Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vevsinnsamling og RNA-ekstraksjon fra den humane osteoarthritic kneleddet

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62718
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Summary

Primærvev hentet fra pasienter etter total kneartegikt gir en eksperimentell modell for slitasjegiktforskning med maksimal klinisk overførbarhet. Denne protokollen beskriver hvordan du identifiserer, behandler og isolerer RNA fra syv unike knevev for å støtte mekanistisk undersøkelse i human slitasjegikt.

Abstract

Slitasjegikt (OA) er en kronisk og degenerativ leddsykdom som oftest påvirker kneet. Siden det for tiden ikke finnes noen kur, er total kneartrosgistikk (TKA) et vanlig kirurgisk inngrep. Eksperimenter ved hjelp av primære menneskelige OA vev hentet fra TKA gir evnen til å undersøke sykdomsmekanismer ex vivo. Mens OA tidligere ble antatt å påvirke hovedsakelig brusk, er det nå kjent å påvirke flere vev i leddet. Denne protokollen beskriver pasientvalg, prøvebehandling, vevshomogenisering, RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll (basert på RNA-renhet, integritet og utbytte) fra hvert av syv unike vev for å støtte sykdomsmekanismeundersøkelse i kneleddet. Med informert samtykke ble det innhentet prøver fra pasienter som gjennomgikk TKA for OA. Vev ble dissekert, vasket og lagret innen 4 timer etter operasjonen ved flashfrysing for RNA eller formalinfiksering for histologi. Samlet vev inkluderte leddbrusk, subkondral bein, menisk, infrapatellar fettpute, fremre korsbånd, synovium og vastus medialis skrå muskel. RNA-ekstraksjonsprotokoller ble testet for hver vevstype. Den viktigste modifikasjonen involverte metoden for oppløsning som brukes til lavcellet, høymatrise, hardt vev (betraktet som brusk, bein og menisk) versus relativt høy celle, lavmatrise, bløtvev (betraktet som fettpute, ligament, synovium og muskel). Det ble funnet at pulverisering var egnet for hardt vev, og homogenisering var egnet for bløtvev. En proclivity for noen å gi høyere RNA integritet nummer (RIN) verdier enn andre forsøkspersoner konsekvent på tvers av flere vev ble observert, noe som tyder på at underliggende faktorer som sykdom alvorlighetsgrad kan påvirke RNA kvalitet. Evnen til å isolere RNA av høy kvalitet fra primært humant OA-vev gir en fysiologisk relevant modell for sofistikerte genuttrykksforsøk, inkludert sekvensering, som kan føre til klinisk innsikt som lettere oversettes til pasienter.

Introduction

Kneet er det største synovialleddet i menneskekroppen, som består av tibiofemoralleddet mellom tibia og lårbenet og patellofemoralleddet mellom patella oglårbenet 1. Beinene i kneet er foret med leddbrusk og støttes av ulike bindevev, inkludert menisci, fett, leddbånd og muskler, og en synovialmembran innkapsler hele leddet for å skape et synovial væskefylt hulrom1,2,3 ( figur1). Et sunt kne fungerer som en mobil hengselledd som tillater friksjonsfri bevegelse i frontplan1,3. Under patologiske forhold kan bevegelse bli begrenset og smertefull. Den vanligste degenerative kneleddsykdommen er slitasjegikt (OA)4. En rekke risikofaktorer er kjent for å predisponere for OA-utvikling, inkludert eldre alder, fedme, kvinnelig kjønn, leddtraumer og genetikk, blant annet5,6. Det er for tiden anslagsvis 14 millioner mennesker i USA med symptomatisk kne OA, med utbredelsen økende på grunn av økende befolkningsalder og fedme7,8. Opprinnelig ansett for å være en sykdom i brusk, OA er nå forstått som en sykdom i hele ledd9. Ofte observerte patologiske endringer i OA inkluderer leddbrusk erosjon, osteofyttdannelse, subkondral benfortykning og betennelse i synovium9,10. Siden det ikke er noen kjent kur for OA, fokuserer behandlinger primært på symptom (f.eks. smerte) ledelse11,12, og når OA har utviklet seg til sluttfasen, er felles erstatningskirurgi ofte indikert13.

Felles erstatningsoperasjoner kan enten være delvise eller totale kneutskiftninger, med total kneartrosgistikk (TKA), inkludert utskifting av hele tibiofemoral artikulasjon og patellofemoral ledd. Fra og med 2020 utføres ca. 1 million TBA-er i USA hvert år14. Under TKA resects en ortopedisk kirurg den øvre delen av tibial platået og de nedre femoral condyles (Figur 2A, 2B) som skal utstyres med proteseimplantater. Noen ganger feiltolket av pasienter, i en TKA, blir bare 8-10 mm resected fra slutten av hvert bein, som senere er avkortet eller gjenoppstått, med metall. En interposed polyetylenforing danner lageroverflaten (dvs. polstring) mellom de to metallimplantatene. I tillegg er flere bløtvevskomponenter i leddet helt eller delvis utskilt for å oppnå riktig leddbalanse. Blant disse vevene er medial og lateral menisci (Figur 2C), infrapatellar fettpute (Figur 2D), fremre korsbånd (ACL; Figur 2E), synovium (figur 2F) og vastus medialis skrå muskel (VMO; Figur 2G) 15. Selv om TBA-er generelt er vellykkede for OA-behandling, rapporterer rundt 20% av pasientene tilbakefall av smerte etter operasjonen16. Sammen med den høye prisen og den relative invasiviteten i prosedyren, peker disse begrensningene på behovet for videre forskning for å identifisere alternative behandlinger for å redusere progresjonen av OA.

For å utforske sykdomsmekanismer i OA som kan presentere nye veier for terapeutisk inngrep, kan eksperimentelle systemer, inkludert celler, vevsutløp og dyremodeller brukes. Celler dyrkes vanligvis i monolayer og er avledet fra primær menneskelig eller animalsk vev (f.eks. kondrocytter isolert fra brusk) eller udødelige celler (f.eks. ATDC517 og CHON-00118). Mens celler kan være nyttige for å manipulere eksperimentelle variabler i et kontrollert kulturmiljø, fanger de ikke opp forholdene til det naturlige leddet som er kjent for å påvirke cellefenotyper19. For bedre å rekapitulere den komplekse kaskaden av kjemisk, mekanisk og celle-til-celle kommunikasjon underliggende OA, finnes et alternativ i primære menneskelige eller dyrevevsprøver, enten det brukes frisk eller kultivert ex vivo som explants, for å bevare vevsstruktur og cellemikromiljøet20. For å studere felles in vivo, er små (f.eks. mus21) og store (f.eks. hest22) dyremodeller for OA (f.eks. gjennom kirurgisk induksjon, genetisk endring eller aldring) også nyttige. Oversettelse fra disse modellene til menneskelig sykdom kan imidlertid begrenses av anatomiske, fysiologiske og metabolske forskjeller, blant annet23. Tatt i betraktning fordelene og ulempene ved eksperimentelle systemer, maksimerer de viktigste styrkene ved å være artsspesifikke og opprettholde den ekstracellulære nisjen som tilbys av det primære menneskelige OA-vevet, det translasjonelle potensialet til forskningsfunn.

Primært humant OA-vev kan lett oppnås etter TKA, noe som gjør høy frekvens av TKAer til en verdifull ressurs for forskning. Blant potensielle eksperimentelle anvendelser er genuttrykk og histologiske analyser. For å realisere potensialet i primært humant OA-vev for disse forskningsmetodene og andre, er skissert følgende viktige hensyn. For det første er bruk av pasientprøver underlagt etisk regulering, og protokoller må oppfylle IRB-godkjenninger (Institutional Review Board)24. For det andre skaper den iboende heterogeniteten til humant primærsykdommet vev og påvirkning av variabler som alder og kjønn blant annet behovet for nøye pasientvalg (dvs. anvendelse av kvalifikasjonskriterier) og datatolkning. For det tredje kan de unike biologiske egenskapene til forskjellige vev i leddet (f.eks. lav cellulæritet av brusk og menisk25) by på utfordringer under eksperimenter (f.eks. isolere høy kvalitet og mengde RNA). Denne rapporten tar for seg disse hensynene og presenterer en protokoll for pasientvalg, prøvebehandling, vevshomogenisering, RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll (dvs. vurdering av RNA-renhet og integritet; Figur 3) å oppmuntre til bruk av primært humant OA-vev i forskningsmiljøet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studieprotokollen ble godkjent og fulgt av Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).

1. Pasientvalg

  1. Identifiser pasientene blant de som er planlagt å gjennomgå TKA med en ortopedisk kirurg.
  2. Velg pasientene basert på kvalifikasjonskriteriene som er definert av studieprotokollen. Eksempler på inklusjonskriterier inkluderer å være 18 år eller eldre og ha en bekreftet diagnose av kne slitasjegikt. Eksempler på eksklusjonskriterier inkluderer delvis kneprotese eller å ha en bekreftet diagnose av revmatoid artritt.
  3. Kontakt pasientene for å få informert samtykke før operasjonen.

2. Prøvebehandling (for RNA)

MERK: Utfør all vevsbehandling i et biosikkerhetsskap i klasse II og følg sterile teknikker. Bruk alltid egnet verneutstyr (nitrilhansker, labfrakk, vernebriller) ved behandling av menneskelige prøver. Flere beinfragmenter produseres under TKA, en stor mengde ben/brusk vil potensielt være tilgjengelig for disseksjon. På grunn av sykdomsprogresjon kan leddbrusk degenerasjon være mer alvorlig på noen bendeler, som kan tas med i eksperimentell design. Bare vev som krever elektrokauteri for reseksjon har termisk kantskade, og en samordnet kirurgisk innsats er gjort for å skaffe de fleste vev med en skalpell for å minimere skade. Resected vev må holdes hydrert til enhver tid med steril PBS.

  1. Desinfiser alle arbeidsflater og utstyr med 70% etanol, RNase dekontaminant, DEPC-behandlet vann og igjen med 70% etanol. Tørk bort gjenværende væske med rent, lofritt vev. Tang, beinkuttere og skalpeller er enten autoklavede eller gjennomvåt i 70% etanol i minst 10 minutter før bruk. Oppbevar utstyret nedsenket i 70 % etanol når det ikke er i umiddelbar bruk.
  2. Forhåndsetikett minst tre kryolater med av-identifisert prøvenavn og aliquot-nummer for hvert vev (f.eks. TKA-1 brusk 1).
    1. Identifiser hver vevstype fra prøven basert på forskjellene i størrelse, form, farge og tekstur som vist og beskrevet i figur 2. Identifiser brusk (figur 2A-pil), bein (figur 2B-pil), menisk (figur 2C), infrapatellarfettpute (figur 2D), fremre korsbånd (figur 2E), synovium (figur 2F) og de enorme medialis skråmuskulaturen (Figur 2G).
  3. Isoler leddbrusk.
    1. Velg en bendel med minimal bruskforringelse.
    2. Bruk en No.10-skalpell, skjær gjennom bruskdybden så langt som mulig for å dissekere hele tykkelsen på brusklaget.
      MERK: En No.10 skalpell vil bare trenge inn i brusk, ikke bein.
    3. Bruk full tykkelse på brusk, disseker tre 5 mm terninger.
  4. Isoler subkondralbenet.
    1. Bruk samme benseksjon som brusk ble samlet inn fra.
    2. Bruk en No.10 skalpell, skrap eventuell gjenværende brusk og gjenværende vev fra beinoverflaten.
    3. Hold bendelen som skal kuttes med tang og bruk beinkutterne til å kutte tre 5 mm terninger.
  5. Isoler menisken.
    1. Identifiser en relativt uskadet del av enten medial eller lateral menisk.
    2. Bruk en No.10 skalpell og tang, disseker tre 5 mm kuber.
  6. Isoler den infrapatellar fettputen.
    1. Bruk en No.10 skalpell og tang, kutt den gule delen av vevet i tre like store og homogene porsjoner (~ 500 mg hver).
  7. Isoler det fremre korsbåndet (ACL).
    1. Bruk en No.10 skalpell og tang, disseker tre 5 mm kuber.
  8. Isoler synoviumet.
    1. Ved hjelp av en No.10 skalpell og tang, isolere den rosa cellulære delen av membranen så mye som mulig ved å skrape bort fettvev.
    2. Disseker tre like store og homogene porsjoner (~200 mg hver).
  9. Isoler de enorme medialis skrå muskelen (VMO).
    1. Bruk en No.10 skalpell og tang, fjern eventuelt fettvev fra prøven, og la bare det røde muskelvevet.
    2. Disseker tre 5 mm kuber.
      MERK: Den opprinnelige størrelsen på vevet begrenser størrelsen på delene.
  10. Skyll vevsdelene med steril PBS for å fjerne rester eller rusk.
  11. For å utføre histologi, fikse hver vevsdel som beskrevet i del 3.
  12. For å utføre RNA-ekstraksjon, kutt hver av de tre vevsdelene i mindre biter (~ 1-2 mm   terninger).
    1. Overfør de mindre delene til en 2 ml kryo toårig, sikre hettene tett, blitsfrysing ved å senke ned i flytende nitrogen i 30 s, og overfør deretter til en -80 °C fryser for langtidslagring (opptil 4 måneder testet i gjeldende protokoll). Gjenta dette for alle aliquots av alle vev.
    2. Fortsett til Vev homogenisering som beskrevet i Del 4.

3. Prøvebehandling (for histologi)

FORSIKTIG: Formalin er et farlig kjemikalie som kun brukes i en kjemisk avtrekkshette.

  1. Fyll forhåndsmerkede 15 ml koniske rør med 10% formalinløsning.
  2. Bruk tang, overfør vevsdelen til de formalinfylte rørene.
  3. Fest vevet i formalin i 1 uke ved romtemperatur mens du rister / agiterer om mulig.
  4. Etter 1 uke, kast formalinet i riktig kjemisk avfallshåndtering, skyll vevet med PBS, og overfør deretter til et friskt 15 ml konisk rør som inneholder 70% etanol for langvarig lagring ved 4 °C til prøver er innebygd for seksjonering.
    MERK: Kun for ben/brusk, utfør avkalking som følger.
  5. Etter 1 uke, kast formalinet i riktig kjemisk avfallshåndtering, og skyll vevet med PBS.
  6. Overfør vevet til et 50 ml konisk rør med 45 ml 10 % EDTA-oppløsning (pH 7,4).
  7. Hvis risting/agitasjon ikke er mulig, snu rørene 10-15 ganger én gang daglig.
  8. Kast og skift ut EDTA-oppløsningen én gang i uken.
    1. To ganger i uken tester du teksturen med et instrument (dvs. slikkepott) eller hanskefinger for å bekrefte avkalking ved å observere deformasjon når trykket påføres. Tiden det tar å avkalke beinvev vil variere mellom prøver fra 4-6 uker.
  9. Når det er avkalket, skyll vevet med PBS og overfør til et friskt 15 ml konisk rør som inneholder 70% etanol for langvarig lagring ved 4 °C til prøver er innebygd for seksjonering.

4. Vev homogenisering

FORSIKTIG: Protokollen bruker farlig kjemisk fenol. Arbeid med fenol må utføres i en kjemisk avtrekkshette.

MERK: Rengjør alt utstyr og overflater som skal brukes med 70 % etanol (bløtlegg i minst 10 minutter), etterfulgt av RNase dekontaminant (suge i minst 10 min), skyll med DEPC-behandlet vann, tørk med et rent, lofritt papirhåndkle, og deretter respray eller suge med 70% etanol.

  1. Homogenisering av hardt vev (leddbrusk, subkondralben, menisk)
    1. Før homogenisering, avkjøl mørtel, pestle og spatel ved hjelp av flytende nitrogen. Disse må holdes så kalde som mulig for å forhindre prøve tining.
    2. Behandle prøvene en om gangen, og hold de andre prøvene ved -80 °C til de brukes.
    3. Overfør vevsprøven til mørtel ved hjelp av en kjølt spatel; Hell ekstra flytende nitrogen på toppen av vevet og la det fordampe. Knus vevet ved hjelp av pestle. Tilsett gjentatte ganger mer flytende nitrogen til vevsprøven, la det fordampe, og fortsett deretter sliping med pestle for å lage et fint pulver.
    4. Etter å ha pulverisert vevet så mye som mulig, overfør til et forhåndskjølt 1,5 ml mikrosenterrør.
      1. Forkjøl rør ved å senke ned i flytende nitrogen i 30 s før vevsoverføring.
    5. Tilsett 1 ml av den syre-guanidinium-fenoloppløsningen til hvert rør og hold den på is.
    6. Gjenta trinn 4.1.3-4.1.5 for hver harde vevsprøve.
    7. Etter hvert vev, rengjør mørtel, pestle og spatel med 70% etanol, RNase dekontaminant, DEPC-behandlet vann og en ekstra suge i 70% etanol. Tørk eventuell gjenværende væske med et rent, lofritt vev.
    8. Inkuber prøvene på is i ytterligere 20 minutter.
  2. Homogenisering av bløtvev (infrapatellar fettpute, ACL, synovium, VMO)
    1. Desinfiser homogenisatoren ved å kjøre rør med 70% etanol, RNase dekontaminant, DEPC-behandlet vann og ytterligere 70% etanolvask, hver i 30 s. Tørk eventuell gjenværende væske med et rent, lofritt vev. Gjenta dette mellom hver prøve.
    2. Forhåndsetikett 5 ml runde bunnrør for hver prøve. Tilsett 1 ml av syre-guanidinium-fenoloppløsningen til hvert rør.
      1. Arbeid på en prøve om gangen, og hold andre prøver som skal behandles ved -80 °C til bruk.
    3. Overfør vevet til et forhåndsmerket 5 ml rør med syre-guanidinium-fenol.
    4. Homogeniser vevet i 30 s pulser, hold på is under og mellom pulser. Gjenta til vevet er visuelt oppløst eller i maksimalt fem 30 s pulser.
      MERK: Noen fibrøse vev (dvs. muskler) kan ikke homogeniseres grundig.
    5. Inkuber oppløst vev på is og flytt til neste prøve.
      1. Rengjør homogenisatoren som beskrevet i trinn 4.2.1. Sørg for at vevsbiter ikke forblir i sondens tenner; fjernes med sterile tang om nødvendig.
    6. Etter homogenisering av alle prøvene, inkuber på is i syre-guanidinium-fenol i ytterligere 20 min.
    7. Overfør prøvene fra runde bunnrør til forhåndsmerkede og forhåndskjølte 1,5 ml mikrosenterrør.

5. RNA-ekstraksjon fra vev

FORSIKTIG: Denne protokollen bruker farlige kjemikalier som fenol, kloroform og isopropanol. Utfør alt arbeidet i en kjemisk avtrekkshette.

MERK: Utstyr og reagenser er kun reservert for RNA-arbeid og må ha riktig kjemisk karakter for molekylære bruksområder (dvs. sterile, nukleasefrie). Denne protokollen etterfølger både Parts 4.1 og 4.2 vev homogenisering protokoller. Rengjør alt utstyr og overflater som skal brukes med 70% etanol (suge i minst 10 min), etterfulgt av RNase dekontaminant (suge i minst 10 min). Skyll med DEPC-behandlet vann, tørk av restvæsken med et rent, lofritt papirhåndkle, og respray eller suge med 70% etanol.

  1. Sentrifuger mikrocentrifugerørene ved 10000 x g i 10 minutter ved 4 °C for å pellets ruskene.
  2. Overfør supernatanten til et friskt 1,5 ml mikrosenterrør.
    MERK: For fettvev vil et lipidlag noen ganger være til stede på toppen. Unngå å overføre dette ved å piercing laget på siden av røret med en pipettespiss.
  3. Tilsett 200 μL kloroform per 1 ml av syre-guanidinium-fenoloppløsningen til hver prøve. Rist rørene kraftig for hånd i 30 s å blande. Deretter inkuberer du på is i 2 min.
  4. Sentrifugeprøver ved 10000 x g i 12 min ved 4 °C.
    MERK: Etter sentrifugering vil tre lag ha dannet seg: en vandig fase som inneholder RNA, en hvit DNA-interfase og en rosa proteinfase nederst.
  5. Overfør ~500 μL av den øvre, vandige fasen til et friskt 1,5 ml mikrosenterrør.
    MERK: Ikke forstyrr interfasen og proteinfraksjonene. Oppbevar disse fasene ved -80 °C for fremtidig DNA- eller proteinisolasjon.
  6. Tilsett et likt volum syre-guanidinium-fenoloppløsning til den overførte vandige fasen, bland ved å invertere røret 8-10 ganger. Inkuber røret på is i 20 min.
  7. Tilsett 200 μL kloroform per 1 ml av syre-guanidinium-fenoloppløsningen til hver prøve. Rist kraftig for hånd i 30 s for å blande og deretter inkubere på is i 2 min.
  8. Sentrifugeprøver ved 10000 x g i 12 min ved 4 °C.
  9. Overfør < 500 μL av den vandige fasen til et friskt mikrosenterrør, forsiktig så du ikke forurenser prøven med de andre fasene.
    FORSIKTIG: Kast de resterende fasene med passende metoder for avhending av farlig materiale.
  10. Legg til et likt volum (som vandig fase) på 100 % isopropanol i hver prøve. Bland ved å invertere røret 8-10 ganger. Inkuber på is i 5 min.
    1. Tilsett 1 μL glykogenkoprecipitant i hver prøve for å hjelpe til med å finne RNA-pellet etter sentrifugering.
  11. Sentrifuger prøvene ved 12000 x g i 25 min ved 4 °C.
  12. Finn pelletsen i røret (hvis du bruker coprecipitant, vil den se blå ut). Hell forsiktig av supernatanten.
  13. Vask pelletsen ved å tilsette 1 ml iskald 75% etanol til hver prøve, virvel for å løsne pellet fra bunnen av røret.
    MERK: Forbered 75% etanol ved hjelp av molekylært rent etanol og nukleasefritt vann.
  14. Sentrifuge ved 7000 x g i 5 min ved 4 °C. Hell forsiktig av supernatanten.
  15. Gjenta trinn 5.13 og 5.14 to ganger til.
  16. Rask spinn (<2000 x g i 5 s) for å bringe eventuell gjenværende væske til bunnen av røret. Bruk en P20 pipette for å fjerne eventuell gjenværende etanol fra bunnen av rørene.
    1. Unngå å berøre RNA-pelletsen med en pipettespiss. Endre tips mellom eksempler.
  17. Med rørhetter åpne, lufttørke prøver ved romtemperatur i 10 min.
    MERK: Pellet kan bli gjennomskinnelig når det tørker. Å sikre at alt gjenværende etanol har fordampet vil forbedre RNA-renhet.
  18. Tilsett 25 μL nukleasefritt vann til hvert rør for å oppløse pelletsen.
  19. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
  20. Rør forsiktig opp og ned for å blande RNA.
  21. Aliquot 5 μL av prøven i et friskt rør for kvalitetskontrollanalyse (Del 6). Oppbevar de resterende 20 μL ved -80 °C for genuttrykksanalyser.

6. Kvalitetskontroll

  1. Bestem konsentrasjonen og renheten til RNA ved hjelp av et spektrofotometer i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Bestem RNA-integriteten ved hjelp av en elektroforeseenhet i henhold til produsentens instruksjoner.
    MERK: Fortynn RNA for å være innenfor rekkevidden til brikkedeteksjonsgrensene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Syv unike leddvev i kneet er tilgjengelig for innsamling fra pasienter som gjennomgår TKA for OA (figur 1). I denne protokollen ble hvert av disse vevene identifisert og behandlet innen 4 timer etter kirurgisk fjerning (figur 2). Etter trinnene som er beskrevet i figur 3, ble deler av hvert vev formalin-fikset for histologisk vurdering (figur 4), mens andre porsjoner ble flash-frosset for RNA-isolasjon. Separering av harde vev fra bløtvev ved oppløsningsmetode (henholdsvis pulverisering versus homogenisering), RNA med høy integritet og renhet ble ekstrahert fra hver vevstype, med representative resultater vist i tabell 1 (Kolonner av høy kvalitet). Spesielt ga noen RNA av lavere kvalitet på tvers av flere vev (Tabell 1, Kolonner av lav kvalitet), noe som tyder på at til tross for en optimalisert metode, kan eksterne faktorer (f.eks. sykdomsgrad) påvirke RNA-kvaliteten på tvers av vevstyper.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for det menneskelige kneleddet som viser et lateralt tverrsnitt. Hvert av de syv merkede vevene samles inn under TKA og brukes til forskningsformål som beskrevet i denne protokollen. VMO = vastus medialis skrå muskel. Bilde åpnet og modifisert fra OpenStax College under en creative commons lisens26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative bruttobilder for hvert av de syv vevene som er oppnådd fra pasienter som gjennomgår TKA. (A) Fremre lårben kuttet med pil som peker på leddbrusk som skal samles. Brusk er identifisert av et hvitt lag som finnes på overflaten av beinet. (B) Fremre lårben kuttet med pil som peker mot subkondralben som skal samles. (C) Menisk. Unngå å samle inn brente seksjoner forårsaket av elektrocauterisering under TKA. (D) Infrapatellar fettpute (gul i fargen). (E) Fremre korsbånd (hvit, fibrøst, svampete vev). (F) Synovium. Den ene siden vil virke lyse og fibrøse, ofte inneholder fettvev, mens motsatt side vil virke rosa og mindre fibrøst. Den rosa siden av membranen inneholder synovialfôret. (G) Vastus medialis skrå muskel (rød). Dette kan ofte være den minste vevsdelen og kan inneholde noe fettvev. Skalastang = 2 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Oversikt over tiltak for å samle inn primært humant OA-vev for histologi og RNA. Denne protokollen beskriver pasientvalg, prøvebehandling for histologi og RNA, vevshomogenisering for harde vev og bløtvev, RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll for syv primære OA-vev i det menneskelige kneet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Histologiske seksjoner for hvert av de syv vevene som er oppnådd fra pasienter som gjennomgår TKA. Hematoksylin og eosinfargede seksjoner vises ved 6x forstørrelse i panelene A-F med innfelt forstørret til 40x i panelene A'-F' og A". (A, A') Leddbrusk; (A, A") subkondralben; (B, B ') menisk; (C, C ') infrapatellar fett pute; (D, D ') fremre korsbånd; (E, E') synovium; (F, F ') vastus medialis skrå muskel. Skalastenger = 400 μm for A-F og 50 μm for A'-F' og A". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vev N RIN [RNA] (ng/μL) i 25 μL A260:A280 A260:A230
Høy kvalitet Lav kvalitet Høy kvalitet Lav kvalitet Høy kvalitet Lav kvalitet Høy kvalitet Lav kvalitet Høy kvalitet Lav kvalitet
"Hardt vev"
Leddbrusk 10 4 7.0 ± 0,8 1.3 ± 1.2 135
(36-243)		 46
(26-78)		 1,80 ± 0,09 1.47 ± 0,34 1,40 ± 0,36 0,45 ± 0,26
Subkondralben 10 4 7.8 ± 0,6 3.6 ± 1.1 514
(181-1586)		 342
(122-769)		 1,96 ± 0,05 1,90 ± 0,17 1,72 ± 0,27 1.12 ± 0,62
Menisk 10 4 7.5 ± 0,6 2.4 ± 0,3 242
(38-1629)		 95
(60-318)		 1,91 ± 0,05 1,71 ± 0,15 1.41 ± 0,47 0,77 ± 0,59
"Bløtvev"
Infrapatellar fett pute 10 3 8,5 ± 0,6 6.1 ± 1.4 1905
(668-5100)		 1151
(381-2306)		 1,99 ± 0,01 2.02 ± 0,03 2.09 ± 0.17 1,47 ± 0,71
Fremre korsbånd 8 3 7.4 ± 0,4 5.2 ± 1.9 1836
(613-8456)		 727
(97-1479)		 1,97 ± 0,03 1.91 ± 0.18 1,88 ± 0,20 1,35 ± 0,70
Synovium 9 3 8,5 ± 0,6 6.2 ± 3.1 2239
(401-4100)		 1897
(902-3366)		 1,99 ± 0,04 2.00 ± 0.03 2.05 ± 0.11 1,91 ± 0,20
Vastus Medialis skrå 9 3 8,5 ± 0,6 8.4 ± 0,7 1002
(377-1715)		 1097
(308-2138)		 1,96 ± 0,03 1,99 ± 0,03 1.82 ± 0.11 1,62 ± 0,27

Tabell 1. Kvalitet og kvantitet av RNA isolert fra OA vev samlet inn fra TKA pasienter. RIN = RNA-integritetsnummer. Data presentert som gjennomsnittlig ± standardavvik for RIN, A260:A280 og A260:A230-forhold og gjennomsnitt (område) for RNA-konsentrasjonsverdier. Prøver av høy kvalitet består av pasienter hvorfra alle vevstyper ga RNA med RIN > 6 (n = 8-10). Prøver av lav kvalitet består av pasienter hvorav flere vevstyper ga RNA med RIN < 6 (n = 3-4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres har vist seg vellykket for å samle syv primære menneskelige OA vev for RNA ekstraksjon (Tabell 1) og histologisk behandling (Figur 4). Før du samler inn pasientprøver, er det nødvendig å etablere en IRB-godkjent protokoll, ideelt i samarbeid med en kirurg eller et kirurgisk team. Bruk av en standardisert protokoll for prøveinnsamling (f.eks. reseksjon fra konsekvente in situ-steder) er avgjørende for å maksimere eksperimentell reproduserbarhet. Vevsprøver bør transporteres til laboratoriet i sterile beholdere og behandles innen 4 timer etter operasjonen for å unngå nedbrytning. Under vevsdisse og prosessering holdes alle vev hydrert i steril PBS og skylles i fersk, steril PBS for å fjerne potensielle overflateforurensninger som biofluider og annet uønsket rusk før de blir flash-frosset for RNA-ekstraksjon eller formalin-fast for histologi. En nyttig anvendelse av histologisk analyse er bekreftelse av vevstypene og sykdommens alvorlighetsgrad siden disse kan preges av cellenummer, distribusjon og morfologi, blant andre faktorer som kan observeres av standard flekker som hematoksylin og eosin (figur 4).

Primært humant OA-vev kan by på utfordringer for å trekke ut RNA av tilstrekkelig kvantitet og kvalitet, som definert av renhet og integritet27. RNA-mengde er en funksjon av vevets generelle cellulæritet, og i kneleddet er det lavcellede, høymatrisevev som brusk, bein og menisk, og relativt høycellet, lavmatrisevev som fettputen, ACL, synovium og VMO. For eksempel er både leddbruskbrusk og menisk fibrocartilage28 preget av lav cellularitet, med den ekstracellulære matrisen som inneholder varierende mengder kollagener, proteoglykaner og andre glykoproteiner28,29. Å ha færre celler resulterer i mindre RNA per volum vev (redusere kvantitet) og har mer protein resulterer i korensing med RNA (redusere renhet)25,30. RNA renhet kan bestemmes av spektrofotometri der A260:A280 og A260:En230 verdier av <1,5 reflekterer tilstedeværelsen av organiske forurensninger (f.eks. protein) og verdier på ~ 2,0 reflekterer ren RNA31. RNA-integritet gjenspeiler nivået av nedbrytning, enten forårsaket av eksperimentelle forhold (dvs. skjærekrefter) eller ved enzymatisk fordøyelse (f.eks. nukleaser), og bestemmes ofte av elektroforetisk analyse. Et RNA-integritetsnummer (RIN) på 1 gjenspeiler degradert RNA og en RIN på 10 gjenspeiler intakt RNA31,32. For RNA-sekvensering anbefales ofte minimum RIN på 733,34,35. Data presentert i tabell 1 viser at disse A260:A280, A260:A230, og RIN terskler ble oppfylt på tvers av alle vev fra pasientprøvene i RNA-gruppen av høy kvalitet sammenlignet med pasientprøver i RNA-gruppen av lav kvalitet, med unntak av noen A260:A230 proteinforurensning av RNA i lavcellede, høymatrisevev. Selv om det er mange faktorer som kan bidra til kvaliteten på RNA isolert fra en gitt pasientprøve, kan blant dem være nivået av sykdomsgrad. Den syke naturen til OA-vev antyder at nedbrytende prosesser forekommer gjennom økte nivåer av enzymer som kan fordøye vev, men også RNA, og dermed redusere kvaliteten.

Denne protokollen for RNA-ekstraksjon tar sikte på å maksimere RNA-kvantitet og kvalitet fra primære menneskelige OA-vev. Det mest kritiske trinnet gjaldt om vevet ble oppløst ved å bli pulverisert eller homogenisert, og dette ble funnet å korrelere med vevets cellulæritet og matrisesammensetning. I utgangspunktet ble alle syv vevene utsatt for samme protokoll der vev først ble pulverisert av mørtel og pestle ved hjelp av flytende nitrogen, deretter overført til syre-guanidinium-fenoloppløsning, og ytterligere homogenisert ved hjelp av en håndholdt vevshomogenisator. Denne metoden produserte gunstig RNA-utbytte, renhet og integritet for fettputen, ACL, synovium og VMO (samlet mykt vev; også relativt høycellet, lavmatrise), men ugunstige resultater for brusk, bein og menisk (kollektivt hardt vev; også lavcellet, høymatrise). Basert på disse observasjonene ble de syv vevene delt inn i to grupper for videre protokollforbedring. Det ble observert at den ekstra homogeniseringen hadde minimal effekt på ytterligere oppløsning av det harde vevet etter at de hadde blitt pulverisert til et fint pulver. Omvendt ble dissosiasjon av bløtvevet vellykket oppnådd med homogenisering alene og krevde ikke pulverisering. Derfor ble homogeniseringen av det harde vevet og pulveriseringen av bløtvevet eliminert. Dette var gunstig for å minimere skjærekrefter, behandlingstid og temperatursvingninger, som alle kan forbedre RNA-integriteten. To runder med fenol/kloroform fase separasjon for alle syv vev ble utført, da dette har blitt rapportert å forbedre RNA renhet uten å redusereutbyttet 31.

En potensiell begrensning av denne protokollen er batcheffekten som kan oppstå ved å skille vevet i to grupper hvis den eksperimentelle designen krever sammenligning mellom alle vev. Bruk av pulverisering versus homogeniseringsmetoder kan endre tekniske (f.eks. behandlingstid) og miljømessige (f.eks. temperatursvingninger) forhold som kan introdusere variasjon36. En annen begrensning er den potensielle inkonsekvensen i å identifisere, dissekere og orientere (for histologisk seksjonering) vevet i og på tvers av. En tredje begrensning er vår manglende evne til å bekrefte potensielle sammenhenger mellom alvorlighetsgraden av pasientsykdommen og RNA-kvaliteten i den aktuelle rapporten. En fjerde begrensning er mangelen på tilgjengelighet av sunt kontrollvev til sammenligning. Selv om kontrollprøver kan være tilgjengelige fra, er disse mindre lett tilgjengelige enn OA-vev fra TKA. En eksperimentell strategi for å omgå dette er å bruke hvert emne som sin egen kontroll, enten det er å gjøre sammenligninger på tvers av vev eller i vev som sammenligner behandling med kontroll eller lesjonert til bevarte områder. Til slutt tillater bruk av vevsekstraksjon ikke genuttrykksanalyse av de enkelte celletypene som utgjør vevet (f.eks. synoviale fibroblaster versus synoviale makrofager37).

Til tross for de nevnte begrensningene er primære menneskelige OA-vev en verdifull ressurs for forskning, og tilbyr fordeler i forhold til andre eksperimentelle systemer for OA, inkludert å bevare cellenisjen23. Imidlertid kan primært humant OA-vev underutnyttes i forskning på grunn av logistiske eller tekniske utfordringer. Denne protokollen beskriver pasientvalg, prøvebehandling, vevshomogenisering, RNA-ekstraksjon og kvalitetskontroll for å støtte bruken av prøvene hentet fra TKA. Etter prøvebehandling kan flere eksperimentelle tilnærminger forfølges, inkludert blant annet genuttrykk og histologi. Mest relevant for det raskt utviklende omics-feltet er evnen til å isolere tilstrekkelige mengder RNA av høy kvalitet for applikasjoner som RNA-sekvensering38,39. Molekylære profiler kan sammenlignes i og på tvers av vev fra personer med spesifikke sykdomsfenotyper (f.eks. basert på alder, kjønn og andre OA-risikofaktorer). Innsikt oppnådd kan informere nye terapeutiske veier som lettere kan oversettes tilbake til OA pasientpopulasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne takker studiedeltakerne som gjorde denne forskningen mulig og dedikerer denne rapporten til nye forskere innen slitasjegikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 05 402 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin Cardinal Health C4320-101 Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific ICN19400290 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific BP2818500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) Fisher Scientific AC327272500 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol Cardinal Health C4305 Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes Thermo Scientific 12-556-003 Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 14 959 53A Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded) Fisher Scientific 10 500 26 Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes Corning 352052 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes Fisher Scientific 12 565 271 Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer Agilent G2939BA For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet General lab equipment
Bone Cutters Fisher Scientific 08 990 Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10) Thermo Scientific 3120032 Sterile, nuclease-free.
EDTA Life Technologies 15-576-028 10% solution with dH2O.
Forceps Any vendor Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant Fisher Scientific AM9516 Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Liquid Nitrogen Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar General lab equipment
Mortar and Pestle Any vendor Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific ND-2000 For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water Fisher Scientific Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile) Gibco 20 012 050 Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips Any vendor Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit Qiagen 217204
Refrigerated Centrifuge 5810R Eppendorf 22625101
RNAlater Thermo Scientific 50 197 8158 Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap Fisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size) Any vendor Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer Pro Scientific 01-01200 Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent Fisher Scientific 15 596 026 Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Tags

Biologi utgave 173
Vevsinnsamling og RNA-ekstraksjon fra den humane osteoarthritic kneleddet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J.,… More

Wilson, T., Kaur, N., Davis, J., Ali, S. A. Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint. J. Vis. Exp. (173), e62718, doi:10.3791/62718 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter