このプロトコルは、細菌性呼吸器疾患の進行を非侵襲的に監視するための簡略化された全身プレチスモグラフィ装置の構築と使用を示しています。
病気の代理動物モデルは、責任ある研究の3Rの対象となります。動物福祉と科学的洞察の両方が新しい技術の利用可能性とともに進歩することを確実にするために、動物モデルの改良が頻繁に再検討されています。この記事では、 簡易全身プレチスモグラフィ(sWBP)を使用して、致命的な呼吸性類鼻疽症のモデルで呼吸不全を非侵襲的に研究します。sWBPは、疾患の経過全体を通してマウスの呼吸を検出する感度を有し、瀕死の関連症状(徐呼吸および低呼吸)を測定し、人道的エンドポイント基準を開発するために使用される可能性がある。
呼吸器疾患の文脈におけるsWBPの利点のいくつかは、宿主の呼気モニタリングが、一次感染組織、すなわち肺の機能不全を評価する際に生理学的測定に最も近いことである。生物学的意義に加えて、sWBPの使用は迅速かつ非侵襲的であり、研究動物のストレスを最小限に抑えます。この研究は、呼吸性類鼻疽のマウスモデルにおける呼吸不全の経過を通して疾患を監視するための社内sWBP装置の使用を実証しています。
呼吸器細菌性病原体は、肺の炎症反応と関連していることが多く、肺の病状を引き起こします1,2。臨床現場では、肺炎の診断には、通常、喀痰、血中酸素飽和度分析、胸部X線などの培養技術が含まれます。これらの手法は小動物感染モデルに変換できますが、マウスでの病気の重症度に関する迅速なリアルタイム分析を表すのは酸素飽和度分析のみです。血中酸素飽和度(SpO2)は、呼吸器疾患研究で疾患の進行を追跡する方法として以前に調査されました。しかし、瀕死のマウスは、緑膿菌モデル3の両方で予想外に高いSpO2測定値を有し、これはおそらくマウスが生理活性を調節することができるため、予測疾患または瀕死性疾患ではない。この目的のために、これまでのところ、マウスの細菌性呼吸器疾患に対するSpO2の診断レベルは見出されていませんでした。
したがって、この研究では、肺機能に対する肺疾患の影響を検出する他の臨床的に関連する方法の使用を、迅速な生理学的測定として調査しました。簡易全身プレチスモグラフィ(sWBP)は、迅速で非侵襲的な生体認証分析として呼吸数と深度を調査する機会を提供します。以前の研究では、実験室でWBP装置を組み立てる方法が実証されています4;しかしながら、そのような研究に示される成分のいくつかは現在市販されていない。さらに、従来のWBPでは、湿度と温度に基づく複雑なデータ収集とデータ処理が必要です5,6。そこで、室温/湿度に毎日校正し、被験者自体の温度/湿度の寄与が測定された呼吸量に影響を与えるかどうかを評価する簡略化されたWBP装置を開発することが決定されました。したがって、現在入手可能な材料を調達する修正されたsWBP装置が作成されました。さらに、この実験室から調達された装置が、マウスの致死性呼吸器類鼻疽のモデル中に疾患進行に関連する呼吸の変化を検出できるかどうかが調査されています。
この作業のために構築されたsWBP装置は、市販の機器とソフトウェアを使用して、アナログ圧力センサーデータをデジタル読み出しに処理しました。圧力センサーは、バルクヘッドコネクタを備えた気密ガラスジャーに取り付けられました。ガラス瓶の利点は、材料の構造的剛性であり、これは瓶の内圧の変化に抵抗し、呼吸のモニタリング中の体積変化の測定に影響を与える。サンプリングチャンバーは、正方形のジャーの2つの平らな面に2つのポートがあり、1つは校正用のルアーコネクタでチャンバーにアクセスし、もう1つは圧力センサーを収納するように設計されています。選択された圧力センサは、圧力の小さな変化のための範囲(25mbarの範囲)を備えた高感度ゲージ圧力トランスデューサを備えています。
このプロトコルは、呼吸性類鼻疱症のマウスモデルを使用して実証されています。バークホルデリア偽マレイ(Bp)は、世界の熱帯地域に関連する疾患である類鼻疽の細菌剤です7。Bpは環境、特に立っている水と湿った土壌の湿った環境で見られ、そこから通常、影響を受けやすい宿主の切り傷/引っかき傷の皮下感染を引き起こします。しかし、Bpは吸入すると感染性もあり、エアロゾル拡散によるバイオテロでの使用に対する潜在的な脅威です。完全に毒性の高いBpはBSL-3実験室での取り扱いが必要ですが、被膜変異株は以前に設計されており、BSL-2で安全に取り扱うことができ、選択剤基準8から除外できます。さらに、Bp 5,9の呼吸器疾患進行を研究するために、呼吸器類鼻疱症の挿管媒介気管内(IMIT)感染モデルが開発されました。この感染モデルを使用して、瀕死のエンドポイントを介した疾患の進行中に発生する呼吸の変化を特徴付けました。
sWBPは、小動物モデルにおける呼吸器感染症の理解を深めるための魅力的なアプローチです。重要なことに、これは非侵襲的なアプローチであるため、感染チャレンジ中に研究動物に過度のストレスを引き起こす重大なリスクはありません。実際、被験者の呼吸を監視する手順は、数分と最小限の被験者の取り扱いを必要とする迅速なテストです。科学的利点は、微生物病原体が疾患中の肺機能にどのように影響するかについての高解像度の理解です。このアプローチは、基礎研究に利益をもたらし、病原体がどのように病気を引き起こすかの理解を促進するだけでなく、新しい治療法が研究対象を呼吸器系の健康状態にどのように回復させるかを理解するための翻訳ユーティリティを提供します。
この原稿では、初期の無気力反応を引き起こす病原体B.シュードマレイの代表的な結果が提供されています。すべての細菌性肺感染症がマウス感染モデルに同じように存在するわけではありません。他の感染モデルに関する以前の経験では、細菌性病原体の肺炎桿菌は、マウスが感染に屈する時点まで、感染後約3日目まで無症候性感染として現れることが示されています11。吸気に対する宿主の需要(すなわち、微小体積)は、所与の疾患が提示する無気力の程度と密接に関連している可能性があると仮定されている。さまざまな細菌性病原体が呼吸器疾患時に肺機能にどのように影響するかを調べるには、今後の研究が必要になります。異なる病原体は、(1)細胞内または細胞外の病原体である傾向、(2)早期/後期低体温応答を引き起こす能力、および(3)病原性決定基の異なるレパートリーの使用の違いを含む、宿主防御を回避するための独自のアプローチを有することが理解される3,12,13。したがって、異なる疾患戦略は、感染中の肺機能と呼吸に独特の影響を与える可能性があります。
このプロトコルで説明されている推奨設定は、sWBP 中に存在する固有の課題に対応するように変更できます。sWBP記録セッション中に経験する一般的な問題の1つは、サンプルチャンバー内での被験者の動きです。前述のように、この動きはベースラインを変更し、呼吸測定の精度に影響を与える可能性があります。デジタルフィルターを使用して、シフトするベースラインを正規化し、小さな動きにもかかわらず実行可能な呼気測定を可能にしました。過度の動きは、ベースライン測定値をゼロ入力の範囲外に押し出す可能性があります。録音は1 mV範囲(チャンネル1設定)で推奨されており、範囲外のデータの損失を回避しながら、プレチスモグラフィのピークを観察するという妥協点を提供します。非常にアクティブな被験者の場合、範囲外の信号が持続しないように、記録範囲を>1 mV延長する必要がある場合があります。
推奨される手順では、環境の湿度/温度変動に対応するために、毎日のキャリブレーション(または各セッション)が必要です。従来のWBPは、環境と被験者5,6の両方の温度/湿度を考慮に入れた複雑な計算を使用します。現在のsWBP装置では、ホストの温度/湿度の影響が校正ソースの測定呼吸量を大きく変化させないことが実証されています。したがって、sWBPにおけるこのアプローチは、ドローボーとフェンの>50年前のアプローチとは根本的に異なります。ここで、sWBPは、ホストからのさらなる補正なしに、測定された呼吸量に圧力変化を直接関連付けます。
研究動物のWBPと臨床WBPを対比することが不可欠です。sWBPによって収集が試みられた生体認証データの種類は、呼吸量と頻度です。このような測定値は、患者が呼吸モニターを口に保持し、気流を監視するデバイスに正常に呼吸する単純な肺活量測定装置を使用して臨床的に収集されます。研究動物における同様の肺活量測定は拘束を必要とし、したがってストレスと呼吸の固有の混乱の一因となります。したがって、単純な肺活量測定は臨床的には機能しますが、研究動物には機能しません。WBPは、残留肺容量などの測定値を含む高度なデータを収集するために、クリニックで不可欠な目的を果たします。そのようなデータは、強制呼気(深い呼気による肺の排出)を含む、被験者がどのように呼吸するかについての指示に従うことができるという文脈でのみ含むことができる。研究動物は、研究者からの呼吸指示に従うことはできません。WBP中に臨床的に収集された高度な測定値の多くは、研究動物では再現できません。研究動物のWBPは、臨床WBPとは根本的に異なります。動物WBPは、動物のストレスや呼吸の乱れを避けるために、単純な換気データ(呼吸数と呼吸量)を無制限に収集しようとしています。これまでのところ、研究動物でのWBPの使用は、環境および被験者の温度と湿度に基づく複雑な計算を含む、臨床WBPで使用されている技術を再現しているように見えますが、強制呼気を実行する方法に関する指示に従うことができる被験者から高度なデータを収集することはできません。このことを念頭に置いて、呼吸器疾患の研究に関連する適切な呼吸頻度と呼吸量を収集するには、WBPの簡易版で十分かどうかを実証することが求められました。環境の温度と湿度の変動を補正するキャリブレーションセッションが採用されました。また、呼吸量を測定する被験者の体温、湿度が呼気量を正確に測定することに有意な影響を及ぼさないことを人工マウスを用いて実証した。sWBPは、ユーザーが面倒な数学的データ処理を採用することなく、動物実験の研究に優れた用途があると結論付けられました。
The authors have nothing to disclose.
これらの研究は、国立衛生研究所COBRE助成金P20GM125504-01サブプロジェクト8246によってサポートされました。
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |