מדי שנה14. במהלך TKA, מנתח אורטופדי חוצה את החלק העליון של רמת הטיבי ואת חמצת הירך התחתונה (איור 2A, 2B) כדי להיות מצויד בשתלים תותבים. לפעמים לא לפרש על ידי חולים, ב TKA, רק 8-10 מ"מ נפלט מקצה כל עצם, אשר לאחר מכן כתרים או צף מחדש, עם מתכת. אניה פוליאתילנית משולבת יוצרת את משטח הנושא (כלומר, ריפוד) בין שני שתלי המתכת. בנוסף, מספר רכיבי רקמות רכות של המפרק הם excised באופן מלא או חלקי כדי להשיג איזון משותף נכון. בין הרקמות הללו ניתן למנות המנישי המהודל והקטנוני (איור 2C), כרית שומן אינפרא-פטלרית (איור 2D), רצועה צולבת חיצונית (ACL; איור 2E, סינוביום (איור 2F) ושריר האלמוני של vastus medialis (VMO; איור 2G) 15.למרות TKAs הם בדרך כלל מוצלחים לטיפול OA, סביב 20% מהחולים מדווחים על reoccurrence של כאב לאחר הניתוח16. יחד עם העלות הגבוהה והפולשניות היחסית של ההליך, מגבלות אלה מצביעות על הצורך במחקר נוסף כדי לזהות טיפולים חלופיים כדי למתן את התקדמות OA.

כדי לחקור מנגנוני מחלה ב- OA שעשויים להציג אפיקים חדשים להתערבות טיפולית, ניתן להשתמש במערכות ניסיוניות, כולל תאים, מגרשי רקמות ומודלים של בעלי חיים. תאים הם בדרך כלל מתורבתים monolayer נגזרים רקמות האדם או בעלי החיים העיקריים (למשל, chondrocytes מבודד סחוס) או תאים מונצחים (למשל, ATDC517 ו- CHON-00118). בעוד תאים יכולים להיות שימושיים למניפולציה משתנים ניסיוניים בסביבת תרבות מבוקרת, הם אינם ללכוד את התנאים של המפרק הטבעי אשר ידועים להשפיע פנוטיפים התא19. כדי לשחזר טוב יותר את המפל המורכב של תקשורת כימית, מכנית ותא לתא שבבסיס OA, חלופה נמצאת בדגימות ראשוניות של רקמת אדם או בעלי חיים, בין אם נעשה שימוש ב- ex vivo טרי או מתורבת כאקספלנטים, כדי לשמר את מבנה הרקמות ואת microenvironment התא20. על מנת ללמוד את המפרק ב vivo, קטן (למשל, עכבר21)וגדול (למשל, סוס22) מודלים בעלי חיים עבור OA (למשל, באמצעות אינדוקציה כירורגית, שינוי גנטי, או הזדקנות) הם גם שימושיים. עם זאת, תרגום מודלים אלה למחלות אנושיות יכול להיות מוגבל על ידי הבדלים אנטומיים, פיזיולוגיים ומטבוליים, בין היתר23. בהתחשב ביתרונות ובחסרונות של מערכות ניסיוניות, נקודות החוזק העיקריות של היותן ספציפיות למינים ושמירה על הנישה החוץ-תאית המוצעת על ידי רקמות OA האנושיות העיקריות ממקסמות את הפוטנציאל התרגומי של ממצאי המחקר.

רקמות OA אנושיות ראשוניות ניתן להשיג בקלות בעקבות TKA, מה שהופך את התדירות הגבוהה של TKAs משאב בעל ערך למחקר. בין היישומים הניסיוניים הפוטנציאליים הם ביטוי גנים וניתוחים היסתולוגיים. כדי לממש את הפוטנציאל של רקמות OA אנושיות ראשוניות עבור גישות מחקר אלה ואחרים, המתוארים הם השיקולים העיקריים הבאים. ראשית, השימוש בדגימות מטופלים כפוף לרגולציה אתית, והפרוטוקולים חייבים לעמוד באישורי ועדת הביקורת המוסדית (IRB)24. שנית, ההטרוגניות הטבועה של רקמות החולים העיקריות האנושיות והשפעת משתנים כגון גיל ומין, בין היתר, יוצרות את הצורך בבחירת מטופלים זהירה (כלומר, יישום קריטריוני זכאות) ופרשנות נתונים. שלישית, התכונות הביולוגיות הייחודיות של רקמות שונות במפרק (למשל, תאיות נמוכה של סחוס ומניסקוס25) יכולות להציג אתגרים במהלך ניסויים (למשל, בידוד איכות גבוהה וכמות של RNA). דוח זה מתייחס לשיקולים אלה ומציג פרוטוקול לבחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות (כלומר, הערכת טוהר ושלמות ה-RNA; איור 3) כדי לעודד את השימוש ברקמות OA האנושיות העיקריות בקהילת המחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול מחקר זה אושר ופעל על פי הנחיות מוסדיות שנקבעו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית של מערכת הבריאות הנרי פורד (IRB #13995).

1. בחירת מטופל

  1. זהה את המטופלים מקרב אלה המתוכננים לעבור TKA עם מנתח אורטופדי.
  2. בחר את המטופלים על סמך קריטריוני הזכאות שהוגדרו על ידי פרוטוקול המחקר. דוגמאות לקריטריונים של הכללה כוללות להיות בן 18 ומעלה ויש אבחנה מאושרת של דלקת מפרקים ניוונית בברך. דוגמאות לקריטריוני אי-הכללה כוללות החלפת ברך חלקית או אבחנה מאושרת של דלקת מפרקים שגרונית.
  3. צרו קשר עם המטופלים לקבלת הסכמה מדעת לפני הניתוח.

2. עיבוד לדוגמה (עבור RNA)

הערה: בצע את כל עיבוד הרקמות בארון בטיחות ביולוגית מסוג II ובצע טכניקות סטריליות. תמיד ללבוש PPE מתאים (כפפות ניטריל, חלוק מעבדה, משקפי בטיחות) בעת עיבוד דגימות אנושיות. מספר שברי עצם מיוצרים במהלך TKA, כמות גדולה של עצם / סחוס יהיה זמין פוטנציאלי עבור דיסקציה. בשל התקדמות המחלה, ניוון סחוס מפרקי עשוי להיות חמור יותר על חלקים עצם מסוימים, אשר ניתן לקחת בחשבון לתוך עיצוב ניסיוני. רק רקמות המחייבות electrocautery לפירוק יש נזק קצה תרמי, ומאמץ כירורגי מרוכז נעשה כדי להשיג את רוב הרקמות עם אזמל כדי למזער את הנזק. רקמות שנקטפו חייב להישמר hydrated בכל עת עם PBS סטרילי.

  1. לחטא את כל משטחי העבודה והציוד עם 70% אתנול, מחטא RNase, מים שטופלו DEPC, ושוב עם 70% אתנול. יש לנגב את שאריות הנוזל עם רקמות נקיות ותן מוך. מלקחיים, חותכי עצמות ואזמלים הם autoclaved או ספוג 70% אתנול לפחות 10 דקות לפני השימוש. שמור על הציוד שקוע ב 70% אתנול כאשר לא בשימוש מיידי.
  2. קדם-תווית לפחות שלושה cryovials עם שם מדגם דה מזוהה ומספר aliquot עבור כל רקמה (למשל, TKA-1 סחוס 1).
    1. זהה כל סוג רקמה מהדגימה בהתבסס על ההבדלים בגודל, בצורה, בצבע ובמרקם כפי שמוצג ומתואר באיור 2. זהה את הסחוס (חץ איור 2A), עצם (חץ איור 2B), מניסקוס (איור 2C), כרית שומן אינפרא-פטלר(איור 2D),רצועה צולבת חיצונית (איור 2E), סינוביום (איור 2F), ואת השריר האלכסוני של המתיי vastus(איור 2G).
  3. לבודד את הסחוס המפרקי.
    1. בחר חלק עצם עם השפלת סחוס מינימלית.
    2. באמצעות אזמל מס '10, לחתוך דרך עומק הסחוס ככל האפשר כדי לנתח את העובי המלא של שכבת הסחוס.
      הערה: אזמל מס '10 יחדור רק סחוס, לא עצם.
    3. באמצעות העובי המלא של הסחוס, לנתח שלוש קוביות 5 מ"מ.
  4. לבודד את העצם התת-ביתית.
    1. השתמש באותו קטע עצם שממנו נאסף הסחוס.
    2. באמצעות אזמל מס '10, לגרד את כל הסחוס הנותרים ורקמות שיורית מפני העצם.
    3. החזק את חלק העצם לחתוך עם מלקחיים ולהשתמש חותכי העצם לחתוך שלוש קוביות 5 מ"מ.
  5. לבודד את המניסקוס.
    1. זהה חלק יחסית לא ניזוק של המניסקוס המתיווך או הצדדי.
    2. בעזרת אזמל מס' 10 ומלקחיים, ניתחו שלוש קוביות 5 מ"מ.
  6. לבודד את כרית השומן התשתיתית.
    1. באמצעות אזמל מס '10 ומלקחיים, לחתוך את החלק הצהוב של הרקמה לשלוש מנות בגודל שווה הומוגני (~ 500 מ"ג כל אחד).
  7. לבודד את הרצועה הצולבת הנעה (ACL).
    1. בעזרת אזמל מס' 10 ומלקחיים, ניתחו שלוש קוביות 5 מ"מ.
  8. לבודד את הסינוביום.
    1. באמצעות אזמל מס '10 ומלקחיים, לבודד את החלק התאי הוורוד של הממברנה ככל האפשר על ידי גירוד רקמת שומן משם.
    2. לנתח שלוש מנות בגודל שווה הומוגני (~ 200 מ"ג כל אחד).
  9. לבודד את השריר האלפי המהולל vastus medialis (VMO).
    1. באמצעות אזמל מס '10 מלקחיים, להסיר כל רקמת שומן מן הדגימה, משאיר רק את רקמת השריר האדום.
    2. לנתח שלוש קוביות 5 מ"מ.
      הערה: הגודל ההתחלתי של הרקמה מגביל את גודל המנות.
  10. לשטוף את חלקי הרקמה עם PBS סטרילי כדי להסיר כל שאריות או פסולת.
  11. כדי לבצע היסתולוגיה, לתקן כל חלק רקמה כמתואר בחלק 3.
  12. כדי לבצע מיצוי RNA, לחתוך כל אחד משלוש מנות הרקמה לחתיכות קטנות יותר (~ 1-2 מ"מ   קוביות).
    1. מעבירים את החלקים הקטנים יותר למקפיא 2 מ"ל, כובעים מאובטחים בחוזקה, קופאים על ידי טביעה בחנקן נוזלי למשך 30 מעלות, ולאחר מכן מעבירים למקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך (עד 4 חודשים שנבדקו בפרוטוקול הנוכחי). חזור על זה עבור כל aliquots של כל הרקמות.
    2. המשך להומוגניזציה של רקמות כמתואר בחלק 4.

3. עיבוד לדוגמה (להיסתולוגיה)

זהירות: פורמלין הוא חומר כימי מסוכן, לשימוש רק במכסה אדים כימי.

  1. מלא צינורות חרוטים עם תווית מראש של 15 מ"ל עם פתרון פורמלין 10%.
  2. באמצעות מלקחיים, להעביר את סעיף הרקמה לצינורות מלאים פורמלין.
  3. לתקן את הרקמות פורמלין במשך שבוע אחד בטמפרטורת החדר תוך רועד / מתסיס במידת האפשר.
  4. לאחר שבוע אחד, להשליך את הפורמלין לסילוק פסולת כימית נכונה, לשטוף את הרקמות עם PBS, ולאחר מכן להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל טרי המכיל 70% אתנול לאחסון לטווח ארוך ב 4 °C (4 °F) עד דגימות מוטבעים לחתך.
    הערה: עבור עצם / סחוס בלבד, לבצע הסתיידות כדלקמן.
  5. לאחר שבוע אחד, להשליך את הפורמלין לסילוק פסולת כימית נכונה, ולשטוף את הרקמות עם PBS.
  6. העבר את הרקמה לצינור חרוטי 50 מ"ל עם 45 מ"ל של פתרון EDTA 10% (pH 7.4).
  7. אם רועד / עצבנות אינו אפשרי, הפוך את הצינורות 10-15 פעמים פעם ביום.
  8. יש להשליך ולהחליף את פתרון EDTA פעם בשבוע.
    1. פעמיים בשבוע, לבדוק את המרקם עם מכשיר (כלומר, מרית) או אצבע כפפות כדי לאשר הסתיידות על ידי התבוננות עיוות כאשר מופעל לחץ. הזמן הנדרש כדי decalcify רקמת העצם ישתנה בין דגימות בין 4-6 שבועות.
  9. לאחר הסתיידות, לשטוף את הרקמה עם PBS ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל טרי המכיל 70% אתנול לאחסון לטווח ארוך ב 4 °C (7 °F) עד דגימות מוטבעים לחתך.

4. הומוגניזציה של רקמות

זהירות: הפרוטוקול משתמש פנול כימי מסוכן. עבודה עם פנול חייב להתבצע במכסה אדים כימי.

הערה: לנקות ביסודיות את כל הציוד והמשטחים לשימוש עם 70% אתנול (להשרות במשך מינימום של 10 דקות), ואחריו RNase decontaminant (להשרות במשך מינימום של 10 דקות), לשטוף עם מים שטופלו DEPC, לנגב עם מגבת נייר נקי, מוך, ולאחר מכן respray או להשרות עם 70% אתנול.

  1. הומוגניזציה של רקמות קשות (סחוס מפרקי, עצם תת-כיונדרית, מניסקוס)
    1. לפני ההומוגניזציה, מצננים את המרגמה, המזגן והמ מרית באמצעות חנקן נוזלי. אלה חייבים להישמר קר ככל האפשר כדי למנוע הפשרת מדגם.
    2. לעבד את הדגימות אחד בכל פעם, שמירה על הדגימות האחרות ב -80 °C (80 °F) עד לשימוש.
    3. להעביר את דגימת הרקמה מרגמה באמצעות מרית מצוננת; לשפוך חנקן נוזלי נוסף על גבי הרקמה ולאפשר לו להתאדות. לרסק את הרקמה באמצעות עלה. מוסיפים שוב ושוב עוד חנקן נוזלי לדגימת הרקמה, מאפשרים לו להתאדות, ואז ממשיכים לטחון עם עלה כדי ליצור אבקה דקה.
    4. לאחר אבקת הרקמה ככל האפשר, להעביר לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל צונן מראש.
      1. צינורות טרום צמרמורת על ידי שקוע בחנקן נוזלי במשך 30 s לפני העברת רקמות.
    5. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל צינור ולשמור אותו על קרח.
    6. חזור על שלבים 4.1.3-4.1.5 עבור כל דגימת רקמה קשה.
    7. לאחר כל רקמה, נקו את המרגמה, העלי והמריבית עם 70% אתנול, מחטא RNase, מים שטופלו ב-DEPC, וטבילה נוספת ב-70% אתנול. יש לנגב כל שאריות נוזל עם רקמה נקייה וניתנת מוך.
    8. לדגור את הדגימות על קרח במשך 20 דקות נוספות.
  2. הומוגניזציה של רקמות רכות (כרית שומן אינפרא-פטלר, ACL, סינוביום, VMO)
    1. לחטא את homogenizer על ידי צינורות פועלים של 70% אתנול, RNase decontaminant, DEPC טיפול במים, ו 70% נוסף לשטוף אתנול, כל אחד עבור 30 s. יש לנגב כל שאריות נוזל עם רקמה נקייה וניתנת מוך. חזור על כך בין כל דגימה.
    2. מראש תווית 5 mL צינורות תחתון עגול עבור כל מדגם. הוסף 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל צינור.
      1. עבודה על מדגם אחד בכל פעם, שמירה על דגימות אחרות להיות מעובד ב -80 °C (80 °F) עד השימוש.
    3. להעביר את הרקמה לצינור 5 mL שכותרתו מראש עם חומצה-guanidinium-פנול.
    4. הומוגניזציה הרקמות בפולסים של 30, שמירה על קרח במהלך ובין פולסים. יש לחזור על הפעולה עד שהרקמה מומסת חזותית או לכל היותר חמישה פולסים של 30 שניות.
      הערה: כמה רקמות סיביות (כלומר, שרירים) לא יכול להיות הומוגני לחלוטין.
    5. לדגור את הרקמה המומסת על הקרח ולעבור לדגימה הבאה.
      1. נקה את ההומוגניזר כמתואר בשלב 4.2.1. ודא גושי רקמה לא נשארים בשיניים של הבדיקה; להסיר עם מלקחיים סטריליים במידת הצורך.
    6. לאחר הומוגניזציה של כל הדגימות, דגירה על קרח חומצה-guanidinium-פנול במשך 20 דקות נוספות.
    7. העבר את הדגימות מצינורות תחתון עגולים לצינורות מיקרוצנטריפוגה עם תווית מראש ומצוננת מראש של 1.5 מ"ל.

5. מיצוי RNA מרקמות

אזהרה: פרוטוקול זה משתמש כימיקלים מסוכנים כגון פנול, כלורופורם, איזופרופנול. בצע את כל העבודה במכסה אדים כימי.

הערה: ציוד וריאגנטים שמורים לעבודת RNA בלבד וחייבים להיות בעלי ציון כימי מתאים ליישומים מולקולריים (כלומר, סטריליים, ללא נוקלאז). פרוטוקול זה מצליח הן חלקים 4.1 ו 4.2 פרוטוקולים הומוגניזציה של רקמות. לנקות ביסודיות את כל הציוד והמשטחים לשמש עם 70% אתנול (להשרות במשך מינימום של 10 דקות), ואחריו RNase decontaminant (להשרות במשך מינימום של 10 דקות). יש לשטוף במים שטופלו ב-DEPC, לנגב את שאריות הנוזל במגבת נייר נקייה וניתנת מוך, ולאחר מכן להספיג או להשרות עם 70% אתנול.

  1. צנטריפוגה צינורות microcentrifuge ב 10000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (75 °F) כדי גלולה את הפסולת.
  2. מעבירים את הסופר-נט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל.
    הערה: עבור רקמות שומן, שכבת שומנים תהיה לפעמים נוכחת בחלק העליון. הימנע העברת זה על ידי פירסינג השכבה בצד הצינור עם קצה pipette.
  3. הוסף 200 μL של כלורופורם לכל 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל מדגם. לנער את הצינורות במרץ ביד במשך 30 s לערבב. לאחר מכן, דגירה על קרח במשך 2 דקות.
  4. דגימות צנטריפוגות ב 10000 x g במשך 12 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: לאחר צנטריפוגה, שלוש שכבות ייווצרו: שלב מימי המכיל RNA, interphase DNA לבן, ושלב חלבון ורוד בתחתית.
  5. העבר ~ 500 μL של השלב העליון, מימית לצינור microcentrifuge טרי 1.5 מ"ל.
    הערה: אין להפריע לאינטרפאזה ולשברירי החלבון. לאחסן שלבים אלה ב -80 °C (80 °F) לבידוד DNA או חלבון עתידי.
  6. הוסף נפח שווה של חומצה-guanidinium-פנול פתרון לשלב מימי מועבר, לערבב על ידי היפוך הצינור 8-10 פעמים. לדגור על הצינור על קרח במשך 20 דקות.
  7. הוסף 200 μL של כלורופורם לכל 1 מ"ל של תמיסת חומצה-guanidinium-פנול לכל מדגם. לנער במרץ ביד במשך 30 s לערבב ולאחר מכן לדגור על קרח במשך 2 דקות.
  8. דגימות צנטריפוגות ב 10000 x g במשך 12 דקות ב 4 °C (70 °F).
  9. העבר <500 μL של השלב מימית צינור microcentrifuge טרי, זהיר לא לזהם את המדגם עם השלבים האחרים.
    אזהרה: יש להשליך את השלבים הנותרים בשיטות מתאימות לסילוק חומרים מסוכנים.
  10. הוסף נפח שווה (כשלב מימי) של 100% איזופרופנול לכל דגימה. לערבב על ידי היפוך הצינור 8-10 פעמים. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
    1. הוסף 1 μL של coprecipitant גליקוגן לכל מדגם כדי לסייע באיתור גלולה RNA לאחר צנטריפוגה.
  11. צנטריפוגה הדגימות ב 12000 x g במשך 25 דקות ב 4 °C (70 °F).
  12. אתר את הכדור בצינור (אם משתמש coprecipitant, זה ייראה כחול). שפוך בזהירות את הסופר-טבעי.
  13. לשטוף את הכדור על ידי הוספת 1 מ"ל של קר כקרח 75% אתנול לכל מדגם, מערבולת כדי להפיץ את הכדור מתחתית הצינור.
    הערה: הכן 75% אתנול באמצעות אתנול טהור מולקולרי ומים ללא נוקלאז.
  14. צנטריפוגה ב 7000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). שפוך בזהירות את הסופר-טבעי.
  15. חזור על שלבים 5.13 ו- 5.14 פעמיים נוספות.
  16. סיבוב מהיר (<2000 x g עבור 5 s) כדי להביא כל נוזל שיורית לתחתית הצינור. השתמש פיפטה P20 כדי להסיר כל אתנול שיורית מתחתית הצינורות.
    1. הימנעו מלגעת בגללי הרנ"א עם קצה פיפטה. שנה עצות בין דוגמאות.
  17. עם כובעי צינור פתוחים, דגימות יבשות באוויר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    הערה: גלולה עלולה להיות שקופה כפי שהוא מתייבש. הבטחת כל שאתנול שיורית התאדה ישפר את טוהר RNA.
  18. הוסף 25 μL של מים ללא נוקלאז לכל צינור כדי להמיס את הכדור.
  19. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  20. מקטרים בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב את הרנ"א.
  21. Aliquot 5 μL של המדגם לתוך צינור טרי לניתוח בקרת איכות (חלק 6). יש לאחסן את 20 ה-μL הנותרים ב-80 °C (80 °F) לבדיקות ביטוי גנים.

6. בקרת איכות

  1. לקבוע את הריכוז והטוהר של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר על פי הוראות היצרן.
  2. קבע את תקינות ה- RNA באמצעות התקן אלקטרופורזה בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: לדלל את ה- RNA כך שיהיה בטווח של מגבלות זיהוי השבבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שבע רקמות ייחודיות למפרק הברך האנושי זמינות לאיסוף מחולים העוברים TKA עבור OA (איור 1). בפרוטוקול זה, כל אחת מהרקמות הללו זוהתה ועובדה תוך 4 שעות מהסרה כירורגית (איור 2). בעקבות הצעדים המתוארים באיור 3,חלקים מכל רקמה תוקנו פורמרין להערכה היסתולוגית (איור 4),בעוד שחלקים אחרים הוקפאו בזק לבידוד RNA. הפרדת רקמות קשות מרקמות רכות בשיטת התפוררות (ריסוק לעומת הומוגניזציה, בהתאמה), RNA של שלמות גבוהה וטוהר הופק מכל סוג רקמה, עם תוצאות מייצגות המוצגות בטבלה 1 (עמודות באיכות גבוהה). ראוי לציין, כמה נושאים הניבו RNA באיכות נמוכה יותר על פני רקמות מרובות(טבלה 1,עמודות באיכות נמוכה), דבר המצביע על כך שלמרות שיטה אופטימלית, גורמים חיצוניים (למשל, חומרת המחלה) עשויים להשפיע על איכות ה- RNA על פני סוגי רקמות.

Figure 1
איור 1: שרטוט של מפרק הברך האנושי המציג חתך רוחבי. כל אחת משבע הרקמות המסומנות נאספת במהלך TKA ומשמשת למטרות מחקר כמתואר בפרוטוקול זה. VMO = שריר האלמוני של vastus medialis. תמונה ניגשת ושונתה ממכללת OpenStax תחת רישיון משותףיצירתי 26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות גסות מייצגות עבור כל אחת משבע הרקמות המתקבלות מחולים העוברים TKA. (א)עצם הירך צפונית חתוכה בחץ המצביע על סחוס מפרקי שיש לאסוף. הסחוס מזוהה על ידי שכבה לבנבנית שנמצאה על פני העצם. (B)עצם הירך צפונית לחתוך עם חץ המצביע על עצם תת-כונדרית לאיסוף. (ג)מניסקוס. הימנע מאיסוף חלקים שרופים הנגרמים על ידי אלקטרוקטריזציה במהלך TKA. (D)כרית שומן Infrapatellar (צהוב בצבע). (E)רצועה צולבת חיצונית (לבן, סיבי, רקמה ספוגית). (ו)סינוביום. צד אחד ייראה בהיר וסיבי, לעתים קרובות מכיל רקמת שומן, בעוד הצד הנגדי ייראה ורדרד ופחות סיבי. הצד הוורוד של הממברנה מכיל את הרירית הסינובית. (ז)שריר האלמוני של ווס מדיהליס (אדום). זה עשוי להיות לעתים קרובות חלק הרקמה הקטן ביותר, עשוי להכיל כמה רקמת שומן. סרגל קנה מידה = 2 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סקירת הצעדים שננקטו לאיסוף רקמות OA אנושיות ראשוניות עבור היסתולוגיה ורנ"א. פרוטוקול זה מתאר בחירת מטופלים, עיבוד מדגם עבור היסתולוגיה ורנ"א, הומוגניזציה של רקמות עבור רקמות קשות ורקמות רכות, מיצוי RNA ובקרת איכות עבור שבע רקמות OA הברך האנושית העיקרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קטעים היסתולוגיים עבור כל אחת משבע הרקמות המתקבלות מחולים העוברים TKA. מקטעים מוכתמים בהמטוקסילין ובאוסין מוצגים בהגדלה של פי 6 בלוחות A-F עם זרם מוגדל ל- 40x בלוחות A'-F' ו- A". (א, א')) סחוס מפרקי; (A, A") עצם תת-ביתית; (ב, ב')מניסקוס; (C, C') כרית שומן infrapatellar; (D, D') רצועה צולבת חיצונית; (E, E') סינוביום; (F, F') שרירים אלמוניים עצומים. מוטות קנה מידה = 400 מיקרומטר עבור A-F ו 50 מיקרומטר עבור A'-F' ו- A". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טישו N רין [רנ"א] (ng/μL) ב 25 μL A260:A280 A260:A230
איכות גבוהה איכות נמוכה איכות גבוהה איכות נמוכה איכות גבוהה איכות נמוכה איכות גבוהה איכות נמוכה איכות גבוהה איכות נמוכה
"רקמות קשות"
סחוס מפרקי 10 4 7.0 ± 0.8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1.80 ± 0.09 1.47 ± 0.34 1.40 ± 0.36 0.45 ± 0.26
עצם תת-ביתית 10 4 7.8 ± 0.6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1.96 ± 0.05 1.90 ± 0.17 1.72 ± 0.27 1.12 ± 0.62
מניסקוס 10 4 7.5 ± 0.6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1.91 ± 0.05 1.71 ± 0.15 1.41 ± 0.47 0.77 ± 0.59
"רקמות רכות"
כרית שומן אינפרא-פטלר 10 3 8.5 ± 0.6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1.99 ± 0.01 2.02 ± 0.03 2.09 ± 0.17 1.47 ± 0.71
רצועה צולבת חיצונית 8 3 7.4 ± 0.4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1.97 ± 0.03 1.91 ± 0.18 1.88 ± 0.20 1.35 ± 0.70
סינוביום 9 3 8.5 ± 0.6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1.99 ± 0.04 2.00 ± 0.03 2.05 ± 0.11 1.91 ± 0.20
אוסטיקה של וסטה מדיליס 9 3 8.5 ± 0.6 8.4 ± 0.7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1.96 ± 0.03 1.99 ± 0.03 1.82 ± 0.11 1.62 ± 0.27

טבלה 1. איכות וכמות של RNA מבודד מרקמות OA שנאספו מחולים TKA. RIN = מספר תקינות RNA. נתונים המוצגים כממוצע ± סטיית תקן עבור RIN, A260:280 ו- A260: יחסשל230, וממוצע (טווח) לערכי ריכוז RNA. דגימות באיכות גבוהה מורכבות מחולים שמהם כל סוגי הרקמות הניבו RNA עם RIN > 6 (n = 8-10). דגימות באיכות נמוכה מורכבות מחולים שמהם סוגי רקמות מרובים הניבו RNA עם RIN < 6 (n = 3-4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול שהוצג הוכח כמוצלח לאיסוף שבע רקמות OA אנושיות עיקריות להפקת RNA (טבלה 1) ועיבוד היסתולוגי (איור 4). לפני איסוף דגימות המטופל, יש צורך להקים פרוטוקול שאושר על ידי IRB, באופן אידיאלי בשיתוף פעולה עם מנתח או צוות כירורגי. החלת פרוטוקול מתוקנן עבור אוסף דגימות (לדוגמה, כריתה ממיקומי מיקום עקביים) חיונית למיקסום יכולת הרבייה הניסיונית. דגימות רקמה צריך להיות מועבר למעבדה במיכלים סטריליים ומעובד בתוך 4 שעות של הניתוח כדי למנוע השפלה. במהלך ניתוח ועיבוד רקמות, כל הרקמות נשמרות מיובשות ב- PBS סטרילי ונשטפות ב- PBS טרי וסטרילי כדי להסיר מזהמים פוטנציאליים על פני השטח כגון ביופלואידים ופסולת לא רצויה אחרת לפני שהן קפואות להבזק להפקת RNA או קבוע פורמרין להיסטיולוגיה. יישום שימושי של ניתוח היסתולוגי הוא אישור של סוגי הרקמות וחומרת המחלה שכן אלה ניתן להבחין על ידי מספר התא, הפצה, ומורפולוגיה, בין גורמים אחרים נצפים על ידי כתמים סטנדרטיים כגון המטוקסילין ו אאוזין (איור 4).

רקמות OA אנושיות ראשוניות יכולות להציג אתגרים לחילוץ RNA בכמות ובאיכות מספיקות, כפי שהוגדר על ידי טוהר ושלמות27. כמות RNA היא פונקציה של התאיות הכוללת של הרקמה, ובמפרק הברך, יש תאים נמוכים, רקמות מטריצה גבוהה כגון הסחוס, העצם, המניסקוס, ורקמות גבוהות יחסית, מטריצה נמוכה כגון כרית השומן, ACL, סינוביום, ו- VMO. לדוגמה, הן סחוס היאלין מפרקי והן פיברוקרטיילים מניסקאליים28 מאופיינים בתאיות נמוכה, כאשר המטריצה החוץ תאית מכילה כמויות שונות של קולגנים, פרוטאוגליקנים וגליקופרוטאינים אחרים28,29. לאחר פחות תאים גורמת פחות RNA לנפח של רקמה (הפחתת כמות) ויש יותר חלבון תוצאות טיהור משותף עם RNA(הפחתתטוהר) 25,30. טוהר RNA יכול להיקבע על ידי ספקטרופוטומטריה שבה A260:A 280 ו- A260:230 ערכים של <1.5 משקפים את נוכחותם של מזהמים אורגניים (למשל חלבון) וערכים של ~ 2.0 משקפים RNA טהור31. שלמות הרנ"א משקפת את רמת ההשפלה, בין אם נגרמת על ידי תנאים ניסיוניים (כלומר, כוחות גיזום) או על ידי עיכול אנזימטי (למשל, נוקלאזים), ולעתים קרובות נקבעת על ידי ניתוח אלקטרופורטי. מספר תקינות RNA (RIN) של 1 משקף RNA מושפל ו- RIN של 10 משקף RNA שלם31,32. עבור רצף RNA, RIN מינימלי של 7 מומלץ לעתים קרובות33,34,35. נתונים המוצגים בטבלה 1 מגלים כי אלה A260:A 280, A260:A230, סף RIN נפגשו על פני כל הרקמות מן דגימות המטופל בקבוצת RNA באיכות גבוהה לעומת דגימות חולים בקבוצת RNA באיכות נמוכה, למעט כ260:A230 ערכים, אשר עשויים לשקף זיהום חלבון של RNA ברקמות נמוכות, מטריצה גבוהה. אמנם ישנם גורמים רבים שיכולים לתרום לאיכות ה- RNA המבודד מדגימת מטופל נתון, ביניהם עשויה להיות רמת חומרת המחלה. האופי החולה של רקמות OA מרמז על תהליכים משפילים המתרחשים באמצעות רמות גבוהות של אנזימים שיכולים לעכל רקמות, אבל גם RNA, ובכך להפחית את האיכות.

פרוטוקול זה להפקת RNA נועד למקסם את כמות הרנ"א ואת האיכות מרקמות OA אנושיות ראשוניות. הצעד הקריטי ביותר נגע לשאלה אם הרקמות התפוררו על ידי ריסק או הומוגני, וזה נמצא לתאם עם התאיות הרקמה ואת הרכב מטריצה. בתחילה, כל שבע הרקמות היו כפופות לאותו פרוטוקול שבו רקמות נופצו תחילה על ידי מרגמה ועלי באמצעות חנקן נוזלי, לאחר מכן הועברו לתמיסת חומצה-guanidinium-פנול, ועוד הומוגני באמצעות homogenizer רקמות ידני. שיטה זו ייצרה תשואת RNA חיובית, טוהר ושלמות עבור כרית השומן, ACL, סינוביום ו- VMO (רקמות רכות באופן קולקטיבי; גם, תוצאות גבוהות יחסית של תאים, מטריצה נמוכה), אך תוצאות שליליות לסחוס, עצם ומניסקוס (רקמות קשות באופן קולקטיבי; גם, תא נמוך, מטריצה גבוהה). בהתבסס על תצפיות אלה, שבע הרקמות חולקו לשתי קבוצות לעידון פרוטוקול נוסף. זה נצפתה כי הומוגניזציה נוספת הייתה השפעה מינימלית על עוד לפורר את הרקמות הקשות לאחר שהם נמחצו לאבקה דקה. לעומת זאת, ניתוק הרקמות הרכות הושג בהצלחה עם הומוגניזציה בלבד ולא דרש ריסוק. לכן, הומוגניזציה של הרקמות הקשות ואת pulverization של הרקמות הרכות בוטל. זה היה מועיל למזעור כוחות גיזום, זמן עיבוד ותנודות טמפרטורה, כל אלה יכולים לשפר את שלמות הרנ"א. שני סבבים של הפרדת שלב פנול / כלורופורם עבור כל שבע הרקמות בוצעו, כפי שדווח כדי לשפר את טוהר הרנ"א מבלי להפחיתאת התשואה 31.

מגבלה פוטנציאלית של פרוטוקול זה היא אפקט האצווה שעשוי לנבוע מהפרדת הרקמות לשתי קבוצות אם העיצוב הניסיוני דורש השוואה בין כל הרקמות. השימוש בשיטות pulverization לעומת homogenization עשוי לשנות טכני (למשל, זמן עיבוד) ותנאים סביבתיים (למשל, תנודות טמפרטורה) שיכולים להציג שונות36. מגבלה שנייה היא חוסר העקביות הפוטנציאלי בזיהוי, ניתוח והכוונת (לחתך היסטולוגי) של הרקמות בתוך הנושאים וחוצה. מגבלה שלישית היא חוסר היכולת שלנו לאשר קשרים פוטנציאליים בין חומרת המחלה של המטופל לבין איכות הרנ"א בדו"ח הנוכחי. מגבלה רביעית היא היעדר זמינות של רקמות בקרה בריאות להשוואה. למרות דגימות בקרה עשוי להיות זמין מגוויות, אלה הם פחות זמינים מאשר רקמות OA מ TKA. אסטרטגיה ניסיונית לעקוף זאת היא להשתמש בכל נושא כשליטה שלהם, בין אם ביצוע השוואות בין רקמות או בתוך רקמות השוואת טיפול לשליטה או נגע לאזורים שמורים. לבסוף, שימוש ברקמות להפקת RNA אינו מאפשר ניתוח ביטוי גנים של סוגי התאים הבודדים המרכיבים את הרקמות (למשל, פיברובלסטים סינוביאליים לעומת מקרופאגים סינוביאליים37).

למרות המגבלות שצוינו, רקמות OA אנושיות ראשוניות הן משאב בעל ערך למחקר, ומציעות יתרונות על פני מערכות ניסיוניות אחרות עבור OA, כולל שמירה על נישה התא23. עם זאת, רקמות OA האנושי העיקרי עשוי להיות מנוצל במחקר עקב אתגרים לוגיסטיים או טכניים. פרוטוקול זה מתאר בחירת מטופלים, עיבוד מדגם, הומוגניזציה של רקמות, מיצוי RNA ובקרת איכות כדי לתמוך בשימוש בדגימות שהתקבלו מ- TKA. לאחר עיבוד מדגם, ניתן להמשיך מספר גישות ניסיוניות, כולל ביטוי גנים והיטולוגיה, בין היתר. הרלוונטי ביותר לשדה omics המתפתח במהירות הוא היכולת לבודד כמויות מספיקות של RNA באיכות גבוהה עבור יישומים כגון RNA-ריצוף38,39. פרופילים מולקולריים ניתן להשוות בתוך ועל פני רקמות מנושאים עם פנוטיפים מחלה ספציפיים (למשל, בהתבסס על גיל, מין, וגורמי סיכון אחרים OA). תובנות שנצברו עשויות ליידע אפיקים טיפוליים חדשים שניתן לתרגם בקלות רבה יותר בחזרה לאוכלוסיית המטופלים של OA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים מודים למשתתפי המחקר שאפשרו את המחקר ומקדישים את הדו"ח הזה למדענים חדשים בתחום דלקת מפרקים ניוונית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 173
איסוף רקמות ומיצוי RNA ממפרק הברך האוסטאוארטכרטית האנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter