Detta protokoll presenterar konstruktionen och användningen av en förenklad helkroppspletysmografiapparat för att övervaka bakteriell andningssjukdomsprogression icke-invasivt.
Surrogatdjurmodeller av sjukdom är föremål för 3R för ansvarsfull forskning. Det sker ofta en översyn av förbättringar av djurmodeller för att säkerställa att både djurskydd och vetenskapliga insikter utvecklas med tillgången till ny teknik. Denna artikel visar användningen av förenklad helkroppspletysmografi (sWBP) för att icke-invasivt studera andningssvikt i en modell av dödlig respiratorisk melioidos. sWBP har känsligheten att upptäcka andning hos möss genom hela sjukdomsförloppet, vilket gör det möjligt att mäta de döende associerade symtomen (bradypné och hypopné) och potentiellt användas för att utveckla humana slutpunktskriterier.
Några av fördelarna med sWBP i samband med andningssjukdomar är att värdandningsövervakning kommer närmast av alla fysiologiska mätningar vid bedömning av dysfunktion hos den primära infekterade vävnaden, nämligen lungan. Förutom biologisk betydelse är användningen av sWBP snabb och icke-invasiv, vilket minimerar stress hos försöksdjur. Detta arbete visar användningen av egen sWBP-apparat för att övervaka sjukdom under hela andningssvikt i murinmodellen av respiratorisk melioidos.
Respiratoriska bakteriella patogener är ofta förknippade med ett inflammatoriskt svar i lungan som leder till lungpatologi 1,2. I den kliniska miljön inkluderar diagnos av lunginflammation vanligtvis odlingstekniker från sputum, blod-syremättnadsanalys och lungröntgen. Dessa tekniker kan översättas för smådjursinfektionsmodeller, men endast syremättnadsanalys representerar en snabb realtidsanalys hos möss för sjukdomens svårighetsgrad. Syremättnaden i blodet (SpO2) undersöktes tidigare som en metod för att spåra sjukdomsprogression i studier av luftvägssjukdomar; döende möss har dock oväntat höga SpO2-avläsningar både i en Pseudomonas aeruginosa modell3, som inte är den prediktiva eller döende sjukdomen, troligen för att möss kan modulera sin fysiologiska aktivitet. För detta ändamål hittades hittills inte diagnostiska nivåer av SpO2 för bakteriell andningssjukdom hos möss.
Därför undersökte detta arbete användningen av andra kliniskt relevanta metoder för att upptäcka effekterna av lungsjukdom på lungfunktionen som en snabb fysiologisk mätning. Simplified Whole Body Plethysmography (sWBP) erbjuder möjligheten att undersöka andningsfrekvens och djup som en snabb, icke-invasiv biometrisk analys. Tidigare studier har visat hur man monterar WBP-apparater i ett laboratorium4; Flera av de komponenter som visas i sådana studier är dock för närvarande inte kommersiellt tillgängliga. Vidare kräver traditionell WBP komplex datainsamling och databehandling baserat på fuktighet och temperatur 5,6. Därför beslutades att utveckla en förenklad WBP-apparat som kalibreras dagligen till rumstemperatur / luftfuktighet och bedöma om ämnets temperatur/ fuktighetsbidrag har någon effekt på den uppmätta andningsvolymen. Således har en modifierad sWBP-apparat skapats som källor till de för närvarande tillgängliga materialen. Vidare har det undersökts om denna laboratoriebaserade apparat kan upptäcka förändringar i andningen i samband med sjukdomsprogression under modellen av dödlig respiratorisk melioidos hos möss.
Den sWBP-apparat som konstruerades för detta arbete använde kommersiellt tillgänglig utrustning och programvara för att bearbeta analoga trycksensordata till en digital avläsning. Trycksensorn monterades på en lufttät glasburk med skottkontakter. Fördelen med en glasburk är materialets strukturella styvhet, som kommer att motstå förändringar i burkens inre tryck, vilket påverkar mätningar av volymförändringar under övervakningen av andningen. Provtagningskammaren har konstruerats för att ha två portar på de två plana ytorna på den fyrkantiga burken, en för att komma åt kammaren med en Luer-kontakt för kalibrering och den andra för att hysa trycksensorn. Den valda trycksensorn har en mycket känslig mättryckgivare med ett intervall för små tryckförändringar (25 mbar-intervall).
Detta protokoll demonstreras med hjälp av en murin modell av respiratorisk melioidos. Burkholderia pseudomallei (Bp) är bakteriemedlet för melioidos – en sjukdom som är förknippad med tropiska regioner i världen7. Bp finns i miljön, särskilt i våta miljöer med stående vatten och fuktig jord, från vilken det vanligtvis orsakar subkutana infektioner av skär / repor hos mottagliga värdar. Bp är dock också smittsamt vid inandning och är ett potentiellt hot för användning i bioterrorism genom aerosolspridning. Medan helt virulent Bp kräver hantering i ett BSL-3-laboratorium, konstruerades tidigare en akapsulär mutantstam, som säkert kan hanteras vid BSL-2 och uteslutas från urvalsmedelskriterierna8. Vidare har en intubationsmedierad intratrakeal (IMIT) infektionsmodell av respiratorisk melioidos utvecklats för att studera andningssjukdomsprogression av Bp 5,9. Vi har använt denna infektionsmodell för att karakterisera den förändring i andningen som sker under sjukdomsprogression genom den döende slutpunkten.
sWBP är ett attraktivt tillvägagångssätt för att öka förståelsen för luftvägsinfektioner i smådjursmodeller. Det är viktigt att det är ett icke-invasivt tillvägagångssätt, och som sådant utgör det inte en betydande risk för att orsaka onödig stress för försöksdjur under en infektionsutmaning. Faktum är att förfarandet för övervakning av försökspersonens andning är ett snabbt test som kräver flera minuter och minimal ämneshantering. Den vetenskapliga fördelen är den högupplösta förståelsen av hur mikrobiella patogener påverkar lungfunktionen under sjukdom. Detta tillvägagångssätt kommer att ge nytta för grundforskning, underlätta förståelsen för hur en patogen orsakar sjukdom, samt ge ett translationellt verktyg för att förstå hur en ny terapeutisk återställer en forskning som är föremål för ett tillstånd av andningshälsa.
I detta manuskript tillhandahålls representativa resultat för patogenen B. pseudomallei, vilket orsakar ett tidigt slött svar. Inte alla bakteriella lunginfektioner förekommer på samma sätt i musinfektionsmodeller. Tidigare erfarenheter av andra infektionsmodeller har visat att bakteriepatogenen Klebsiella pneumoniae uppträder som en asymptomatisk infektion fram till den punkt då möss dukar under för infektion, även vid ungefär dag 3 efter infektion11. Det antas att värdens efterfrågan på inspirerad luft (dvs minutvolym) kan relatera nära till graden av slöhet som en given sjukdom presenterar. Framtida studier kommer att krävas för att undersöka hur olika bakteriella patogener påverkar lungfunktionen under andningssjukdomar. Det är underförstått att olika patogener har unika metoder för att undvika värdförsvar, inklusive skillnader i, (1) benägenhet att vara intracellulära eller extracellulära patogener, (2) förmågan att orsaka tidigt / sent hypotermiskt svar och (3) användning av olika repertoarer av virulensdeterminanter 3,12,13. Därför är det troligt att olika sjukdomsstrategier kommer att resultera i unika effekter på lungfunktion och andning under infektion.
De rekommenderade inställningarna som beskrivs i det här protokollet kan ändras för att hantera unika utmaningar som finns under sWBP. Ett av de vanligaste problemen som upplevs under en sWBP-inspelningssession är ämnets rörelse inom provkammaren. Som nämnts ändrar denna rörelse baslinjen och kan påverka noggrannheten i andningsmätningarna. Ett digitalt filter användes för att normalisera den skiftande baslinjen, vilket möjliggjorde livskraftiga andningsmätningar trots små rörelser. Överdriven rörelse kan driva en baslinjemätning utanför intervallet för en nollställd indata. Inspelningar rekommenderas vid 1 mV-intervall (kanal 1-inställning), vilket ger en kompromiss med att fortfarande observera topparna i pletysmografin samtidigt som man undviker förlust av data utanför intervallet. För exceptionellt aktiva försökspersoner kan det vara nödvändigt att utöka inspelningsområdet >1 mV för att undvika ihållande signaler utanför räckvidden.
Den rekommenderade proceduren kräver daglig kalibrering (eller vid varje session) för att tillgodose miljöfuktighet / temperaturfluktuationer. Traditionell WBP använder komplexa beräkningar som tar hänsyn till temperatur/luftfuktighet i både miljö och ämne 5,6. Det har visats att effekterna av värdens temperatur/luftfuktighet i den nuvarande sWBP-apparaten inte signifikant förändrar den uppmätta andningsvolymen för en kalibreringskälla. Därför skiljer sig detta tillvägagångssätt i sWBP fundamentalt från Drorbaughs och Fenns >50-åriga tillvägagångssätt. Här relaterar sWBP direkt tryckförändringar till en uppmätt andningsvolym utan ytterligare korrigering från värden.
Det är viktigt att kontrastera försöksdjur WBP med klinisk WBP. De typer av biometriska data som försöktes samla in av sWBP är andningsvolym och frekvens. Sådana mätningar samlas in kliniskt med hjälp av enkel spirometriutrustning där en patient håller en andningsmonitor mot munnen och andas normalt in i en enhet som övervakar luftflödet. Liknande spirometri hos försöksdjur kräver återhållsamhet, vilket bidrar till stress och en inneboende andningsstörning. Därför är enkel spirometri funktionell kliniskt men inte för försöksdjur. WBP tjänar ett viktigt syfte i kliniken för att samla in avancerade data, inklusive sådana mätningar som kvarvarande lungvolym. Sådana data kan endast innehållas i samband med att ett ämne kan följa instruktioner om hur de andas, inklusive tvingad utgång (tömning av lungan genom en djup utandning). Försöksdjur kan inte lita på att följa andningsinstruktioner från en forskare. Många av de avancerade mätningar som samlats in kliniskt under WBP kan inte reproduceras hos försöksdjur. WBP hos försöksdjur skiljer sig fundamentalt från klinisk WBP. Animal WBP strävar efter att samla in enkla ventilationsdata (andningsfrekvens och volym) på ett icke-återhållsamt sätt för att undvika djurstress och andningsstörning. Hittills verkar användningen av WBP hos försöksdjur replikera de tekniker som används i klinisk WBP, inklusive komplexa beräkningar baserade på temperatur och luftfuktighet i miljö och ämne, men utan möjlighet att samla in avancerade data från ett ämne som kan följa instruktioner om hur man utför en tvingad utgång. Med detta i åtanke försökte man visa om en förenklad version av WBP skulle räcka för att samla in den relevanta andningsfrekvensen och volymen som är relevant för studier av andningssjukdomar. En kalibreringssession användes, vilket kompenserade för eventuella variationer i omgivningstemperatur och luftfuktighet. Vidare visades det med en konstgjord mus att ämnestemperatur och fuktighet till en uppmätt andningsvolym inte har någon signifikant effekt på att noggrant mäta andningsvolymen. Man drog slutsatsen att sWBP har utmärkt tillämpning på djurstudier, utan krav på användaren att använda besvärlig matematisk behandling av data.
The authors have nothing to disclose.
Dessa studier stöddes av National Institutes of Health COBRE-bidrag P20GM125504-01 Delprojekt 8246.
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |