Este protocolo presenta la construcción y el uso de un aparato de pletismografía simplificada de cuerpo entero para monitorear la progresión de la enfermedad respiratoria bacteriana de forma no invasiva.
Los modelos animales sustitutos de la enfermedad están sujetos a las 3R de la Investigación Responsable. Hay una revisión frecuente de los refinamientos de los modelos animales para garantizar que tanto el bienestar animal como los conocimientos científicos avancen con la disponibilidad de nuevas tecnologías. Este artículo demuestra el uso de la pletismografía simplificada de cuerpo entero (parm s) para estudiar de forma no invasiva la insuficiencia respiratoria en un modelo de melioidosis respiratoria letal. sWBP tiene la sensibilidad para detectar la respiración en ratones a lo largo de todo el curso de la enfermedad, lo que permite medir los síntomas asociados a la muerte (bradipnea e hipopnea) y potencialmente usarlos para desarrollar criterios de valoración humanos.
Algunos de los beneficios del sWBP en el contexto de la enfermedad respiratoria son que la monitorización de la respiración del huésped es lo más cercano de cualquier medición fisiológica para evaluar la disfunción del tejido infectado primario, a saber, el pulmón. Además de la importancia biológica, el uso de sWBP es rápido y no invasivo, minimizando el estrés en animales de investigación. Este trabajo demuestra el uso del aparato interno de sWBP para monitorear la enfermedad a lo largo del curso de la insuficiencia respiratoria en el modelo murino de melioidosis respiratoria.
Los patógenos bacterianos respiratorios a menudo se asocian con una respuesta inflamatoria en el pulmón que conduce a la patología pulmonar 1,2. En el entorno clínico, el diagnóstico de neumonía generalmente incluye técnicas de cultivo de esputo, análisis de saturación de oxígeno en sangre y radiografía de tórax. Estas técnicas se pueden traducir para modelos de infección de animales pequeños, pero solo el análisis de saturación de oxígeno representa un análisis rápido y en tiempo real en ratones para determinar la gravedad de la enfermedad. La saturación de oxígeno en sangre (SpO2) se investigó previamente como un método para rastrear la progresión de la enfermedad en estudios de enfermedades respiratorias; sin embargo, los ratones moribundos tienen lecturas inesperadamente altas de SpO2 tanto enun modelo 3 de Pseudomonas aeruginosa, que no son la enfermedad predictiva o moribunda, probablemente porque los ratones pueden modular su actividad fisiológica. Con este fin, hasta el momento no se encontraron niveles diagnósticos de SpO2 para la enfermedad respiratoria bacteriana en ratones.
Por lo tanto, este trabajo investigó el uso de otros métodos clínicamente relevantes para detectar los efectos de la enfermedad pulmonar en la función pulmonar como una medición fisiológica rápida. La pletismografía simplificada de cuerpo entero (sWBP) ofrece la oportunidad de investigar la frecuencia respiratoria y la profundidad como un análisis biométrico rápido y no invasivo. Estudios previos han demostrado cómo ensamblar aparatos WBP en un laboratorio4; sin embargo, varios de los componentes mostrados en tales estudios no están actualmente disponibles comercialmente. Además, el WBP tradicional requiere una recopilación y procesamiento de datos complejos basados en la humedad y la temperatura 5,6. Por lo tanto, se decidió desarrollar un aparato WBP simplificado que se calibra diariamente a temperatura / humedad ambiente y evaluar si la contribución de temperatura / humedad del sujeto en sí tiene algún efecto sobre el volumen de respiración medido. Por lo tanto, se ha creado un aparato sWBP modificado que obtiene los materiales disponibles actualmente. Además, se ha investigado si este aparato de laboratorio puede detectar cambios en la respiración asociados con la progresión de la enfermedad durante el modelo de melioidosis respiratoria letal en ratones.
El aparato sWBP construido para este trabajo utilizó equipos y software disponibles comercialmente para procesar datos de sensores de presión analógicos en una lectura digital. El sensor de presión se instaló en un frasco de vidrio hermético con conectores de mamparo. El beneficio de un frasco de vidrio es la rigidez estructural del material, que resistirá los cambios en la presión interna del frasco, afectando las mediciones de los cambios de volumen durante el monitoreo de la respiración. La cámara de muestreo ha sido diseñada para tener dos puertos en las dos superficies planas del frasco cuadrado, uno para acceder a la cámara mediante un conector Luer para la calibración y el otro para albergar el sensor de presión. El sensor de presión seleccionado tiene un transductor de presión manométrica altamente sensible con un rango para pequeños cambios de presión (rango de 25 mbar).
Este protocolo se demuestra utilizando un modelo murino de melioidosis respiratoria. Burkholderia pseudomallei (Bp) es el agente bacteriano de la melioidosis – una enfermedad asociada a las regiones tropicales del mundo7. La Bp se encuentra en el medio ambiente, específicamente en ambientes húmedos de agua estancada y suelo húmedo, de los cuales generalmente causa infecciones subcutáneas de cortes / arañazos de huéspedes susceptibles. Sin embargo, la Bp también es infecciosa cuando se inhala y es una amenaza potencial para su uso en bioterrorismo por dispersión de aerosoles. Mientras que la Bp totalmente virulenta requiere manipulación en un laboratorio BSL-3, previamente se diseñó una cepa mutante acapsular, que puede manejarse con seguridad en BSL-2 y excluirse de los criterios de agente selecto8. Además, se ha desarrollado un modelo de infección intratraqueal mediada por intubación (IMIT) de melioidosis respiratoria para estudiar la progresión de la enfermedad respiratoria de Bp 5,9. Hemos utilizado este modelo de infección para caracterizar el cambio en la respiración que ocurre durante la progresión de la enfermedad a través del punto final moribundo.
sWBP es un enfoque atractivo para mejorar la comprensión de la infección respiratoria en modelos de animales pequeños. Es importante destacar que es un enfoque no invasivo y, como tal, no representa un riesgo significativo de causar estrés indebido a los animales de investigación durante un desafío de infección. De hecho, el procedimiento de monitoreo de la respiración del sujeto es una prueba rápida que requiere varios minutos y un manejo mínimo del sujeto. El beneficio científico es la comprensión de alta resolución de cómo los patógenos microbianos influyen en la función pulmonar durante la enfermedad. Este enfoque proporcionará beneficios a la investigación básica, facilitando la comprensión de cómo un patógeno causa la enfermedad, así como proporcionando una utilidad traslacional para comprender cómo una nueva terapéutica restaura un sujeto de investigación a un estado de salud respiratoria.
En este manuscrito, se proporcionan resultados representativos para el patógeno B. pseudomallei, que causa una respuesta letárgica temprana. No todas las infecciones pulmonares bacterianas se presentan de la misma manera en los modelos de infección de ratón. La experiencia previa con otros modelos de infección ha demostrado que el patógeno bacteriano Klebsiella pneumoniae se presenta como una infección asintomática hasta el punto en que los ratones sucumben a la infección, también aproximadamente en el día 3 después de la infección11. Se plantea la hipótesis de que la demanda del huésped de aire inspirado (es decir, volumen diminuto) puede relacionarse estrechamente con el grado de letargo con el que se presenta una enfermedad determinada. Se requerirán estudios futuros para examinar cómo los diferentes patógenos bacterianos afectan la función pulmonar durante la enfermedad respiratoria. Se entiende que los diferentes patógenos tienen enfoques únicos para evadir la defensa del huésped, incluidas las diferencias en, (1) la propensión a ser patógenos intracelulares o extracelulares, (2) la capacidad de causar una respuesta hipotérmica temprana / tardía, y (3) el uso de diferentes repertorios de determinantes de virulencia 3,12,13. Por lo tanto, es probable que diferentes estrategias de enfermedad den lugar a efectos únicos sobre la función pulmonar y la respiración durante la infección.
La configuración recomendada descrita en este protocolo se puede modificar para adaptarse a los desafíos únicos presentes durante sWBP. Uno de los problemas comunes experimentados durante una sesión de grabación de sWBP es el movimiento del sujeto dentro de la Cámara de Muestras. Como se mencionó, este movimiento modifica la línea de base y puede afectar la precisión de las mediciones de respiración. Se utilizó un filtro digital para normalizar la línea de base cambiante, lo que permite mediciones de respiración viables a pesar de pequeños movimientos. El movimiento excesivo puede empujar una medición de línea base fuera del rango de una entrada a cero. Las grabaciones se recomiendan en un rango de 1 mV (ajuste del canal 1), lo que proporciona un compromiso de seguir observando los picos de la pletismografía y evitar la pérdida de datos fuera del rango. Para sujetos excepcionalmente activos, puede ser necesario ampliar el rango de grabación >1 mV para evitar señales persistentes fuera de rango.
El procedimiento recomendado requiere una calibración diaria (o en cada sesión) para adaptarse a las fluctuaciones de humedad / temperatura ambiental. El WBP tradicional utiliza cálculos complejos que tienen en cuenta la temperatura/humedad tanto del ambiente como del sujeto 5,6. Se ha demostrado que en el actual aparato sWBP, los efectos de la temperatura/humedad del huésped no alteran significativamente el volumen de aliento medido de una fuente de calibración. Por lo tanto, este enfoque en sWBP difiere fundamentalmente del enfoque de >50 años de Drorbaugh y Fenn. Aquí, sWBP relaciona directamente los cambios de presión con un volumen de respiración medido sin corrección adicional por parte del huésped.
Es esencial contrastar el WBP animal de investigación con el WBP clínico. Los tipos de datos biométricos que se intentaron recopilar mediante sWBP son el volumen y la frecuencia de la respiración. Dichas mediciones se recopilan clínicamente utilizando un equipo de espirometría simple en el que un paciente sostiene un monitor de aliento en su boca y respira normalmente en un dispositivo que monitorea el flujo de aire. Una espirometría similar en animales de investigación requiere moderación, lo que contribuye al estrés y a una interrupción inherente de la respiración. Por lo tanto, la espirometría simple es funcional clínicamente pero no para animales de investigación. WBP tiene un propósito esencial en la clínica para recopilar datos avanzados, incluidas mediciones como el volumen pulmonar residual. Dichos datos solo pueden estar contenidos en el contexto de que un sujeto pueda seguir instrucciones sobre cómo respira, incluida la espiración forzada (vaciado de su pulmón por una exhalación profunda). No se puede confiar en que los animales de investigación sigan las instrucciones de respiración de un investigador. Muchas de las mediciones avanzadas recogidas clínicamente durante el dolor corporal no se pueden reproducir en animales de investigación. El WBP en animales de investigación es fundamentalmente diferente del WBP clínico. Animal WBP busca recopilar datos de ventilación simples (frecuencia respiratoria y volumen) de una manera no restringida para evitar el estrés animal y la perturbación de la respiración. Hasta ahora, el uso de WBP en animales de investigación parece replicar las técnicas utilizadas en WBP clínico, incluidos cálculos complejos basados en la temperatura y humedad ambiental y del sujeto, pero sin la capacidad de recopilar los datos avanzados de un sujeto que puede seguir instrucciones sobre cómo realizar una expiración forzada. Con esto en mente, se buscó demostrar si una versión simplificada de WBP sería suficiente para recopilar la frecuencia respiratoria pertinente y el volumen relevante para los estudios de enfermedades respiratorias. Se empleó una sesión de calibración, que compensó cualquier variación en la temperatura y humedad ambiental. Además, se demostró con un ratón artificial que someter la temperatura y la humedad a un volumen de respiración medido no tienen un efecto significativo en la medición precisa del volumen de respiración. Se concluyó que sWBP tiene una excelente aplicación para la investigación de estudios en animales, sin el requisito del usuario de emplear un tratamiento matemático engorroso de los datos.
The authors have nothing to disclose.
Estos estudios fueron apoyados por la subvención COBRE P20GM125504-01 del Subproyecto 8246 de los Institutos Nacionales de Salud.
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |