Summary
Questo protocollo presenta la costruzione e l'uso di un apparato di pletismografia semplificata di tutto il corpo per monitorare la progressione della malattia respiratoria batterica in modo non invasivo.
Abstract
I modelli animali surrogati di malattia sono soggetti alle 3R della ricerca responsabile. C'è una frequente rivisitazione dei perfezionamenti dei modelli animali per garantire che sia il benessere degli animali che le intuizioni scientifiche avanzino con la disponibilità di nuove tecnologie. Questo articolo dimostra l'uso della pletismografia semplificata di tutto il corpo (sWBP) per studiare in modo non invasivo l'insufficienza respiratoria in un modello di melioidosi respiratoria letale. sWBP ha la sensibilità di rilevare la respirazione nei topi durante l'intero decorso della malattia, consentendo di misurare i sintomi associati moribondi (bradipnea e ipopnea) e potenzialmente utilizzati per sviluppare criteri di endpoint umani.
Alcuni dei vantaggi di sWBP nel contesto della malattia respiratoria sono che il monitoraggio del respiro dell'ospite si avvicina di più a qualsiasi misurazione fisiologica per valutare la disfunzione del tessuto infetto primario, vale a dire il polmone. Oltre al significato biologico, l'uso di sWBP è rapido e non invasivo, riducendo al minimo lo stress negli animali da ricerca. Questo lavoro dimostra l'uso di apparecchiature sWBP interne per monitorare la malattia nel corso dell'insufficienza respiratoria nel modello murino di melioidosi respiratoria.
Introduction
I patogeni batterici respiratori sono spesso associati a una risposta infiammatoria nel polmone che porta alla patologia polmonare 1,2. In ambito clinico, la diagnosi di polmonite include tipicamente tecniche di coltura da espettorato, analisi di saturazione di ossigeno nel sangue e radiografia del torace. Queste tecniche possono essere tradotte per modelli di infezione di piccoli animali, ma solo l'analisi della saturazione di ossigeno rappresenta un'analisi rapida e in tempo reale nei topi per la gravità della malattia. La saturazione di ossigeno nel sangue (SpO2) è stata precedentemente studiata come metodo per monitorare la progressione della malattia negli studi sulle malattie respiratorie; tuttavia, i topi moribondi hanno letture inaspettatamente elevate di SpO2 sia in un modello 3 di Pseudomonas aeruginosa, che non sono la malattia predittiva o moribonda, probabilmente perché i topi possono modulare la loro attività fisiologica. A tal fine, i livelli diagnostici di SpO2 non sono stati trovati finora per la malattia respiratoria batterica nei topi.
Pertanto, questo lavoro ha studiato l'uso di altri metodi clinicamente rilevanti per rilevare gli effetti della malattia polmonare sulla funzione polmonare come misurazione fisiologica rapida. La pletismografia semplificata di tutto il corpo (sWBP) offre l'opportunità di studiare la frequenza e la profondità del respiro come analisi biometrica rapida e non invasiva. Studi precedenti hanno dimostrato come assemblare apparecchiature WBP in un laboratorio4; Tuttavia, molti dei componenti mostrati in tali studi non sono attualmente disponibili in commercio. Inoltre, il WBP tradizionale richiede la raccolta e l'elaborazione di dati complessi in base all'umidità e alla temperatura 5,6. Quindi, è stato deciso di sviluppare un apparato WBP semplificato che viene calibrato quotidianamente a temperatura / umidità ambiente e valutare se il contributo di temperatura / umidità del soggetto stesso ha o meno alcun effetto sul volume del respiro misurato. Pertanto, è stato creato un apparato sWBP modificato che fornisce i materiali attualmente disponibili. Inoltre, è stato studiato se questo apparato di origine di laboratorio può rilevare i cambiamenti nella respirazione associati alla progressione della malattia durante il modello di melioidosi respiratoria letale nei topi.
L'apparato sWBP costruito per questo lavoro ha utilizzato apparecchiature e software disponibili in commercio per elaborare i dati dei sensori di pressione analogici in una lettura digitale. Il sensore di pressione è stato montato su un barattolo di vetro ermetico con connettori per paratia. Il vantaggio di un barattolo di vetro è la rigidità strutturale del materiale, che resisterà alle variazioni della pressione interna del barattolo, influenzando le misurazioni delle variazioni di volume durante il monitoraggio della respirazione. La camera di campionamento è stata progettata per avere due porte sulle due superfici piane del vaso quadrato, una per accedere alla camera tramite un connettore Luer per la calibrazione e l'altra per alloggiare il sensore di pressione. Il sensore di pressione selezionato ha un trasduttore di pressione manometrico altamente sensibile con un intervallo per piccole variazioni di pressione (intervallo 25 mbar).
Questo protocollo è dimostrato utilizzando un modello murino di melioidosi respiratoria. Burkholderia pseudomallei (Bp) è l'agente batterico della melioidosi - una malattia associata alle regioni tropicali del mondo7. Il Bp si trova nell'ambiente, in particolare in ambienti umidi di acqua stagnante e terreno umido, da cui tipicamente causa infezioni sottocutanee di tagli / graffi di ospiti sensibili. Tuttavia, il Bp è anche infettivo se inalato ed è una potenziale minaccia per l'uso nel bioterrorismo mediante la dispersione di aerosol. Mentre il Bp completamente virulento richiede la manipolazione in un laboratorio BSL-3, è stato precedentemente progettato un ceppo mutante acapsulare, che può essere gestito in modo sicuro a BSL-2 ed esclusodal criterio 8 dell'agente selezionato. Inoltre, è stato sviluppato un modello di infezione intratracheale mediata da intubazione (IMIT) della melioidosi respiratoria per studiare la progressione della malattia respiratoria di Bp 5,9. Abbiamo usato questo modello di infezione per caratterizzare il cambiamento nella respirazione che si verifica durante la progressione della malattia attraverso l'endpoint moribondo.
Protocol
Le procedure qui descritte sono state esaminate e approvate dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'Università di Louisville (protocollo # 14-038) e dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (protocollo # 19567).
1. Assemblaggio della camera di campionamento
- Creare due fori utilizzando una punta diamantata da 3/4" su una pressa per trapano sulle superfici piane di un barattolo per conserve Mason a bocca quadrata di vetro da 600 ml con guarnizione da 95 mm e coperchi ermetici, con coperchi a morsetto per cauzione e grilletto (Figura 1).
NOTA: Una camera di campionamento non è disponibile in commercio e deve essere costruita. - Assemblare una paratia in ottone (filettatura interna NPT da 1/4", filettatura esterna UNF 3/4-16) attraverso entrambi i fori nel barattolo Mason utilizzando rondelle di gomma (diametro interno 3/4", diametro esterno 1") su entrambe le facce di contatto tra la paratia e il vetro per garantire una tenuta ermetica.
- Utilizzare un gruppo paratia per un sensore di pressione mentre si collega l'altra paratia tramite una siringa collegata a Luer per scopi di calibrazione.
- Per il sensore di pressione, avvolgere le filettature NPT da 1/4" di un trasduttore di pressione manometrico ad alte prestazioni con nastro in teflon e infilarle nella paratia. Utilizzare un saldatore per collegare il cablaggio del sensore di pressione a un connettore DIN maschio a 8 pin, utilizzando le istruzioni di cablaggio del produttore per interfacciarsi con un dispositivo di acquisizione dati di alta qualità disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Ciò richiede l'uso di un resistore a film metallico da 150 K ohm 1/8 watt all'interno del cablaggio del connettore DIN. - Per la porta di calibrazione, utilizzare un adattatore NPT maschio da 1/4" a NPT femmina da 1/8" per collegare un NPT maschio da 1/8" a un connettore nichelato Luer lock femmina alle connessioni filettate avvolgenti della paratia in ottone con nastro in teflon. Utilizzare un cappuccio Luer maschio filettato in polipropilene per sigillare il connettore Luer quando non è in uso.
NOTA: non stringere eccessivamente i connettori della paratia sul barattolo di vetro, poiché ciò svilupperebbe crepe. Se lo si desidera, il silicone può essere aggiunto alle guarnizioni in gomma per garantire una tenuta ermetica delle paratie al barattolo di vetro.
- Per il sensore di pressione, avvolgere le filettature NPT da 1/4" di un trasduttore di pressione manometrico ad alte prestazioni con nastro in teflon e infilarle nella paratia. Utilizzare un saldatore per collegare il cablaggio del sensore di pressione a un connettore DIN maschio a 8 pin, utilizzando le istruzioni di cablaggio del produttore per interfacciarsi con un dispositivo di acquisizione dati di alta qualità disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
2. Configurazione del sistema
- Collegare la camera di campionamento a un amplificatore a ponte utilizzando un connettore DIN a 8 pin e l'amplificatore a ponte al dispositivo di acquisizione dati, seguendo le istruzioni del produttore.
- Collegare il dispositivo di acquisizione dati a un alimentatore e a un computer che esegue un software di analisi dei dati fisiologici utilizzando i cavi del produttore.
NOTA: Assicurarsi che il dispositivo di acquisizione dati sia acceso e riscaldato per almeno 5 minuti prima dell'uso per garantire che il sensore stabilizzi le sue misurazioni. - Avviare il software per interfacciarsi con il sistema di acquisizione dati.
- Scaricare il modulo spirometrico opzionale all'interno del software e modificare le impostazioni predefinite dell'unità da L/s a μL/s nella finestra Impostazioni > Spirometria .
3. Calibrazione del sistema
- All'interno del software, creare una finestra a 4 canali con le seguenti finestre di dati: Canale 1: dati sorgente a frequenza di campionamento di 4 k/s e intervallo di 1 mV ; Canale 2: filtro digitale del canale 1 che utilizza un filtro di regolazione automatica passa alto 1 Hz ; Canale 3: livellamento dei dati del Canale 2 mediante una media di 100 campioni; Canale 4: Flusso spirometrico dei dati del canale 3 (teste di flusso personalizzate, calibrate su formula (μL/s) = 120.000 x tensione).
NOTA: 120.000 è un coefficiente di correlazione segnaposto che verrà modificato durante la calibrazione. - Impostare l'analisi DataPad di Channel 4 con le seguenti colonne: Colonna 1: Dati del canale 4, Commenti > Testo completo del commento; Colonna 2: dati del canale 4, misurazioni cicliche > frequenza ciclica media; Colonna 3: Dati del canale 4, misurazioni cicliche > altezza ciclica media.
- Imposta la frequenza fotogrammi su 100:1 nell'angolo inferiore destro della visualizzazione del grafico. Salvare questa configurazione della finestra come modello per tutti gli studi futuri.
- Chiudere il coperchio della camera di campionamento e collegare una siringa a tenuta di gas da 25 μL al connettore della paratia Luer. Montare la siringa con un adattatore Chaney impostato per erogare ripetutamente un volume di 20 μL.
NOTA: È possibile utilizzare un breve pezzo opzionale di tubi da 1/16" e connettori Luer/barb per collegare la siringa alla camera del campione. Tuttavia, i tubi lunghi devono essere evitati per evitare cambiamenti significativi al volume d'aria totale della camera di campionamento. - Aspirare 20 μL di aria nella siringa utilizzando l'arresto di profondità dell'adattatore Chaney.
- Zero il pleth nel software (Setup > Zero All Inputs (Alt-Z)) e avviare una registrazione.
- Durante la registrazione, e con una linea di base stabile, premere/ritirare rapidamente lo stantuffo della siringa per circa 10 ripetizioni per replicare la respirazione del soggetto con un respiro misurato di 20 μL. Interrompere la registrazione.
NOTA: La frequenza dei respiri artificiali dovrebbe superare i 2 Hz per massimizzare la riproducibilità della calibrazione. - Etichettare l'identità del campione misurato facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'inizio della registrazione pleth numerata e facendo clic su Aggiungi commento.
- Reimpostare la siringa, azzerare l'ingresso e ripetere le misurazioni di registrazione di impulsi di 20 μL altre due volte (tre sessioni di registrazione totali).
- Dopo aver completato tutte le misurazioni, utilizzare il mouse del computer per selezionare una porzione di pleth respiratorio che rappresenti accuratamente i respiri artificiali da 20 μL.
NOTA: All'interno del modulo DataPad, i dati appariranno nell'intestazione di anteprima fornendo una lettura temporanea della frequenza respiratoria (frequenza ciclica media, Hz) e della profondità del respiro (altezza ciclica media, μL). L'anteprima dei dati può essere registrata in DataPad utilizzando l'icona Aggiungi a DataPad . - Esaminare i dati della colonna 3 (altezza ciclica media) e calcolare il volume medio di respiro misurato dalle tre registrazioni. Eseguire il seguente calcolo del volume medio di respiro misurato: Coefficiente di calibrazione = volume erogato / volume misurato x 120.000.
NOTA: 120.000 era il coefficiente segnaposto di calibrazione della testa di flusso utilizzato nel passaggio 3.1 ora modificato dai dati misurati. Il sistema è ora calibrato per la respirazione tipica del mouse utilizzando la temperatura e l'umidità ambientali correnti. Il sistema può ora monitorare la respirazione del soggetto e la calibrazione può essere eseguita quotidianamente per tenere conto di eventuali fluttuazioni di temperatura / umidità.
4. Monitoraggio dei soggetti
- Aprire un modello master come descritto nel passaggio 3.4 o completare i passaggi da 4.2 a 4.3.
- All'interno del software, creare una finestra a 4 canali con la seguente elaborazione dei dati: Canale 1: dati sorgente a frequenza di campionamento di 4 k/s e intervallo di 1 mV ; Canale 2: filtro digitale del canale 1 utilizzando un filtro di regolazione automatica passa alto 1 Hz ; Canale 3: livellamento dei dati del canale 2 mediante la media di 100 campioni; Canale 4: Flusso spirometrico dei dati del canale 3 (teste di flusso personalizzate, calibrate su formula (μL/s) = 120.000 x tensione).
NOTA: 120.000 è il coefficiente di correlazione calcolato per il sensore di pressione corrente; Tuttavia, l'utente deve eseguire la calibrazione del sistema descritta nel passaggio 3 e utilizzare invece questo coefficiente di correlazione definito dall'utente. - Impostare l'analisi DataPad di Channel 4 con le seguenti colonne: Colonna 1: Dati del canale 4, Commenti > Testo completo del commento; Colonna 2: dati del canale 4, misurazioni cicliche > frequenza ciclica media; Colonna 3: Dati del canale 4, misurazioni cicliche > altezza ciclica media.
- Posizionare il soggetto nella camera di campionamento e chiudere il coperchio. Per questo esperimento è stato utilizzato un topo femmina cosciente di 4-12 settimane albino C57BL/6J (B6(Cg)-Tyrc-2J/J).
- Equalizzare la pressione atmosferica nella camera (dalla sigillatura del coperchio) allentando brevemente il tappo della paratia Luer e stringendo.
- Osservare che il soggetto non si muove attivamente all'interno della camera di campionamento prima di azzerare tutti gli ingressi (scorciatoia Alt-Z) e iniziare una registrazione.
NOTA: se il soggetto inizia a muoversi nella camera di campionamento, la linea di base potrebbe spostarsi fuori dalla scala, che può essere risolta azzerando nuovamente tutti gli ingressi nel mezzo di una registrazione, che creerà una nuova registrazione sulla scala. Supponiamo che il soggetto si impegni nell'esplorazione o nella toelettatura durante la registrazione; Si noti quale parte della registrazione della pletismografia riflette più accuratamente la respirazione normale. - Etichetta l'identità del soggetto facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'inizio della registrazione pleth numerata e fai clic su Aggiungi commento.
- Riportare il soggetto nella sua gabbia. Limitare il tempo trascorso nella camera di campionamento sigillata a 5 minuti per evitare asfissia e stress.
NOTA: Il rischio di asfissia è basso dato che il volume d'aria di 600 mL della camera di campionamento non sarà rapidamente speso da un topo sano che respira a <15 ml / min. - Utilizzare il mouse del computer per selezionare una porzione di pleth respiratorio che rappresenti accuratamente la respirazione del soggetto.
NOTA: All'interno del modulo DataPad, i dati appariranno nell'intestazione di anteprima fornendo una lettura temporanea della frequenza respiratoria (frequenza ciclica media, Hz) e del volume del respiro (altezza ciclica media, μL). L'anteprima dei dati può essere registrata in DataPad utilizzando l'icona Aggiungi a DataPad . - Continuare a misurare i topi soggetti uno alla volta e registrare sezioni rappresentative della respirazione pleth su DataPad.
- Dopo la registrazione dei dati, esportare i dati DataPad in Excel. Calcola il volume minuto come segue: Volume minuto (ml / min) = Frequenza respiratoria (Hz) x Volume respiro (μl) x 0,06.
Representative Results
Calibrazione del sistema
Il software di analisi dei dati consente la calibrazione diretta di una testa di flusso personalizzata, come quella qui descritta. Questo viene eseguito quando si imposta il flusso spirometrico. Come descritto al punto 3.1, esiste un'opzione per immettere il volume d'aria di calibrazione noto, che calcola il coefficiente di correlazione tensione-volume all'interno del sistema. Questo, tuttavia, genera un coefficiente di correlazione basato su una singola lettura, ed è stato osservato che la variazione intrinseca della calibrazione da uno standard n = 1 ha scarsa utilità. L'approccio attuale può ovviare a questa lacuna e consente a un utente di eseguire una calibrazione giornaliera utilizzando più letture mediate per calcolare un coefficiente di calibrazione. Qui è stata dimostrata la calibrazione con 20 μL di aria iniettata, che rappresenta un tipico volume di respiro di fascia alta in un mouse tipico. Il software assume un'intercetta di origine (0,0) ed è quindi calibrato da 0-20 μL utilizzando questo approccio.
La metodologia qui proposta per sWBP si calibra quotidianamente, tenendo così conto di eventuali fluttuazioni di umidità/temperatura ambientale. I metodi originali utilizzati per la WBP specifica, risalgono alla metodologia di Drorbaugh e Fenn del 1955, che hanno sviluppato WBP per misurare la ventilazione nei neonati umani5. I calcoli di Drorbaugh e Fenn tengono conto delle variazioni di temperatura e umidità dell'ambiente e del soggetto. L'approccio attuale corregge le fluttuazioni ambientali calibrando ogni sessione sWBP. Tuttavia, è stato deciso di affrontare se il riscaldamento e l'umidificazione della respirazione attraverso la cavità nasale / polmone di un topo influenzano la misurazione di un volume d'aria noto. Pertanto, è stato creato un apparato artificiale per imitare l'effetto del soggetto sul riscaldamento e sull'umidificazione delle misurazioni calibrate dell'aria. I connettori Luer sono stati collegati a un tubo conico da 15 mL e hanno posizionato questo conico sigillato in linea tra la camera del campione e la siringa di calibrazione a tenuta di gas. È stata eseguita una taratura di 20 μL utilizzando un tubo conico vuoto tenuto a temperatura ambiente (23 °C). Il tubo conico è stato quindi parzialmente riempito con acqua distillata appena sotto i connettori Luer, consentendo il tempo di equilibrare lo spazio di testa del conico; Il volume di calibrazione è stato quindi rimisurato per studiare l'effetto dell'umidità. Il tubo conico è stato posto in un blocco riscaldante e bilanciato a 37 °C in ambiente umido, e infine equilibrato a 37 °C senza acqua per valutare l'effetto del riscaldamento soggetto e senza alcun apporto aggiuntivo di umidità. La figura 2 dimostra che tutte le condizioni testate non hanno avuto un impatto significativo sulla misurazione calibrata di 20 μL fornita dalla siringa a tenuta di gas. Da questa scoperta, si è concluso che sWBP offre un approccio accessibile per monitorare la respirazione negli animali da ricerca senza la necessità di calcoli complessi basati sulla temperatura e l'umidità del soggetto animale, in quanto questi non hanno alcun impatto significativo sul volume del respiro misurato.
Monitoraggio dei soggetti
sWBP è stato utilizzato per monitorare la respirazione durante la malattia delle infezioni respiratorie letali con il patogeno batterico B. pseudomallei. Una sfida del monitoraggio della respirazione negli animali coscienti è la curiosità di animali sani normali che si muovono all'interno della camera del campione. Il movimento del mouse crea una linea di base in costante movimento che può essere mitigata in parte pre-condizionando i soggetti alla camera per un periodo di diversi giorni prima della misurazione. Questo problema riguarda principalmente la misurazione basale nei topi sani, poiché i soggetti diventano letargici durante l'infezione, rendendo la sWBP molto più gestibile con una ridotta attività del soggetto. Potrebbe essere allettante tentare di usare una qualche forma di contenzione, sia fisica che anestesia. L'uso della contenzione fisica può influenzare la respirazione naturale causando stress. Inoltre, l'uso di anestetici è noto per avere effetti pronunciati sulla frequenza respiratoria e sulla profondità10; pertanto, è stato deciso di studiare l'impatto dell'anestesia con l'apparato sWBP interno. L'isoflurano è comunemente usato per eseguire l'imaging diagnostico in vivo durante i modelli di infezione e, pertanto, un topo C57BL / 6 è stato anestetizzato e monitorato la progressione fino al recupero dall'anestesia utilizzando sWBP. Questo studio è stato condotto con un topo albino C57BL/6J di 4 settimane per prolungare la finestra di recupero dall'anestesia. La Figura 3 dimostra che l'anestetico preferito fa sì che i topi mostrino una frequenza respiratoria lenta con un grande volume d'aria. Quando i topi iniziano a riprendersi dalla sedazione, la loro frequenza respiratoria aumenta e il volume del respiro diminuisce, con l'effetto netto che l'aria totale inspirata aumenta lentamente. In questo studio, è stato riscontrato che il volume del respiro viene ripristinato ai livelli pre-anestesia entro i primi 30 secondi di recupero. La frequenza respiratoria aumenta costantemente fino a quando la respirazione basale viene ripristinata a 2-2,5 minuti dopo la rimozione dall'anestesia. Il volume minuto ha seguito da vicino gli effetti della frequenza respiratoria, raggiungendo il volume minuto basale di 2,5 minuti dopo la rimozione dall'anestesia. Questa scoperta supporta che l'anestesia non dovrebbe essere impiegata nell'approccio sWBP. Influisce drammaticamente sulla respirazione di base, non sorprendentemente, poiché l'anestesia rallenterà il metabolismo dell'ospite, creando una ridotta domanda di ossigeno ispirato. L'igienizzazione della camera del campione deve essere presa in considerazione anche tra i soggetti per affrontare il controllo delle infezioni specifiche dello studio, nonché l'impatto dei feromoni da urina o feci che potrebbero influire sullo stress tra i soggetti.
La WBP è una strategia interessante per monitorare la funzione polmonare nei modelli di malattie respiratorie in modo non invasivo. sWBP è stato utilizzato per studiare come la respirazione cambia durante le infezioni letali da melioidosi respiratoria (Figura 4), con punti temporali che rispecchiano il monitoraggio della bioluminescenza nel polmone. È stato osservato che questo modello è associato a un esordio precoce di letargia, che persiste in modo lentamente progressivo fino allo sviluppo della malattia moribonda a circa 3 giorni dopo l'infezione. È stato anche osservato che la frequenza respiratoria e l'aria totale inspirata (volume minuto) dei topi diminuiscono rapidamente durante il primo giorno di infezione e rimangono bassi per il resto del decorso dell'infezione (Figura 4A, C). Questo modello è coerente con la letargia ad esordio precoce, che persiste per i prossimi 2 giorni dell'infezione. Al contrario, il volume del respiro non diminuisce bruscamente durante le prime 24 ore e invece ha una leggera e costante diminuzione, che si avvicina a un declino lineare nel corso dei 3 giorni della malattia (Figura 4B).
Figura 1: apparato sWBP. Una camera di campionamento personalizzata è stata costruita da un barattolo di vetro quadrato sigillabile con connettori per paratia su due facce piatte. Una paratia è stata utilizzata per montare un sensore di pressione manometrico collegato a un amplificatore a ponte e un digitalizzatore di dispositivi di acquisizione dati tramite una connessione DIN a 8 pin. La seconda paratia era dotata di un connettore Luer per la calibrazione mediante una siringa a tenuta di gas. Il dispositivo era collegato a un PC su cui era in esecuzione il software. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Effetto della temperatura e dell'umidità del soggetto sul volume del respiro. Un tubo conico da 15 mL con connettori Luer è stato installato in linea tra la siringa di calibrazione da 20 μL e la camera di campionamento. Il sistema è stato calibrato a 20 μL senza alcun contributo aggiuntivo di temperatura/umidità dal tubo conico. Altre misurazioni sono state raccolte dopo l'equilibratura con umidità satura da acqua distillata e/o riscaldamento del tubo conico dalla temperatura ambiente (23 °C) alla temperatura corporea (37 °C). Nessuna differenza significativa è stata rilevata da n = 5 misurazioni di ciascuna condizione da One-way ANOVA con il confronto multiplo di Tukey post-test. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Effetto dell'anestesia gassosa sulla respirazione nei topi. I dati rappresentativi di una femmina di topo albino C57BL/6J di 4 settimane (8,6 g) sono stati sedati per 5 minuti con isoflurano al 3% in ossigeno e trasferiti in una camera di campionamento sWBP. I dati di Pleth sono stati raccolti per 150 secondi dopo la rimozione dall'anestesia. Il soggetto ha iniziato la deambulazione iniziale da 100 secondi dopo la rimozione dall'anestesia. (A) Respirazione basale prima dell'anestesia, che misura una frequenza respiratoria di 4,97 Hz, un volume di respiro di 9,74 μL e un volume minuto di 2,91 ml. (B) I primi 60 s di modifiche alla respirazione durante il recupero dall'anestesia. (A-B) Asse verticale che misura μL per respiro e asse orizzontale in secondi. (C-E) I dati sulla ventilazione sono stati raccolti durante i 150 s di recupero dall'anestesia, in media da ≥3 cicli di respiro per punto temporale per (C) frequenza respiratoria, (D) volume del respiro e (E) volume minuto calcolato. I valori basali pre-anestesia sono indicati con una linea tratteggiata orizzontale in ciascun rispettivo grafico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Effetto della melioidosi respiratoria sulla respirazione dell'ospite. Cinque topi femmina C57BL/6 di 8 settimane sono stati infettati con 4,9 log CFU di B. pseudomallei ceppo bioluminescente JW270. sWBP è stato condotto durante il corso di 3 giorni dell'infezione, misurando la frequenza respiratoria (A) e il volume del respiro (B). L'aria totale inspirata è stata calcolata come volume minuto (C). I dati per ciascuno dei cinque soggetti sono tracciati in modo indipendente con regressione polinomiale del terzo ordine. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
sWBP è un approccio interessante per migliorare la comprensione delle infezioni respiratorie in modelli di piccoli animali. È importante sottolineare che si tratta di un approccio non invasivo e, come tale, non rappresenta un rischio significativo di causare stress eccessivo agli animali da ricerca durante una sfida di infezione. In effetti, la procedura di monitoraggio della respirazione del soggetto è un test rapido che richiede diversi minuti e una gestione minima del soggetto. Il vantaggio scientifico è la comprensione ad alta risoluzione di come i patogeni microbici influenzano la funzione polmonare durante la malattia. Questo approccio fornirà benefici alla ricerca di base, facilitando la comprensione di come un agente patogeno causa la malattia, oltre a fornire un'utilità traslazionale per capire come una nuova terapia ripristina un soggetto di ricerca in uno stato di salute respiratoria.
In questo manoscritto vengono forniti risultati rappresentativi per il patogeno B. pseudomallei, che causa una risposta letargica precoce. Non tutte le infezioni polmonari batteriche si presentano allo stesso modo nei modelli di infezione murina. Precedenti esperienze con altri modelli di infezione hanno dimostrato che il patogeno batterico Klebsiella pneumoniae si presenta come un'infezione asintomatica fino al punto in cui i topi soccombono all'infezione, anche approssimativamente al Giorno 3 post-infezione11. Si ipotizza che la richiesta dell'ospite di aria inspirata (cioè volume minuto) possa essere strettamente correlata al grado di letargia con cui si presenta una data malattia. Saranno necessari studi futuri per esaminare come diversi agenti patogeni batterici influenzano la funzione polmonare durante le malattie respiratorie. Resta inteso che diversi patogeni hanno approcci unici per eludere la difesa dell'ospite, comprese le differenze in, (1) propensione ad essere patogeni intracellulari o extracellulari, (2) la capacità di causare una risposta ipotermica precoce / tardiva e (3) l'uso di diversi repertori di determinanti di virulenza 3,12,13. Pertanto, è probabile che diverse strategie di malattia si tradurranno in effetti unici sulla funzione polmonare e sulla respirazione durante l'infezione.
Le impostazioni consigliate descritte in questo protocollo possono essere modificate per adattarsi alle sfide specifiche presenti durante sWBP. Uno dei problemi comuni riscontrati durante una sessione di registrazione sWBP è il movimento del soggetto all'interno della camera di campionamento. Come accennato, questo movimento modifica la linea di base e può influenzare l'accuratezza delle misurazioni della respirazione. Un filtro digitale è stato utilizzato per normalizzare la linea di base di spostamento, consentendo misurazioni del respiro praticabili nonostante piccoli movimenti. Un movimento eccessivo può spingere una misurazione di base fuori dall'intervallo di un input azzerato. Le registrazioni sono raccomandate a un intervallo di 1 mV (impostazione del canale 1), che fornisce un compromesso di osservare ancora i picchi della pletismografia evitando la perdita di dati al di fuori dell'intervallo. Per i soggetti eccezionalmente attivi, potrebbe essere necessario estendere il campo di registrazione >1 mV per evitare segnali persistenti fuori portata.
La procedura consigliata richiede una calibrazione giornaliera (o ad ogni sessione) per adattarsi alle fluttuazioni ambientali di umidità / temperatura. Il WBP tradizionale utilizza calcoli complessi che tengono conto della temperatura/umidità sia dell'ambiente che del soggetto 5,6. È stato dimostrato che nell'attuale apparato sWBP, gli effetti della temperatura/umidità dell'ospite non alterano significativamente il volume del respiro misurato di una sorgente di taratura. Pertanto, questo approccio in sWBP differisce fondamentalmente dall'approccio di >50 anni di Drorbaugh e Fenn. Qui, sWBP mette direttamente in relazione le variazioni di pressione con un volume di respiro misurato senza ulteriori correzioni da parte dell'ospite.
È essenziale confrontare la WBP animale da ricerca con quella della WBP clinica. I tipi di dati biometrici che sono stati tentati di raccogliere da sWBP sono il volume e la frequenza del respiro. Tali misurazioni vengono raccolte clinicamente utilizzando semplici apparecchiature di spirometria in cui un paziente tiene un monitor del respiro alla bocca e respira normalmente in un dispositivo che monitora il flusso d'aria. Una spirometria simile negli animali da ricerca richiede moderazione, contribuendo così allo stress e a un'interruzione intrinseca della respirazione. Pertanto, la spirometria semplice è funzionale clinicamente ma non per gli animali da ricerca. WBP ha uno scopo essenziale nella clinica per raccogliere dati avanzati, comprese misurazioni come il volume polmonare residuo. Tali dati possono essere contenuti solo nel contesto di un soggetto in grado di seguire le istruzioni su come respirare, compresa l'espirazione forzata (svuotamento del polmone da un'espirazione profonda). Non si può fare affidamento sugli animali da ricerca per seguire le istruzioni di respirazione di un ricercatore. Molte delle misurazioni avanzate raccolte clinicamente durante la WBP non possono essere riprodotte negli animali da ricerca. La WBP negli animali da ricerca è fondamentalmente diversa dalla WBP clinica. Animal WBP cerca di raccogliere semplici dati di ventilazione (frequenza e volume del respiro) in modo non trattenuto per evitare lo stress animale e la perturbazione respiratoria. Finora, l'uso della WBP negli animali da ricerca sembra replicare le tecniche utilizzate nella WBP clinica, compresi calcoli complessi basati sulla temperatura e l'umidità ambientale e del soggetto, ma senza la capacità di raccogliere i dati avanzati da un soggetto che può seguire le istruzioni su come eseguire una scadenza forzata. Con questo in mente, si è cercato di dimostrare se una versione semplificata della WBP sarebbe sufficiente per raccogliere la frequenza e il volume respiratorio pertinenti rilevanti per gli studi sulle malattie respiratorie. È stata impiegata una sessione di calibrazione, che ha compensato qualsiasi variazione di temperatura e umidità ambientale. Inoltre, è stato dimostrato con un topo artificiale che sottoporre la temperatura e l'umidità a un volume di respiro misurato non hanno alcun effetto significativo sulla misurazione accurata del volume del respiro. Si è concluso che sWBP ha un'eccellente applicazione agli studi sugli animali di ricerca, senza l'obbligo per l'utente di impiegare un ingombrante trattamento matematico dei dati.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questi studi sono stati supportati dalla sovvenzione COBRE del National Institutes of Health P20GM125504-01 Sub-Project 8246.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
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