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Biology

मानव ऑस्टियोआर्थ्रिटिक घुटने संयुक्त से ऊतक संग्रह और आरएनए निष्कर्षण

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

कुल घुटने के बाद रोगियों से प्राप्त प्राथमिक ऊतक अधिकतम नैदानिक अनुवाद के साथ ऑस्टियोआर्थराइटिस अनुसंधान के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करते हैं। यह प्रोटोकॉल मानव ऑस्टियोआर्थराइटिस में मशीनी जांच का समर्थन करने के लिए सात अद्वितीय घुटने के ऊतकों से आरएनए की पहचान, प्रक्रिया और अलग-थलग करने का वर्णन करता है।

Abstract

ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) एक पुरानी और अपक्षयी संयुक्त रोग है जो अक्सर घुटने को प्रभावित करता है। चूंकि वर्तमान में कोई इलाज नहीं है, इसलिए कुल घुटने की आर्थ्रोप्लास्टी (TKA) एक आम शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप है। टीकेए से प्राप्त प्राथमिक मानव ओए ऊतकों का उपयोग करने वाले प्रयोग रोग तंत्र पूर्व वीवोकी जांच करने की क्षमता प्रदान करते हैं । जबकि OA पहले मुख्य रूप से उपास्थि प्रभाव सोचा था, यह अब संयुक्त में कई ऊतकों को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है । यह प्रोटोकॉल घुटने के जोड़ में रोग तंत्र जांच का समर्थन करने के लिए सात अद्वितीय ऊतकों में से प्रत्येक से रोगी चयन, नमूना प्रसंस्करण, ऊतक समरूपता, आरएनए निष्कर्षण, और गुणवत्ता नियंत्रण (आरएनए शुद्धता, अखंडता और उपज के आधार पर) का वर्णन करता है। सूचित सहमति के साथ, ओए के लिए TKA से गुजर रहे रोगियों से नमूने प्राप्त किए गए थे । ऊतकों को विच्छेदन, धोया गया और सर्जरी के 4 घंटे के भीतर आरएनए या हिस्ट्रोलॉजी के लिए फॉर्मेलिन निर्धारण के लिए फ्लैश फ्रीजिंग द्वारा संग्रहीत किया गया था। एकत्र किए गए ऊतकों में आर्टिकुलर कार्टिलेज, सबकॉन्ड्रल बोन, मेनिस्कस, इन्फ्रापेटलर फैट पैड, पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु, सिनोवियम, और वास्तुसंस परोक्ष मांसपेशी शामिल थे। आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल प्रत्येक ऊतक प्रकार के लिए परीक्षण किया गया। सबसे महत्वपूर्ण संशोधन में कम कोशिका, उच्च मैट्रिक्स, कठोर ऊतकों (उपास्थि, हड्डी और मेनिस्कस के रूप में माना जाता है) बनाम अपेक्षाकृत उच्च कोशिका, कम मैट्रिक्स, नरम ऊतकों (वसा पैड, स्नायु, सिनोवियम, और मांसपेशियों के रूप में माना जाता है) के लिए उपयोग किए जाने वाले विघटन की विधि शामिल थी। यह पाया गया कि फेफड़े का सरलीकरण कठोर ऊतकों के लिए उपयुक्त था, और समरूपता नरम ऊतकों के लिए उपयुक्त था। कई ऊतकों में लगातार अन्य विषयों की तुलना में उच्च आरएनए अखंडता संख्या (आरआईआर) मूल्यों को प्राप्त करने के लिए कुछ विषयों के लिए एक प्रवृत्ति देखी गई, जिससे यह सुझाव दिया गया कि रोग गंभीरता जैसे अंतर्निहित कारक आरएनए गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। प्राथमिक मानव ओए ऊतकों से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को अलग करने की क्षमता अनुक्रमण सहित परिष्कृत जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों के लिए एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करती है, जो नैदानिक अंतर्दृष्टि का कारण बन सकती है जो रोगियों के लिए अधिक आसानी से अनुवादित होती है।

Introduction

घुटने मानव शरीर में सबसे बड़ा सिनोवियल संयुक्त है, जिसमें टिबिया और फीमर के बीच टिबिओफेमोरल संयुक्त और पटेला औरफीमर 1के बीच पटेलोफेमोरल संयुक्त शामिल है। घुटने में हड्डियों को आर्टिकुलर उपास्थि के साथ रेखांकित किया जाता है और विभिन्न संयोजी ऊतकों द्वारा समर्थित किया जाता है, जिसमें मेनिसी, वसा, स्नायुबंधन और मांसपेशी शामिल हैं, और एक सिनोवियल झिल्ली पूरे संयुक्त को एक सिनोवियल तरल पदार्थ से भरे गुहा1,2,3 (चित्रा 1)बनाने के लिए समाहित करती है। एक स्वस्थ घुटने मोबाइल काज संयुक्त के रूप में कार्य करता है जो ललाट विमान में घर्षण रहित गति की अनुमति देता है1,3. रोग की स्थिति में, आंदोलन प्रतिबंधित और दर्दनाक हो सकता है। सबसे आम अपक्षयी घुटने संयुक्त रोग ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए)4है। जोखिम कारकों की एक किस्म के लिए बड़ी उम्र, मोटापा, महिला सेक्स, संयुक्त आघात, और आनुवंशिकी, दूसरों के बीच5,6 सहित OA विकास के लिए संवेदनशील करने के लिए जानाजाताहै । वर्तमान में संयुक्त राज्य अमेरिका में रोगसूचक घुटने ओए के साथ अनुमानित 14 मिलियन लोग हैं, बढ़ती जनसंख्या आयु और मोटापे की दर7,8के कारण बढ़ती व्यापकता के साथ। शुरू में उपास्थि की बीमारी मानी जाती है, ओए को अब पूरे संयुक्त 9 की बीमारी के रूप में समझाजाताहै । ओए में आमतौर पर देखे जाने वाले रोग परिवर्तनों में आर्टिकुलर कार्टिलेज कटाव, ऑस्टियोफाइट गठन, सबकॉन्ड्रल बोन मोटा होना, और सिनोवियम9,10की सूजन शामिल है। चूंकि ओए के लिए कोई ज्ञात इलाज नहीं है, इसलिए उपचार मुख्य रूप से लक्षण (जैसे, दर्द) प्रबंधन11,12पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और एक बार ओए ने अंतिम चरण में प्रगति की है, संयुक्त प्रतिस्थापन सर्जरी अक्सर13संकेत दिया जाता है।

संयुक्त प्रतिस्थापन सर्जरी या तो आंशिक या कुल घुटने प्रतिस्थापन हो सकती है, जिसमें कुल घुटने की अरथ्रोप्लास्टी (TKA) शामिल है जिसमें पूरे टिबिओफेमोरल अभिव्यक्ति और पटेलोफेमोरल संयुक्त को बदलना शामिल है। 2020 तक, संयुक्त राज्य अमेरिका में हर साल 14 में लगभग1मिलियन टीकेए किए जाते हैं। TKA के दौरान, एक आर्थोपेडिक सर्जन टिबियल पठार के ऊपरी हिस्से और निचले फेमोरल कॉन्डल्स(चित्रा 2 ए,2B)को कृत्रिम प्रत्यारोपण के साथ फिट करने के लिए पुनः प्राप्त करता है। कभी-कभी रोगियों द्वारा गलत व्याख्या की जाती है, एक TKA में, प्रत्येक हड्डी के अंत से केवल 8-10 मिमी को पुनः प्राप्त किया जाता है, जो बाद में धातु के साथ छाया हुआ या फिर से उभर जाता है। एक इंटरपोस्ड पॉलीथीन लाइनर दो धातु प्रत्यारोपण के बीच असर सतह (यानी, पैडिंग) बनाता है। इसके अलावा, संयुक्त के कई नरम ऊतक घटकों को उचित संयुक्त संतुलन प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से या आंशिक रूप से उत्पादित किया जाता है। इन ऊतकों में औसत दर्जे का और पार्श्व menisci(चित्रा 2C),इन्फ्रापेटलर फैट पैड(चित्रा 2डी),पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु (एसीएल; चित्रा 2E),सिनोवियम(चित्रा 2F),और वास्तु परोक्ष मांसपेशी (VMO; चित्रा 2G) 15. हालांकि TKAs आम तौर पर OA उपचार के लिए सफल रहे हैं, रोगियों के लगभग 20% दर्द के बाद सर्जरी16की पुनरावृत्ति की रिपोर्ट । प्रक्रिया की उच्च लागत और सापेक्ष आक्रामकता के साथ, ये सीमाएं ओए की प्रगति को कम करने के लिए वैकल्पिक उपचारों की पहचान करने के लिए आगे के अनुसंधान की आवश्यकता को इंगित करती हैं।

ओए में रोग तंत्र का पता लगाने के लिए जो चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए रास्ते पेश कर सकते हैं, कोशिकाओं, ऊतक प्रत्यारोपण और पशु मॉडल सहित प्रयोगात्मक प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है। कोशिकाओं को आम तौर पर मोनोलेयर में सुसंस्कृत किया जाता है और प्राथमिक मानव या पशु ऊतकों (उदाहरण के लिए, उपास्थि से अलग chondrocytes) या अमर कोशिकाओं (जैसे, ATDC517 और CHON-00118)से प्राप्त कर रहे हैं । जबकि कोशिकाओं को एक नियंत्रित संस्कृति वातावरण में प्रयोगात्मक चर हेरफेर के लिए उपयोगी हो सकता है, वे प्राकृतिक संयुक्त जो सेल फेनोटाइप19प्रभाव के लिए जाना जाता है की स्थितियों पर कब्जा नहीं है । ओए में अंतर्निहित रासायनिक, यांत्रिक और सेल-टू-सेल संचार के जटिल झरने को बेहतर ढंग से पुनः स्थापित करने के लिए, एक विकल्प प्राथमिक मानव या पशु ऊतक नमूनों में पाया जाता है, चाहे ऊतक संरचना और सेल माइक्रोएनवायरमेंट20को संरक्षित करने के लिए, नए या सुसंस्कृत पूर्व वीवो को एक्सप्लांट के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। वीवो मेंसंयुक्त का अध्ययन करने के लिए, छोटे (जैसे, माउस21)और बड़े (उदाहरण के लिए, ओए के लिए घोड़ा22)पशु मॉडल (उदाहरण के लिए, सर्जिकल प्रेरण, आनुवंशिक परिवर्तन, या उम्र बढ़ने के माध्यम से) भी उपयोगी होते हैं। हालांकि, इन मॉडलों से मानव रोग में अनुवाद शारीरिक, शारीरिक और मेटाबोलिक मतभेदों द्वारा सीमित किया जा सकता है, दूसरों के बीच23। प्रयोगात्मक प्रणालियों के फायदे और नुकसान को ध्यान में रखते हुए, प्रजातियों के विशिष्ट होने और प्राथमिक मानव ओए ऊतकों द्वारा पेश किए गए बाहुलीय आला को बनाए रखने की प्रमुख ताकत अनुसंधान निष्कर्षों की अनुवादात्मक क्षमता को अधिकतम करती है।

प्राथमिक मानव ओए ऊतकों को TKA के बाद आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, जिससे टीकेएएस की उच्च आवृत्ति अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन बन जाती है। संभावित प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों में जीन अभिव्यक्ति और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण हैं। इन अनुसंधान दृष्टिकोण और दूसरों के लिए प्राथमिक मानव OA ऊतकों की क्षमता का एहसास करने के लिए, उल्लिखित निम्नलिखित महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । सबसे पहले, रोगी नमूनों का उपयोग नैतिक विनियमन के अधीन है, और प्रोटोकॉल संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) मंजूरी24को पूरा करना चाहिए । दूसरा, मानव प्राथमिक रोगग्रस्त ऊतकों की अंतर्निहित विषमता और उम्र और लिंग जैसे चरों के प्रभाव, दूसरों के बीच, सावधान रोगी चयन (यानी, पात्रता मानदंडों का आवेदन) और डेटा व्याख्या की आवश्यकता पैदा करते हैं। तीसरा, संयुक्त में विभिन्न ऊतकों के अद्वितीय जैविक गुण (उदाहरण के लिए, उपास्थि और मेनिस्कस25की कम सेलुलरिटी) प्रयोगों के दौरान चुनौतियां पेश कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, उच्च गुणवत्ता और आरएनए की मात्रा को अलग करना)। यह रिपोर्ट इन बातों को संबोधित करती है और रोगी चयन, नमूना प्रसंस्करण, ऊतक समरूपता, आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता नियंत्रण (यानी आरएनए शुद्धता और अखंडता का आकलन) के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है; चित्रा 3) अनुसंधान समुदाय में प्राथमिक मानव OA ऊतकों के उपयोग को प्रोत्साहित करने के लिए।

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Protocol

इस अध्ययन प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी और हेनरी फोर्ड स्वास्थ्य प्रणाली संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी #13995) द्वारा निर्धारित संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन किया गया ।

1. रोगी चयन

  1. एक आर्थोपेडिक सर्जन के साथ TKA से गुजरना करने के लिए अनुसूचित उन लोगों के बीच से रोगियों की पहचान करें ।
  2. अध्ययन प्रोटोकॉल द्वारा परिभाषित पात्रता मानदंडों के आधार पर रोगियों का चयन करें। समावेशन मानदंडों के उदाहरणों में 18 वर्ष या उससे अधिक उम्र का होना और घुटने के ऑस्टियोआर्थराइटिस का पुष्टि निदान होना शामिल है। बहिष्कार मानदंडों के उदाहरणों में आंशिक घुटने के प्रतिस्थापन से गुजरना या रूमेटॉयड गठिया का पुष्टि निदान करना शामिल है।
  3. सर्जरी से पहले सूचित सहमति प्राप्त करने के लिए रोगियों से संपर्क करें।

2. नमूना प्रसंस्करण (आरएनए के लिए)

नोट: एक वर्ग द्वितीय जैवसेफ्टी कैबिनेट में सभी ऊतक प्रसंस्करण प्रदर्शन और बाँझ तकनीकों का पालन करें । मानव नमूनों को संसाधित करते समय हमेशा उपयुक्त पीपीई (नाइट्रिल दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मे) पहनें। कई हड्डी के टुकड़े TKA के दौरान उत्पादित कर रहे हैं, हड्डी की एक बड़ी राशि/उपास्थि संभवतः विच्छेदन के लिए उपलब्ध हो जाएगा । रोग प्रगति के कारण, आर्टिकुलर कार्टिलेज अध: पतन कुछ हड्डी भागों पर अधिक गंभीर हो सकता है, जिसे प्रायोगिक डिजाइन में सकारात्मक असर किया जा सकता है। केवल ऊतकों कि जनादेश resection के लिए इलेक्ट्रोकाटेरी थर्मल बढ़त क्षति है, और एक ठोस शल्य प्रयास के लिए एक स्केलपेल के साथ सबसे ऊतकों की खरीद के लिए नुकसान को कम किया जाता है । पुनः प्राप्त ऊतकों को बाँझ पीबीएस के साथ हर समय हाइड्रेटेड रखा जाना चाहिए।

  1. 70% इथेनॉल, आरएनएएस डिक्टेनकमेंट, डीईपीसी-उपचारित पानी और फिर 70% इथेनॉल के साथ सभी काम सतहों और उपकरणों को कीटाणुरहित करें। स्वच्छ, लिंट-मुक्त ऊतकों के साथ अवशिष्ट तरल को मिटा दें। उपयोग से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में संदंश, बोन कटर और स्केलपेल या तो ऑटोक्लेव किए जाते हैं या भिगो दिए जाते हैं। तत्काल उपयोग में नहीं होने पर 70% इथेनॉल में उपकरण जलमग्न रखें।
  2. प्रत्येक ऊतक (जैसे, TKA-1 उपास्थि 1) के लिए डी-आइडेंटेट नाम और एलिकोट नंबर के साथ कम से कम तीन क्रायोवियल प्री-लेबल करें।
    1. चित्रा 2 में दिखाए और वर्णित आकार, आकार, रंग और बनावट में अंतर के आधार पर नमूने से प्रत्येक ऊतक प्रकार की पहचान करें। उपास्थि(चित्रा 2 ए तीर), हड्डी(चित्रा 2B तीर), मेनिस्कस(चित्रा 2 सी),इंफ्रापेटलर फैट पैड(चित्रा 2D),पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु(चित्रा 2E),सिनोवियम(चित्रा 2F),और वास्तु ों की मध्यस्थता परोक्ष मांसपेशी(चित्रा 2G)की पहचान करें ।
  3. आर्टिकुलर कार्टिलेज को अलग करें।
    1. न्यूनतम उपास्थि क्षरण के साथ एक हड्डी भाग का चयन करें।
    2. एक नंबर 10 स्केलपेल का उपयोग करना, उपास्थि की परत की पूरी मोटाई को विच्छेदन करने के लिए जहां तक संभव हो उपास्थि गहराई के माध्यम से काटें।
      नोट: एक नंबर 10 स्केलपेल केवल उपास्थि घुसना होगा, हड्डी नहीं ।
    3. उपास्थि की पूरी मोटाई का उपयोग करके, तीन 5 मिमी क्यूब्स को काटें।
  4. सबकॉन्ड्रल बोन को अलग करें।
    1. उसी हड्डी अनुभाग का उपयोग करें जिससे उपास्थि एकत्र की गई थी।
    2. नंबर 10 स्केलपेल का उपयोग करके, हड्डी की सतह से किसी भी शेष उपास्थि और अवशिष्ट ऊतकों को परिमार्जन करें।
    3. हड्डी के हिस्से को संदंश के साथ काटने के लिए पकड़ो और तीन 5 मिमी क्यूब्स को काटने के लिए हड्डी कटर का उपयोग करें।
  5. मेनिस्कस को अलग-थलग करें।
    1. या तो मध्याढि़ या पार्श्व meniscus के एक अपेक्षाकृत अक्षतिग्रस्त हिस्से की पहचान करें।
    2. नंबर 10 स्केलपेल और संदंश का उपयोग करके, तीन 5 मिमी क्यूब्स को काट लें।
  6. इंफ्रापैटलर फैट पैड को अलग करें।
    1. नंबर 10 स्केलपेल और संदंश का उपयोग करके, ऊतक के पीले हिस्से को तीन बराबर आकार और समरूप भागों (~ 500 मिलीग्राम प्रत्येक) में काट दें।
  7. पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु (एसीएल) को अलग करें।
    1. नंबर 10 स्केलपेल और संदंश का उपयोग करके, तीन 5 मिमी क्यूब्स को काट लें।
  8. सिनोवियम को अलग करें।
    1. नंबर 10 स्केलपेल और संदंश का उपयोग करके, वसा ऊतकों को स्क्रैप करके झिल्ली के गुलाबी सेलुलर हिस्से को जितना संभव हो उतना अलग करें।
    2. तीन बराबर आकार और समरूप भागों (~ 200 मिलीग्राम प्रत्येक) विच्छेदन।
  9. वास्तु मध्यस्थता तिरछी मांसपेशी (वीएमओ) को अलग करें।
    1. नंबर 10 स्केलपेल और संदंश का उपयोग करके, नमूने से किसी भी वसा ऊतक को हटा दें, केवल लाल मांसपेशी ऊतक छोड़ दें।
    2. तीन 5 मिमी क्यूब्स को विच्छेदन करें।
      नोट: ऊतक का प्रारंभिक आकार भागों के आकार को सीमित करता है।
  10. किसी भी अवशेष या मलबे को हटाने के लिए बाँझ PBS के साथ ऊतक भागों कुल्ला।
  11. हिस्पियोलॉजी करने के लिए, भाग 3में वर्णित प्रत्येक ऊतक भाग को ठीक करें।
  12. आरएनए निष्कर्षण करने के लिए, तीन ऊतक भागों में से प्रत्येक को छोटे टुकड़ों (~ 1-2 मिमी क्यूब्स) में काट   लें।
    1. छोटे टुकड़ों को 2 एमएल क्रायोवियल में स्थानांतरित करें, कैप को कसकर सुरक्षित करें, 30 एस के लिए तरल नाइट्रोजन में डूबे हुए फ्लैश फ्रीज करें, और फिर लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें (वर्तमान प्रोटोकॉल में 4 महीने तक परीक्षण किया गया)। सभी ऊतकों के सभी aliquots के लिए यह दोहराएं।
    2. भाग 4में वर्णित ऊतक समरूपता के लिए जारी रखें ।

3. नमूना प्रसंस्करण (हिसटोलॉजी के लिए)

सावधानी: फॉर्मेलिन एक खतरनाक रसायन है, केवल रासायनिक धुएं हुड में उपयोग करता है।

  1. 10% फॉर्मेलिन समाधान के साथ पूर्व-लेबल 15 एमएल शंकु नली भरें।
  2. संदंश का उपयोग करके, ऊतक अनुभाग को फॉर्मेलिन-भरी ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  3. यदि संभव हो तो हिलाते/आंदोलन करते हुए कमरे के तापमान पर 1 सप्ताह के लिए फॉर्मलिन में ऊतकों को ठीक करें।
  4. 1 सप्ताह के बाद, फॉर्मेलिन को उचित रासायनिक अपशिष्ट निपटान में त्यागें, ऊतकों को पीबीएस के साथ कुल्ला करें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए 70% इथेनॉल युक्त एक ताजा 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जब तक कि नमूने अनुभागिंग के लिए एम्बेडेड न हो जाएं।
    नोट: केवल हड्डी/उपास्थि के लिए, इस प्रकार के रूप में decalcification प्रदर्शन करते हैं ।
  5. 1 सप्ताह के बाद, फॉर्मेलिन को उचित रासायनिक अपशिष्ट निपटान में त्यागें, और पीबीएस के साथ ऊतकों को कुल्ला करें।
  6. ऊतक को 10% ईडीए समाधान (पीएच 7.4) के 45 एमएल के साथ 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।
  7. यदि हिलना/आंदोलन संभव नहीं है तो रोजाना एक बार 10-15 बार ट्यूबों को उलटा करें।
  8. एक बार साप्ताहिक रूप से ईडीटीए समाधान को त्यागें और बदलें।
    1. दो बार साप्ताहिक, दबाव लागू होने पर विरूपण को देख कर डिक्लेरेशन की पुष्टि करने के लिए एक उपकरण (यानी, स्पैटुला) या दस्ताने उंगली के साथ बनावट का परीक्षण करें। हड्डी के ऊतकों को कम करने के लिए आवश्यक समय 4-6 सप्ताह के नमूनों के बीच भिन्न होगा।
  9. एक बार डिक्लेप्ड होने के बाद, पीबीएस के साथ ऊतक को कुल्ला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए 70% इथेनॉल युक्त ताजा 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जब तक कि नमूने अनुभागिंग के लिए एम्बेडेड न हो जाएं।

4. ऊतक समरूपता

सावधानी: प्रोटोकॉल खतरनाक रासायनिक फिनॉल का उपयोग करता है। फिनोल के साथ काम एक रासायनिक धुएं हुड में किया जाना चाहिए।

नोट: 70% इथेनॉल (न्यूनतम 10 मिनट के लिए भिगोने) के साथ उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों और सतहों को अच्छी तरह से साफ करें, इसके बाद आरएनएज़ डेक्विटमिनेंट (न्यूनतम 10 मिनट के लिए सोख लें), डीईपीसी-उपचारित पानी के साथ कुल्ला, एक साफ, लिंट-फ्री पेपर तौलिया से पोंछें, और फिर 70% इथेनॉल के साथ पुनः प्राप्त करें या भिगोएं।

  1. हार्ड टिश्यू समरूपता (आर्टिकुलर कार्टिलेज, सबकॉन्ड्रल बोन, मेनिस्कस)
    1. समरूपता से पहले, तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके मोर्टार, मूसल और स्पैटुला को ठंडा करें। नमूना गल को रोकने के लिए इन्हें यथासंभव ठंडा रखा जाना चाहिए।
    2. एक समय में नमूनों को एक प्रक्रिया, -80 डिग्री सेल्सियस पर अन्य नमूनों को रखते हुए जब तक इस्तेमाल किया।
    3. एक ठंडा स्पैटुला का उपयोग करके ऊतक नमूने को मोर्टार में स्थानांतरित करें; ऊतक के शीर्ष पर अतिरिक्त तरल नाइट्रोजन डालें और इसे वाष्पित होने दें। मूसल का उपयोग कर ऊतक क्रश। ऊतक नमूने में बार-बार अधिक तरल नाइट्रोजन जोड़ें, इसे वाष्पित होने दें, और फिर एक ठीक पाउडर बनाने के लिए मूसल के साथ पीसते रहें।
    4. जितना संभव हो ऊतक को पाउडर करने के बाद, एक पूर्व ठंडा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      1. ऊतक हस्तांतरण से पहले 30 एस के लिए तरल नाइट्रोजन में डूबने से पूर्व-चिल ट्यूब।
    5. हर ट्यूब में एसिड-ग्वानिडियम-फिनॉल घोल का 1 एमएल डालकर बर्फ पर रखें।
    6. प्रत्येक कठोर ऊतक नमूने के लिए 4.1.3-4.1.5 कदम दोहराएं।
    7. प्रत्येक ऊतक के बाद, 70% इथेनॉल, आरएनएज़ डिसेंटमिनेंट, डीईपीसी-उपचारित पानी और 70% इथेनॉल में अतिरिक्त सोख के साथ मोर्टार, मूसल और स्पैटुला को साफ करें। किसी भी अवशिष्ट तरल को साफ, लिंट-फ्री ऊतक के साथ पोंछें।
    8. एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए बर्फ पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  2. सॉफ्ट टिश्यू होमोजेनाइजेशन (इंफ्रापेटलर फैट पैड, एसीएल, सिनोवियम, वीएमओ)
    1. 70% इथेनॉल, आरएनएज़ डिसेंटामिनेंट, डीईपीसी-उपचारित पानी, और 30 एस के लिए प्रत्येक अतिरिक्त 70% इथेनॉल धोने की ट्यूबों को चलाकर समरूपता को कीटाणुरहित करें। किसी भी अवशिष्ट तरल को साफ, लिंट-फ्री ऊतक के साथ पोंछें। इसे प्रत्येक नमूने के बीच दोहराएं।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए पूर्व लेबल 5 एमएल राउंड बॉटम ट्यूब। प्रत्येक ट्यूब में एसिड-ग्वानिडियम-फिनॉल समाधान का 1 एमएल जोड़ें।
      1. एक समय में एक नमूने पर काम करें, अन्य नमूनों को उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संसाधित किया जाए।
    3. ऊतक को एसिड-ग्वानिडियम-फिनॉल के साथ पूर्व-लेबल 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. दालों के दौरान और बीच में बर्फ पर रखते हुए, 30 एस दालों में ऊतकों को समरूप करें। तब तक दोहराएं जब तक कि ऊतक नेत्रहीन रूप से भंग न हो जाए या अधिकतम पांच 30 एस दालों के लिए न हो जाए।
      नोट: कुछ रेशेदार ऊतक (यानी, मांसपेशियों) अच्छी तरह से समरूप नहीं हो सकते हैं।
    5. बर्फ पर घुले हुए ऊतकों को इनक्यूबेट करें और अगले नमूने पर जाएं।
      1. चरण 4.2.1 में वर्णित होमोजेनाइजर को साफ करें। सुनिश्चित करें कि ऊतक का हिस्सा जांच के दांतों में नहीं रहता है; यदि आवश्यक हो तो बाँझ संदंश के साथ निकालें।
    6. सभी नमूनों के समरूपीकरण के बाद, अतिरिक्त 20 मिनट के लिए एसिड-ग्वानिडियम-फिनोल में बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    7. नमूनों को गोल बॉटम ट्यूब से प्री-लेबल और प्री-ठंडा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

5. ऊतकों से आरएनए निष्कर्षण

सावधानी: यह प्रोटोकॉल फिनॉल, क्लोरोफॉर्म और आइसोप्रोपेनॉल जैसे खतरनाक रसायनों का उपयोग करता है। एक रासायनिक धुएं हुड में सभी काम करते हैं।

नोट: उपकरण और अभिकर्ण केवल आरएनए काम के लिए आरक्षित हैं और आणविक अनुप्रयोगों के लिए उचित रासायनिक ग्रेड के होना चाहिए (यानी, बाँझ, नाभिक मुक्त)। यह प्रोटोकॉल भागों 4.1 और 4.2 ऊतक समरूपता प्रोटोकॉल दोनों को सफल करता है। 70% इथेनॉल (न्यूनतम 10 मिनट के लिए भिगोने) के साथ उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों और सतहों को अच्छी तरह से साफ करें, इसके बाद आरएनएसई डिसेंटमिनेंट (न्यूनतम 10 मिनट के लिए भिगोएं)। डीईपीसी-इलाज पानी के साथ कुल्ला, एक साफ, लिंट मुक्त कागज तौलिया के साथ अवशिष्ट तरल पोंछ, और फिर respray या 70% इथेनॉल के साथ सोख।

  1. 10000 x ग्राम पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मलबे को गोली मारने के लिए केंद्रित किया जाता है।
  2. सुपरनेट को एक ताजा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: फैटी ऊतकों के लिए, एक लिपिड परत कभी-कभी शीर्ष पर मौजूद होगी। पाइपट टिप के साथ ट्यूब के किनारे परत को छेदकर इसे स्थानांतरित करने से बचें।
  3. प्रत्येक नमूने में एसिड-ग्वानिनियम-फिनॉल समाधान के प्रति 1 एमएल क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस मिश्रण करने के लिए हाथ से ट्यूबों को सख्ती से हिलाएं। फिर, 2 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 10000 x g पर सेंट्रलाइज नमूने।
    नोट: अपकेंद्रित्र के बाद, तीन परतों का गठन किया जाएगा: आरएनए युक्त एक जलीय चरण, एक सफेद डीएनए इंटरफेज, और नीचे एक गुलाबी प्रोटीन चरण ।
  5. ऊपरी, जलीय चरण के ~ 500 माइक्रोल को ताजा 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: इंटरफेज और प्रोटीन के अंशों को परेशान न करें। भविष्य के डीएनए या प्रोटीन अलगाव के लिए इन चरणों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. स्थानांतरित जलीय चरण में एसिड-ग्वानिडिनियम-फिनोल समाधान की बराबर मात्रा जोड़ें, ट्यूब को 8-10 बार उलटा करके मिलाएं। 20 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब इनक्यूबेट।
  7. प्रत्येक नमूने में एसिड-ग्वानिनियम-फिनॉल समाधान के प्रति 1 एमएल क्लोरोफॉर्म के 200 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण करने के लिए 30 एस के लिए हाथ से सख्ती से हिलाएं और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के लिए 10000 x g पर सेंट्रलाइज नमूने।
  9. जलीय चरण के <500 माइक्रोल को एक ताजा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, अन्य चरणों के साथ नमूने को दूषित न करें।
    सावधानी: उचित खतरनाक सामग्री निपटान विधियों के साथ शेष चरणों को त्यागें।
  10. प्रत्येक नमूने में 100% आइसोप्रोपैनॉल की समान मात्रा (जलीय चरण के रूप में) जोड़ें। ट्यूब को 8-10 बार उलटा करके मिलाएं। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    1. आरएनए गोली के बाद अपकेंद्रित्र का पता लगाने में सहायता करने के लिए प्रत्येक नमूने में ग्लाइकोजन सहप्रीक्षित के 1 μL जोड़ें ।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 12000 x ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
  12. ट्यूब में गोली का पता लगाएं (यदि सहप्रेषक का उपयोग कर, यह नीला दिखाई देगा)। ध्यान से सुपरनेट बंद डालना।
  13. प्रत्येक नमूने में बर्फ-ठंड 75% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़कर गोली धोएं, ट्यूब के नीचे से गोली को उखाड़ फेंकने के लिए भंवर।
    नोट: आणविक ग्रेड शुद्ध इथेनॉल और नाभिक मुक्त पानी का उपयोग करके 75% इथेनॉल तैयार करें।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7000 x g पर सेंट्रलाइज। ध्यान से सुपरनेट बंद डालना।
  15. दो बार 5.13 और 5.14 कदम दोहराएं।
  16. ट्यूब के नीचे किसी भी अवशिष्ट तरल को लाने के लिए त्वरित स्पिन (5 एस के लिए <2000 x ग्राम) । ट्यूबों के नीचे से किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए P20 पिपेट का उपयोग करें।
    1. एक पिपेट टिप के साथ आरएनए गोली को छूने से बचें। नमूनों के बीच सुझाव बदलें।
  17. ट्यूब टोपियां खुली के साथ, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हवा शुष्क नमूने ।
    नोट: गोली पारदर्शी हो सकता है के रूप में यह सूख जाता है । यह सुनिश्चित करना कि सभी अवशिष्ट इथेनॉल सुखाया गया है आरएनए शुद्धता में सुधार होगा।
  18. गोली को भंग करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में नाभिक मुक्त पानी के 25 माइक्रोन जोड़ें।
  19. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  20. आरएनए को मिलाने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें।
  21. गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण(भाग 6)के लिए एक ताजा ट्यूब में नमूने के Aliquot 5 μL । जीन अभिव्यक्ति परख के लिए शेष 20 माइक्रोन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. गुणवत्ता नियंत्रण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए की एकाग्रता और शुद्धता का निर्धारण करें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार इलेक्ट्रोफोरेसिस डिवाइस का उपयोग करके आरएनए अखंडता का निर्धारण करें।
    नोट: आरएनए को चिप डिटेक्शन सीमा की सीमा के भीतर पतला करें।

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Representative Results

ओए(चित्रा 1)के लिए TKA से गुजर रहे रोगियों से संग्रह के लिए सात अद्वितीय मानव घुटने संयुक्त ऊतक उपलब्ध हैं। इस प्रोटोकॉल में, इनमें से प्रत्येक ऊतक की पहचान की गई और सर्जिकल हटाने के 4 घंटे के भीतर संसाधित(चित्र 2)। चित्रा 3में उल्लिखित चरणों के बाद, प्रत्येक ऊतक के कुछ हिस्सों को हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन(चित्रा 4)के लिए औपचारिक रूप से तय किया गया था, जबकि अन्य हिस्से आरएनए अलगाव के लिए फ्लैश-फ्रोजन थे। विघटन की विधि (पल्वराइजेशन बनाम समरूपता, क्रमशः) द्वारा नरम ऊतकों से कठिन ऊतकों को अलग करना, प्रत्येक ऊतक प्रकार से उच्च अखंडता और शुद्धता का आरएनए निकाला गया था, जिसमें तालिका 1 (उच्च गुणवत्ता वाले स्तंभों) में दिखाए गए प्रतिनिधि परिणाम थे। विशेष रूप से, कुछ विषयों में कई ऊतकों(तालिका 1,निम्न गुणवत्ता वाले स्तंभों) में कम गुणवत्ता वाले आरएनए मिले, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि अनुकूलित विधि के बावजूद, बाहरी कारक (जैसे, रोग गंभीरता) ऊतक प्रकारों में आरएनए गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:मानव घुटने के संयुक्त की योजनाबद्ध एक पार्श्व पार अनुभाग दिखा । सात लेबल ऊतकों में से प्रत्येक TKA के दौरान एकत्र कर रहे है और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित है । VMO = वास्तु तिरछी मांसपेशी मध्यस्थता करता है। एक क्रिएटिव कॉमन्स लाइसेंस26के तहत ओपनस्कर कॉलेज से इमेज एक्सेस और मॉडिफाइड किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:TKA के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त सात ऊतकों में से प्रत्येक के लिए प्रतिनिधि सकल छवियां । (क)पूर्वकाल फीमोरल बोन कट ऑफ एरो के साथ आर्टिकुलर कार्टिलेज की ओर इशारा करते हुए एकत्र किया जाना । उपास्थि की पहचान हड्डी की सतह पर पाई जाने वाली एक सफ़ेद परत से होती है। (ख)पूर्वकाल फीमोरल बोन को तीर से काटा जाता है जो एकत्र की जाने वाली सबकॉन्ड्रल बोन की ओर इशारा करता है । (ग)मेनिस्कस । TKA के दौरान इलेक्ट्रो्यूटराइजेशन के कारण जले हुए वर्गों को इकट्ठा करने से बचें। (घ)इंफ्रापटेलर फैट पैड (पीले रंग में) । (ई)पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु (सफेद, रेशेदार, स्पंजी ऊतक) । (च)सिनोवियम। एक तरफ हल्के रंग और रेशेदार दिखाई देगा, जिसमें अक्सर वसा ऊतक होते हैं, जबकि विपरीत पक्ष गुलाबी और कम रेशेदार दिखाई देगा। झिल्ली के गुलाबी पक्ष में सिनोवियल अस्तर होता है। (जी)वास्तु तिरछी मांसपेशी (लाल) मध्यस्थता करते हैं। यह अक्सर सबसे छोटा ऊतक भाग हो सकता है और इसमें कुछ वसा ऊतक हो सकते हैं। स्केल बार = 2 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:हिस्ट्रोलॉजी और आरएनए के लिए प्राथमिक मानव ओए ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए उठाए गए कदमों का अवलोकन। यह प्रोटोकॉल रोगी चयन, हिस्ट्रोलॉजी और आरएनए के लिए नमूना प्रसंस्करण, कठोर ऊतकों और नरम ऊतकों के लिए ऊतक समरूपता, आरएनए निष्कर्षण, और सात प्राथमिक मानव घुटने ओए ऊतकों के लिए गुणवत्ता नियंत्रण का वर्णन करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:TKA से गुजर रोगियों से प्राप्त सात ऊतकों में से प्रत्येक के लिए हिस्टोलॉजिकल वर्गों । हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन-दाग वर्गों को पैनलए-एफ में 6x आवर्धन पर दिखाया गयाहै, जिसमें इनसेट पैनल ए'एफ' और ए में40x तक बढ़ाया गया है। (A, A) आर्टिकुलर कार्टिलेज; (क, ए") सबकॉन्ड्रल बोन; (B, B')मेनिस्कस; (ग, सी')इंफ्रापटेलर फैट पैड; (घ, डी')पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु; (ई, ई')सिनोवियम; (एफ, एफ')वास्तु तिरछी मांसपेशी मध्यस्थता करते हैं। स्केल बार = ए-एफ के लिए 400 माइक्रोन और ए'-एफ और ए के लिए 50 माइक्रोन"। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऊतक N रिन [आरएनए] (एनजी/μL) 25 माइक्रोन में एक260:एक280 ए260:ए230
उच्च गुणवत्ता निम्न गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता निम्न गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता निम्न गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता निम्न गुणवत्ता उच्च गुणवत्ता निम्न गुणवत्ता
"हार्ड ऊतक"
आर्टिकुलर कार्टिलेज 10 4 7.0 ± 0.8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1.80 ± 0.09 1.47 ± 0.34 1.40 ± 0.36 0.45 ± 0.26
सबकॉन्ड्रल बोन 10 4 7.8 ± 0.6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1.96 ± 0.05 1.90 ± 0.17 1.72 ± 0.27 1.12 ± 0.62
मेनिस्कस 10 4 7.5 ± 0.6 2.4 ± 0.3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1.91 ± 0.05 1.71 ± 0.15 1.41 ± 0.47 0.77 ± 0.59
"मुलायम ऊतक"
इंफ्रापटेलर फैट पैड 10 3 8.5 ± 0.6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1.99 ± 0.01 2.02 ± 0.03 2.09 ± 0.17 1.47 ± 0.71
पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु 8 3 7.4 ± 0.4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1.97 ± 0.03 1.91 ± 0.18 1.88 ± 0.20 1.35 ± 0.70
सिनोवियम 9 3 8.5 ± 0.6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1.99 ± 0.04 2.00 ± 0.03 2.05 ± 0.11 1.91 ± 0.20
वास्तु मीडियालिस तिरछी 9 3 8.5 ± 0.6 8.4 ± 0.7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1.96 ± 0.03 1.99 ± 0.03 1.82 ± 0.11 1.62 ± 0.27

तालिका 1. गुणवत्ता और आरएनए की मात्रा TKA रोगियों से एकत्र OA ऊतकों से अलग । RIN = आरएनए अखंडता संख्या। आरआईआईएन, ए260: ए 280 और ए 260:आरएनए एकाग्रता मूल्यों के लिए 230 अनुपात, और मतलब (सीमा) के लिए औसत ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किए गए डेटा। उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों में ऐसे रोगी होते हैं जिनसे सभी ऊतक प्रकार आरआईएन > 6 (एन = 8-10) के साथ आरएनए मिले। कम गुणवत्ता वाले नमूनों में ऐसे रोगी होते हैं जिनसे कई ऊतक प्रकार आरआईएन < 6 (एन = 3-4) के साथ आरएनए मिले।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल आरएनए निष्कर्षण(तालिका 1)और हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग(चित्र 4)के लिए सात प्राथमिक मानव ओए ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए सफल साबित हुआ है। रोगी के नमूनों को इकट्ठा करने से पहले, एक सर्जन या सर्जिकल टीम के सहयोग से आदर्श रूप से आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल स्थापित करना आवश्यक है। प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता को अधिकतम करने के लिए नमूना संग्रह (उदाहरण के लिए, सीटू स्थानों में सुसंगत से पुनर्सेक्शन) के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल लागू करना आवश्यक है। ऊतक के नमूनों को बाँझ कंटेनरों में प्रयोगशाला में ले जाया जाना चाहिए और गिरावट से बचने के लिए सर्जरी के 4 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए। ऊतक विच्छेदन और प्रसंस्करण के दौरान, सभी ऊतकों को बाँझ पीबीएस में हाइड्रेटेड रखा जाता है और ताजा, बाँझ पीबीएस में धोया जाता है ताकि आरएनए निष्कर्षण या हिस्टोलॉजी के लिए फॉर्मेलिन-फिक्स्ड के लिए फ्लैश-फ्रोजन होने से पहले बायोफ्लुइड और अन्य अवांछित मलबे जैसे संभावित सतह संदूषकों को हटाया जा सके। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण का एक उपयोगी अनुप्रयोग ऊतक प्रकारों और रोग की गंभीरता की पुष्टि है क्योंकि इन्हें सेल नंबर, वितरण और आकृति विज्ञान द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है, अन्य कारकों के बीच हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन(चित्रा 4)जैसे मानक दाग द्वारा नमूदार।

प्राथमिक मानव ओए ऊतक पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता के आरएनए निकालने के लिए चुनौतियां पेश कर सकते हैं, जैसा कि शुद्धता और अखंडता द्वारा परिभाषितकियागया है। आरएनए मात्रा ऊतक की समग्र सेलुलरिटी का एक कार्य है, और घुटने के जोड़ में, कम सेल, उच्च मैट्रिक्स ऊतक जैसे उपास्थि, हड्डी और मेनिस्कस, और अपेक्षाकृत उच्च कोशिका, कम मैट्रिक्स ऊतक जैसे वसा पैड, एसीएल, सिनोवियम और वीएमओ होते हैं। उदाहरण के लिए, आर्टिकुलर हाइलीन उपास्थि और मेनिसकल फाइब्रोकार्टिलेज28 दोनों को कम सेलुलरिटी की विशेषता है, जिसमें एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स में कोलेजन, प्रोटियोग्लिकन और अन्य ग्लाइकोप्रोटीन28,29की अलग-अलग मात्रा होती है। कम कोशिकाओं के परिणामस्वरूप ऊतक की मात्रा प्रति कम आरएनए (मात्रा को कम करना) और आरएनए (शुद्धता को कम करने)25,30के साथ सह-शुद्धि में अधिक प्रोटीन परिणाम होता है। आरएनए शुद्धता स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता हैजहां एक260:एक280 और एक260:<1.5 के230 मूल्यों कार्बनिक प्रदूषकों की उपस्थिति (जैसे, प्रोटीन) और ~ 2.0 के मूल्यों शुद्ध आरएनए31को प्रतिबिंबित करते हैं। आरएनए अखंडता गिरावट के स्तर को दर्शाती है, चाहे वह प्रयोगात्मक स्थितियों (यानी, बाल काटने वाली ताकतों) के कारण हो या एंजाइमेटिक पाचन (जैसे, नाभिक) द्वारा, और अक्सर इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण द्वारा निर्धारित की जाती है। 1 का आरएनए इंटीग्रिटी नंबर (आरआईआर) अवक्रमित आरएनए को दर्शाता है और 10 की रिन अक्षुण्ण आरएनए31, 32को दर्शाती है। आरएनए-अनुक्रमण के लिए, 7 की न्यूनतम आरआईएन अक्सर33, 34,35की सिफारिश की जाती है। तालिका 1 में प्रस्तुत आंकड़ों से पता चलता है कि इन एक२६०:एक२८०, एक२६०:एक२३०,और RIN थ्रेसहोल्ड उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए समूह में रोगी के नमूनों से सभी ऊतकों में मिले थे कम गुणवत्ता आरएनए समूह में रोगी के नमूनों की तुलना में, कुछ एक२६०के अलावा:एक२३० मान, जो कम सेल, उच्च मैट्रिक्स ऊतकों में आरएनए के प्रोटीन संदूषण को प्रतिबिंबित कर सकते हैं । जबकि वहां कई कारक है कि आरएनए की गुणवत्ता के लिए योगदान हो सकता है एक दिया रोगी के नमूने से अलग कर रहे हैं, उनमें से रोग गंभीरता का स्तर हो सकता है । ओए ऊतकों की रोगग्रस्त प्रकृति से पता चलता है कि नीची प्रक्रियाएं एंजाइमों के बढ़े हुए स्तरों के माध्यम से होती हैं जो ऊतकों को पचा सकती हैं, लेकिन आरएनए भी, जिससे गुणवत्ता कम हो जाती है।

आरएनए निष्कर्षण के लिए इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्राथमिक मानव ओए ऊतकों से आरएनए मात्रा और गुणवत्ता को अधिकतम करना है। सबसे महत्वपूर्ण कदम इस बात से संबंधित था कि ऊतकों को स्पंदित या समरूप होने से विघटित किया गया था, और यह ऊतक सेलुलरिटी और मैट्रिक्स संरचना के साथ सहसंबंधित पाया गया था। प्रारंभ में, सभी सात ऊतकों को एक ही प्रोटोकॉल के अधीन किया गया था जहां ऊतकों को पहले तरल नाइट्रोजन का उपयोग करके मोर्टार और मूसल द्वारा पल्वराइज्ड किया गया था, फिर एसिड-ग्वानिडिनियम-फिनोल समाधान में स्थानांतरित कर दिया गया था, और हाथ से आयोजित ऊतक समरूपता का उपयोग करके आगे समरूप किया गया था। इस विधि ने वसा पैड, एसीएल, सिनोवियम और वीएमओ (सामूहिक रूप से नरम ऊतकों; अपेक्षाकृत उच्च कोशिका, कम मैट्रिक्स) के लिए अनुकूल आरएनए उपज, शुद्धता और अखंडता का उत्पादन किया, लेकिन उपास्थि, हड्डी और मेनिस्कस (सामूहिक रूप से कठोर ऊतक; निम्न-कोशिका, उच्च मैट्रिक्स) के लिए प्रतिकूल परिणाम। इन टिप्पणियों के आधार पर, सात ऊतकों को आगे प्रोटोकॉल शोधन के लिए दो समूहों में विभाजित किया गया था। यह देखा गया कि अतिरिक्त समरूपता का कठोर ऊतकों को और अधिक विघटित करने के बाद उन्हें ठीक पाउडर में विभाजित करने पर न्यूनतम प्रभाव पड़ा । इसके विपरीत, नरम ऊतकों का वियोजन सफलतापूर्वक अकेले समरूपता के साथ हासिल किया गया था और इसे पल्वराइजेशन की आवश्यकता नहीं थी। इसलिए, कठोर ऊतकों का समरूपता और नरम ऊतकों का स्पंदन समाप्त हो गया था। यह कतरनी बलों को कम करने, प्रसंस्करण समय और तापमान में उतार-चढ़ाव के लिए फायदेमंद था, जिनमें से सभी आरएनए अखंडता में सुधार कर सकते हैं। सभी सात ऊतकों के लिए फिनोल/क्लोरोफॉर्म चरण पृथक्करण के दो दौर किए गए थे, क्योंकि इससे उपज31को कम किए बिना आरएनए शुद्धता में सुधार की सूचना दी गई है ।

इस प्रोटोकॉल की एक संभावित सीमा बैच प्रभाव है जो ऊतकों को दो समूहों में अलग करने से उत्पन्न हो सकता है यदि प्रयोगात्मक डिजाइन को सभी ऊतकों के बीच तुलना की आवश्यकता होती है। पल्वराइजेशन बनाम समरूपता विधियों का उपयोग तकनीकी (जैसे, प्रसंस्करण समय) और पर्यावरण (जैसे, तापमान में उतार-चढ़ाव) की स्थिति को बदल सकता है जो परिवर्तनशीलता36को पेश कर सकते हैं। एक दूसरी सीमा के भीतर और विषयों में ऊतकों की पहचान, विच्छेदन, और उन्मुख (हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग के लिए) में संभावित विसंगति है । एक तीसरी सीमा वर्तमान रिपोर्ट में रोगी रोग गंभीरता और आरएनए गुणवत्ता के बीच संभावित सहसंबंधों की पुष्टि करने में हमारी असमर्थता है । एक चौथी सीमा तुलना के लिए स्वस्थ नियंत्रण ऊतकों की उपलब्धता की कमी है। हालांकि नियंत्रण नमूने शवों से उपलब्ध हो सकते हैं, ये TKA से OA ऊतकों की तुलना में कम आसानी से उपलब्ध हैं । इसे दरकिनार करने के लिए एक प्रयोगात्मक रणनीति प्रत्येक विषय को अपने नियंत्रण के रूप में उपयोग करना है, चाहे ऊतकों में तुलना करना हो या ऊतकों के भीतर उपचार की तुलना संरक्षित क्षेत्रों में नियंत्रण या घाव के लिए। अंत में, आरएनए निष्कर्षण के लिए ऊतक एक्सप्लांट का उपयोग करने से व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति नहीं मिलती है जिसमें ऊतक (उदाहरण के लिए, सिनोवियल फाइब्रोब्लास्ट बनाम सिनोवियल मैक्रोफेज37)शामिल हैं।

नोट की गई सीमाओं के बावजूद, प्राथमिक मानव ओए ऊतक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन हैं, जो सेल आला23को संरक्षित करने सहित ओए के लिए अन्य प्रयोगात्मक प्रणालियों पर लाभ प्रदान करते हैं। हालांकि, प्राथमिक मानव ओए ऊतकों को रसद या तकनीकी चुनौतियों के कारण अनुसंधान में कम उपयोग किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल टीकेए से प्राप्त नमूनों के उपयोग का समर्थन करने के लिए रोगी चयन, नमूना प्रसंस्करण, ऊतक समरूपता, आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता नियंत्रण का वर्णन करता है। नमूना प्रसंस्करण के बाद, कई प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों को आगे बढ़ाया जा सकता है, जिनमें जीन अभिव्यक्ति और हिसटोलॉजी शामिल हैं। तेजी से विकसित हो रहे ओमिक्स क्षेत्र के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक आरएनए-अनुक्रमण38, 39जैसे अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त मात्रा में उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को अलग करने की क्षमता है। आणविक प्रोफाइल की तुलना विशिष्ट रोग फेनोटाइप (उदाहरण के लिए, उम्र, लिंग और अन्य ओए जोखिम कारकों के आधार पर) वाले विषयों से ऊतकों के भीतर और पार की जा सकती है। प्राप्त अंतर्दृष्टि नए चिकित्सीय रास्ते है कि और अधिक आसानी से OA रोगी आबादी को वापस अनुवाद किया जा सकता है सूचित कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक अध्ययन प्रतिभागियों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने इस शोध को संभव बनाया और ऑस्टियोआर्थराइटिस क्षेत्र में नए वैज्ञानिकों को इस रिपोर्ट को समर्पित किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

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References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
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जीव विज्ञान अंक 173
मानव ऑस्टियोआर्थ्रिटिक घुटने संयुक्त से ऊतक संग्रह और आरएनए निष्कर्षण
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Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

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