Denne protokollen presenterer konstruksjon og bruk av et forenklet helkropps pletysmografiapparat for å overvåke bakteriell respiratorisk sykdomsprogresjon ikke-invasivt.
Surrogatdyrmodeller av sykdom er underlagt 3Rs of Responsible Research. Det er en hyppig revisjon av forbedringer til dyremodeller for å sikre at både dyrevelferd og vitenskapelig innsikt avanserer med tilgjengeligheten av ny teknologi. Denne artikkelen demonstrerer bruken av forenklet Whole Body Plethysmography (sWBP) for å ikke-invasivt studere respirasjonssvikt i en modell av dødelig respiratorisk melioidose. sWBP har følsomheten for å oppdage pusting hos mus gjennom hele sykdomsforløpet, slik at de døende assosierte symptomene (bradypné og hypopné) kan måles og potensielt brukes til å utvikle humane endepunktkriterier.
Noen av fordelene med sWBP i sammenheng med luftveissykdom er at vertspusteovervåking kommer nærmest enhver fysiologisk måling ved vurdering av dysfunksjon av det primære infiserte vevet, nemlig lungen. I tillegg til biologisk betydning er bruken av sWBP rask og ikke-invasiv, noe som minimerer stress hos forsøksdyr. Dette arbeidet demonstrerer bruken av internt sWBP-apparat for å overvåke sykdom i løpet av respiratorisk svikt i murine modell av respiratorisk melioidose.
Respiratoriske bakterielle patogener er ofte forbundet med en inflammatorisk respons i lungen som fører til lungepatologi 1,2. I klinisk setting inkluderer diagnose av lungebetennelse vanligvis kulturteknikker fra sputum, blod-oksygenmetningsanalyse og røntgenrøntgen. Disse teknikkene kan oversettes for små dyreinfeksjonsmodeller, men bare oksygenmetningsanalyse representerer en rask sanntidsanalyse hos mus for sykdomsalvorlighetsgrad. Oksygenmetningen i blodet (SpO2) ble tidligere undersøkt som en metode for å spore sykdomsprogresjon i respiratoriske sykdomsstudier; Imidlertid har døende mus uventet høye SpO2-avlesninger både i en Pseudomonas aeruginosa modell3, som ikke er den prediktive eller døende sykdommen, sannsynligvis fordi mus kan modulere sin fysiologiske aktivitet. Til dette formål ble diagnostiske nivåer av SpO2 ikke funnet for bakteriell respiratorisk sykdom hos mus så langt.
Derfor undersøkte dette arbeidet bruken av andre klinisk relevante metoder for å oppdage effekten av lungesykdom på lungefunksjonen som en rask fysiologisk måling. Simplified Whole Body Plethysmography (sWBP) gir mulighet til å undersøke pustefrekvens og dybde som en rask, ikke-invasiv biometrisk analyse. Tidligere studier har vist hvordan man monterer WBP-apparater i et laboratorium4; Imidlertid er flere av komponentene vist i slike studier for tiden ikke kommersielt tilgjengelige. Videre krever tradisjonell WBP kompleks datainnsamling og databehandling basert på fuktighet og temperatur 5,6. Derfor ble det besluttet å utvikle et forenklet WBP-apparat som kalibreres daglig til romtemperatur / fuktighet og vurdere om temperaturen / fuktighetsbidraget til selve motivet har noen effekt på det målte pustevolumet. Dermed er det opprettet et modifisert sWBP-apparat som kilder til de tilgjengelige materialene. Videre har det blitt undersøkt om dette laboratoriebaserte apparatet kan oppdage endringer i pusten assosiert med sykdomsprogresjon under modellen av dødelig respiratorisk melioidose hos mus.
SWBP-apparatet konstruert for dette arbeidet brukte kommersielt tilgjengelig utstyr og programvare for å behandle analoge trykksensordata til en digital avlesning. Trykksensoren ble montert på en lufttett glasskrukke med skottkontakter. Fordelen med en glassburk er materialets strukturelle stivhet, som vil motstå endringer i krukkens indre trykk, noe som påvirker målinger av volumendringer under overvåking av pusten. Prøvetakingskammeret er konstruert for å ha to porter på de to flate overflatene på den firkantede krukken, en for å få tilgang til kammeret med en Luer-kontakt for kalibrering og den andre for å huse trykksensoren. Den valgte trykksensoren har en svært følsom målertrykktransduser med et område for små trykkendringer (25 mbar rekkevidde).
Denne protokollen er demonstrert ved hjelp av en murine modell av respiratorisk melioidose. Burkholderia pseudomallei (Bp) er bakterielt middel for melioidose – en sykdom forbundet med tropiske områder i verden7. Bp finnes i miljøet, spesielt i våte miljøer med stående vann og fuktig jord, hvorfra det vanligvis forårsaker subkutane infeksjoner av kutt / riper av følsomme verter. Imidlertid er Bp også smittsom ved innånding og er en potensiell trussel for bruk i bioterrorisme ved aerosolspredning. Mens fullstendig virulent Bp krever håndtering i et BSL-3-laboratorium, ble en akapsulær mutantstamme tidligere konstruert, som trygt kan håndteres ved BSL-2 og utelukkes fra de utvalgte agentkriteriene8. Videre er det utviklet en intubasjonsmediert intratrakeal (IMIT) infeksjonsmodell for respiratorisk melioidose for å studere progresjon av luftveissykdommer av Bp 5,9. Vi har brukt denne infeksjonsmodellen til å karakterisere pusteendringen som oppstår under sykdomsprogresjon gjennom det døende endepunktet.
sWBP er en attraktiv tilnærming for å øke forståelsen av luftveisinfeksjon i smådyrmodeller. Det er viktig at det er en ikke-invasiv tilnærming, og som sådan utgjør den ikke en betydelig risiko for å forårsake unødig stress for forsøksdyr under en infeksjonsutfordring. Faktisk er prosedyren for å overvåke forsøkspersonens pusting en rask test som krever flere minutter og minimal pasienthåndtering. Den vitenskapelige fordelen er den høyoppløselige forståelsen av hvordan mikrobielle patogener påvirker lungefunksjonen under sykdom. Denne tilnærmingen vil gi nytte for grunnforskning, forenkle forståelsen av hvordan et patogen forårsaker sykdom, samt gi et translasjonelt verktøy for å forstå hvordan en ny terapeutisk gjenoppretter et forskningsemne til en tilstand av respiratorisk helse.
I dette manuskriptet er det gitt representative resultater for patogenet B. pseudomallei, noe som forårsaker en tidlig sløv respons. Ikke alle bakterielle lungeinfeksjoner finnes på samme måte i museinfeksjonsmodeller. Tidligere erfaring med andre infeksjonsmodeller har vist at bakteriepatogenet Klebsiella pneumoniae presenterer seg som en asymptomatisk infeksjon frem til det punktet hvor mus bukker under for infeksjon, også på omtrent dag 3 etter infeksjon11. Det er en hypotese at vertens behov for inspirert luft (dvs. minuttvolum) kan være nært knyttet til graden av sløvhet som en gitt sykdom presenterer. Fremtidige studier vil være nødvendig for å undersøke hvordan forskjellige bakterielle patogener påvirker lungefunksjonen under luftveissykdom. Det er forstått at forskjellige patogener har unike tilnærminger for å unngå vertsforsvar, inkludert forskjeller i, (1) tilbøyelighet til å være intracellulære eller ekstracellulære patogener, (2) evnen til å forårsake tidlig / sen hypoterm respons og (3) bruk av forskjellige repertoarer av virulensdeterminanter 3,12,13. Derfor er det sannsynlig at ulike sykdomsstrategier vil resultere i unike effekter på lungefunksjon og pust under infeksjon.
De anbefalte innstillingene som er beskrevet i denne protokollen, kan endres for å imøtekomme unike utfordringer som er tilstede under sWBP. Et av de vanligste problemene som oppleves under en sWBP-innspilling, er motivets bevegelse i prøvekammeret. Som nevnt endrer denne bevegelsen grunnlinjen og kan påvirke nøyaktigheten av pustemålinger. Et digitalt filter ble brukt til å normalisere den skiftende grunnlinjen, slik at levedyktige pustemålinger til tross for små bevegelser. Overdreven bevegelse kan skyve en grunnlinjemåling ut av rekkevidden til en nullet inngang. Opptak anbefales ved 1 mV-område (kanal 1-innstilling), noe som gir et kompromiss om fortsatt å observere toppene i plethysmografien samtidig som man unngår tap av data utenfor rekkevidde. For eksepsjonelt aktive personer kan det være nødvendig å utvide opptaksområdet >1 mV for å unngå vedvarende signaler utenfor rekkevidde.
Den anbefalte prosedyren krever daglig kalibrering (eller ved hver økt) for å imøtekomme fuktighet / temperatursvingninger i omgivelsene. Tradisjonell WBP bruker komplekse beregninger som tar hensyn til temperatur / fuktighet i både miljø og emne 5,6. Det er vist at i det nåværende sWBP-apparatet endrer ikke effekten av vertstemperaturen/-fuktigheten signifikant det målte pustevolumet til en kalibreringskilde. Derfor skiller denne tilnærmingen i sWBP seg fundamentalt fra den >50 år gamle tilnærmingen til Drorbaugh og Fenn. Her relaterer sWBP direkte trykkendringer til et målt pustevolum uten ytterligere korreksjon fra verten.
Det er viktig å kontrastere forskningsdyret WBP til det for klinisk WBP. De typer biometriske data som ble forsøkt å samle inn av sWBP er pustevolum og frekvens. Slike målinger samles klinisk ved hjelp av enkelt spirometriutstyr der en pasient holder en pustemonitor til munnen og puster normalt inn i en enhet som overvåker luftstrømmen. Lignende spirometri hos forsøksdyr krever selvbeherskelse, og bidrar dermed til stress og en iboende forstyrrelse i pusten. Derfor er enkel spirometri funksjonell klinisk, men ikke for forsøksdyr. WBP tjener et viktig formål i klinikken for å samle inn avanserte data, inkludert slike målinger som gjenværende lungevolum. Slike data kan bare finnes i sammenheng med at et emne kan følge instruksjonene om hvordan de puster, inkludert tvungen utløp (tømming av lungen ved dyp utånding). Forsøksdyr kan ikke stoles på for å følge pusteinstruksjoner fra en forsker. Mange av de avanserte målingene samlet klinisk under WBP kan ikke reproduseres i forsøksdyr. WBP i forsøksdyr er fundamentalt forskjellig fra klinisk WBP. Animal WBP søker å samle enkle ventilasjonsdata (pustefrekvens og volum) på en ikke-begrenset måte for å unngå dyrestress og pusteforstyrrelse. Så langt ser bruken av WBP i forsøksdyr ut til å replikere teknikkene som brukes i klinisk WBP, inkludert komplekse beregninger basert på miljø- og emnetemperatur og fuktighet, men uten muligheten til å samle inn avanserte data fra et emne som kan følge instruksjonene om hvordan man utfører en tvungen utløp. Med dette i bakhodet ble det søkt å demonstrere om en forenklet versjon av WBP ville være tilstrekkelig til å samle den relevante pustefrekvensen og volumet som er relevant for respiratoriske sykdomsstudier. En kalibreringsøkt ble benyttet, som kompenserte for enhver variasjon i miljøtemperatur og fuktighet. Videre ble det demonstrert med en kunstig mus at den utsatte temperaturen, og fuktigheten til et målt pustevolum ikke har noen signifikant effekt på nøyaktig måling av pustevolum. Det ble konkludert med at sWBP har utmerket anvendelse for å forske på dyreforsøk, uten krav fra brukeren om å bruke tungvint matematisk behandling av data.
The authors have nothing to disclose.
Disse studiene ble støttet av National Institutes of Health COBRE grant P20GM125504-01 Sub-Project 8246.
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |