Summary
Her præsenterer protokollen fremstillingen af naringeninopløsning til in vivo intraperitoneal administration. Naringenin er fuldt opløst i en blanding af dimethylsulfoxid, Tween 80 og saltvand. De antidiabetika osteoporotiske virkninger af naringenin blev vurderet ved blodglukosetest, tartratresistent syrefosfatasefarvning og enzymbundet immunosorbentassay.
Abstract
Fremstillingen af en sammensat (fytokemisk) opløsning er et overset, men kritisk trin forud for dets anvendelse i undersøgelser såsom lægemiddelscreening. Den fuldstændige opløselighed af forbindelsen er nødvendig for sikker anvendelse og relativt stabile resultater. Her demonstreres en protokol til fremstilling af naringeninopløsning og dens intraperitoneale administration i en fedtfattig diæt og streptozotocin (STZ) -induceret diabetisk model som et eksempel. En lille mængde naringenin (3,52-6,69 mg) blev anvendt til at teste dets opløselighed i opløsningsmidler, herunder henholdsvis ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO) og DMSO plus Tween 80 rekonstitueret i fysiologisk saltvand (PS). Fuldstændig opløselighed af forbindelsen bestemmes ved at observere opløsningens farve, tilstedeværelsen af bundfald efter centrifugering (2000 x g i 30 s) eller lade opløsningen stå i 2 timer ved stuetemperatur (RT). Efter opnåelse af en stabil forbindelse/fytokemisk opløsning kan den endelige koncentration/mængde af forbindelsen, der kræves til in vivo-undersøgelser , fremstilles i en opløsningsmiddel-only (ingen PS) stamopløsning og derefter fortyndes/blandes med PS efter ønske. De antidiabetiske osteoporotiske virkninger af naringenin hos mus (intraperitoneal administration ved 20 mg/kg legemsvægt, 2 mg/ml) blev vurderet ved måling af blodsukker, knoglemasse (mikro-CT) og knogleresorptionshastighed (TRAP-farvning og ELISA). Forskere, der leder efter detaljerede organiske / fytokemiske opløsningspræparater, vil drage fordel af denne teknik.
Introduction
Med stigende undersøgelser vedrørende brugen af fytokemiske forbindelser til lægemiddelscreening er tilgange til fremstilling af fytokemiske løsninger til evaluering af deres optimale virkninger værd at være opmærksomme på. Mange aspekter såsom opløsningsmetoden, dosering og koncentration skal overvejes ved fremstilling af forbindelsen1.
Opløsningsmiddelbaseret opløsning anvendes i vid udstrækning til fremstilling af organiske forbindelser1. De almindeligt anvendte opløsningsmidler omfatter vand, olie, dimethylsulfoxid (DMSO), methanol, ethanol, myresyre, Tween, glycerin osv.2. Selvom en suspension med uopløste stoffer er acceptabel, når forbindelsen administreres ved gastrisk sonde, er et fuldt opløst opløst stof kritisk for intravenøs administration. Da olieopløsning, suspension og emulsion kan forårsage kapillærembolier, foreslås en vandig opløsning til sammensat præparation, især ved administration af intravenøse, intramuskulære og intraperitoneale injektioner3.
Det effektive dosisområde varierer mellem forbindelser og endda blandt sygdomme behandlet med samme forbindelse. Bestemmelse af den effektive og den sikre dosis og koncentrationen afhænger af litteratur og indledende forsøg4. Her demonstreres fremstillingen af forbindelsen naringenin som et eksempel.
Naringenin (4,5,7-trihydroxy-flavanon), en polyfenolisk forbindelse, er blevet undersøgt i sygdomsbehandling for dets hepatoprotektive5, antidiabetika6, antiinflammatoriske7 og antioxidantaktiviteter8. Til in vivo-applikationer anvendes oral administration af naringenin almindeligvis. Tidligere undersøgelser rapporterede fremstilling af naringeninopløsning i 0,5% -1% carboxymethylcellulose, 0,5% methylcellulosedosis, 0,01% DMSO og fysiologisk saltvand (PS) ved 50-100 mg / kg, administreret ved oral sonde 9,10,11,12. Desuden har andre undersøgelser rapporteret at supplere naringenin med chow ved 3% (wt / wt) til oral indtagelse i en dosis på 3,6 g / kg / d13,14. Undersøgelser har også rapporteret ved hjælp af ethanol (0,5% v / v), PS og DMSO til opløsning af naringenin til intraperitoneal injektion ved 10-50 mg / kg15,16,17,18. I en undersøgelse af temporal lobe epilepsi modtog mus en injektion af naringenin suspenderet i 0,25% carboxymethylcellulose opløst i PS19. Selvom disse undersøgelser rapporterer brugen af forskellige opløsningsmidler til fremstilling af naringeninopløsninger, er der ikke rapporteret yderligere detaljer, såsom opløsningsstatus og dyrerespons.
Denne protokol indfører en procedure til fremstilling af naringeninopløsning til in vivo-anvendelse i diabetisk induceret osteoporose. Fremstillingen af injektionsopløsningen inkluderer fremstilling af opløsningsmidler og forbindelser, doseringsestimering, opløsningsproces og filtrering. Doseringen blev bestemt ud fra litteraturforskning og foreløbige eksperimenter ved at overvåge mus efter administration af injektioner hver dag i 3 dage og ændre doseringen i henhold til museadfærd. Den endelige valgte koncentration (20 mg/kg legemsvægt) blev administreret intraperitonealt 5 dage om ugen i 8 uger i en fedtrig diæt og streptozotocin (STZ)-inducerede diabetiske mus20,21. Virkningerne af naringenin i diabetisk osteoporose blev evalueret ved blodglukosetest, mikro-CT, tartratresistent syrephosphatase (TRAP) farvning og enzymbundet immunosorbentassay (ELISA).
Samlet set blev det observeret, at naringenin i et koncentrationsinterval på 40-400 mg/ml ikke opløses fuldstændigt i hverken ethanol eller DMSO eller 5% (ethanol eller DMSO) plus 95% PS (v/v). Naringenin opløstes imidlertid fuldstændigt i en blanding af 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 og 92,96% PS. Den detaljerede procedure vil hjælpe forskere med at forberede forbindelsen som en injektionsopløsning til in vivo-anvendelse .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beskrevne undersøgelser var i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr fra National Research Council og blev godkendt af Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Animal Care and Use Committee. Ved udførelse af eksperimenterne kræves laboratoriefrakker, engangsnitrilhandsker og beskyttelsesbriller af sikkerhedsmæssige årsager.
1. Fremstilling af opløsningsmidler og estimering af naringenin, der er nødvendig til in vivo-anvendelse
- Forbered følgende opløsningsmidler: Tween-80 (endeligt koncentrationsområde: 0,5% -1%), DMSO, glycerin (endeligt koncentrationsområde: 15% -20%), ethanol (endeligt koncentrationsområde: 12% til intramuskulær injektion)22 og 0,9% PS.
- Anslå mængden af naringenin, der kræves, baseret på dosis, antal mus og injektionsfrekvens.
- Bestil 10 mus (C57BL/6, han, 5 uger gammel, SPF) til administration af naringenin 5 dage om ugen i 8 uger. Hold mus i specifikke patogenfrie (SPF) forhold.
BEMÆRK: Den dosis, der kræves til intraperitoneal injektion, er 20 mg/kg b.w.23. - 160 mg naringenin vejes ud fra følgende beregning: 20 mg/kg x 0,02 kg/mus x 10 mus x 5 dage/uge x 8 uger = 160 mg.
- Bestil 10 mus (C57BL/6, han, 5 uger gammel, SPF) til administration af naringenin 5 dage om ugen i 8 uger. Hold mus i specifikke patogenfrie (SPF) forhold.
- Beregn koncentrationen af naringenin, der skal injiceres in vivo.
- Forbered det anbefalede volumen baseret på musenes kropsvægt. Det anbefalede volumen naringenin påført hver mus er 1% af kropsvægten (0,3 ml). I dette forsøg blev der anvendt 0,2 ml pr. Mus.
- Beregn det samlede volumen: 0,2 ml pr. mus x 10 mus x 5 dage/uge x 8 uger = 80 ml.
- Koncentrationen af Naringenin på lager beregnes: 160 mg/80 ml opløsningsmidler = 2 mg/ml.
- Beregn volumen for hver dag: 0,2 ml pr. mus x 10 mus = 2 ml.
2. Opløsning
- Ethanol opløsning
- For at forberede naringeninopløsning ved 2 mg / ml vejes 3,52 mg naringenin og tilsættes i et 2,0 ml rør.
BEMÆRK: For at opnå en koncentration på 2 mg/ml vil det samlede krævede volumen være 1760 μL (beregning: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml). - Drej hurtigt ned (2000 x g i 30 s) for at få naringeninpulveret til at sætte sig i bunden af røret (figur 1A).
- Der tilsættes 8,8 μL 100 % ethanol til røret for at fremstille en 0,5 % (v/v) opløsning i forhold til det samlede krævede volumen2. Naringenin opløses ikke fuldstændigt (figur 1B).
- Fortsæt med at tilsætte 79,2 μL 100% ethanol til røret for at fremstille en 5% (v / v) opløsning med hensyn til det samlede krævede volumen (beregning: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). Naringenin opløses ikke fuldstændigt (figur 1B).
- Der tilsættes 1672 μL 0,9 % PS til røret indeholdende 5 % ethanol som beskrevet i trin 2.1.4. Dette vil producere en emulsion (figur 1D). Centrifuge (2000 x g for 30 s) opløsningen til at kontrollere, om naringenin er helt opløst i opløsningen. Hvide bundfald af uopløst naringenin vises i opløsningen (figur 1E).
- For at forberede naringeninopløsning ved 2 mg / ml vejes 3,52 mg naringenin og tilsættes i et 2,0 ml rør.
- DMSO-løsning
- For at fremstille naringeninopløsning ved 2 mg/ml vejes 3,95 mg naringenin og tilsættes i et 2,0 ml rør.
BEMÆRK: For at opnå en koncentration på 2 mg/ml vil det samlede krævede volumen være 1975 μL (beregning: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml). - Drej hurtigt ned (2000 x g i 30 s) for at få naringeninpulveret til at sætte sig i bunden af røret.
- Der tilsættes 9,8 μL DMSO til røret for at fremstille en 0,5 % (v/v) opløsning (beregning: 9,8 μL/1975 μL x 100 % = 5 %). Naringenin opløses fuldstændigt (figur 2A).
- Der tilsættes 88,2 μL DMSO til røret for at fremstille en 5% (v/v) opløsning i forhold til det samlede krævede volumen (beregning: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). Naringenin opløses fuldstændigt (figur 2B).
- Der tilsættes 1877 μL 0,9 % PS (v/v 95 %) til den opløsning, der er fremstillet i trin 2.2.4. Der fremstilles en emulsion (figur 1C). Centrifuge (2000 x g for 30 s) opløsningen til at kontrollere, om naringenin er helt opløst i opløsningen. Hvide bundfald af uopløst naringenin vises i opløsningen (figur 1D).
- For at fremstille naringeninopløsning ved 2 mg/ml vejes 3,95 mg naringenin og tilsættes i et 2,0 ml rør.
- Tween-80 og DMSO løsning
- For at forberede naringeninopløsningen ved 2 mg / ml vejes 6,69 mg naringenin og tilsættes i et 5,0 ml rør.
BEMÆRK: For at opnå den endelige koncentration på 2 mg/ml vil det samlede krævede opløsningsvolumen være 3345 μL (beregning: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml). - Drej hurtigt ned (2000 x g i 30 s) for at få naringeninpulveret til at sætte sig i bunden af røret.
- Der tilsættes 117,7 μL DMSO for at fremstille en 3,5 % (v/v) opløsning i forhold til det samlede krævede volumen (beregning: 117,7 μL /3345 μL x 100 % = 3,5 %). Naringenin opløses fuldstændigt (figur 3A)
- Der tilsættes 117,7 μL Tween 80 til den opløsning, der blev fremstillet i trin 2.3.3, for at opnå 3,5 % (v/v) Tween 80 og 3,5 % (v/v) DMSO. Overhold den fuldstændige opløsning af naringenin (figur 3B)
- Opløsningen, der er fremstillet i trin 2.3.4, tilsættes langsomt til et 5,0 ml rør indeholdende 3109,6 μL 0,9% PS (v/v procent af 93%) og rystes godt for at opnå en tilsyneladende naringeninopløsning (figur 3C).
- Den opløsning, der er fremstillet i trin 2.3.5, henstår ved stuetemperatur (RT) i 2 timer. Løsningen er stadig tydelig uden synlige bundfald (figur 3D).
- For at forberede naringeninopløsningen ved 2 mg / ml vejes 6,69 mg naringenin og tilsættes i et 5,0 ml rør.
- Fremstilling af naringeninopløsning til in vivo-administration
- I henhold til trin 1.2.2 vejes 160 mg naringenin (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).
- Tilsæt 2,8 ml DMSO for at opnå 3,5% (v/v) opløsning (beregning: 2,8 ml / 80 ml x 100% = 3,5%)
- Derefter tilsættes 2,8 ml Tween 80 til opløsningen fremstillet i trin 2.4.2 for at opnå 3,5% (v/v) Tween 80 og 3,5% (v/v) DMSO.
- Aliquot opløsningen fremstillet i trin 2.4.3 i fire rør, 1,4 ml pr. rør [(2,8 ml + 2,8 ml) / 4 = 1,4 ml].
- Aliquot 18,6 ml med 0,9 % PS til fem 15 ml rør.
- Opløsningen i trin 2.4.3 (stamopløsning) og 2.4.5 opbevares ved 4 °C (2,8 ml + 2,8 ml + 18,6 ml x 4 = 80 ml).
- Der tages 140 μL stamopløsning (trin 2.4.3) og blandes med 1860 μL 0,9 % PS for at forberede 2 ml naringeninopløsning til 1 dages administration.
- Opløsningen filtreres gennem et filter på 0,2 μm.
3. Administration af Naringenin-løsning
- Håndtering og fastholdelse
- Sprøjt buret og hænderne med 70-75% alkohol, inden låget åbnes. Løft musen ved bunden af halen og læg den på en solid overflade for at placere halen forsigtigt tilbage.
- Tag fat i nakkestumpen bag ørerne med venstre tommel- og pegefinger og placer halen mellem den lille og ringfingeren. Hold musen i liggende stilling med den bageste ende let forhøjet.
- Injektion
- Tag fat i musens baghud, så maveskindet er stramt.
- Skub nålen (insulinsprøjten) ind i en vinkel på 10° mellem nålen og maveoverfladen i nederste højre eller venstre kvadrant i maven for at undgå at ramme blæren, leveren eller andre indre organer.
- Kør nålen subkutant i kranieretning i 3-5 mm, og indsæt den derefter i en 45 ° vinkel i bukhulen.
- Når nålen passerer gennem bugvæggen, og modstanden forsvinder, skal du udføre en ambition om at bekræfte, at intet tilbagesvalingsmateriale trækkes tilbage. Tryk derefter langsomt på løsningen.
- Efter injektionen skal du langsomt trække nålen ud og dreje den lidt for at forhindre lækage. Det anbefalede volumen er 50-100 μL/10 g.
- Bortskaf rester af Naringenin i en beholder til biologisk risiko.
4. Blodprøve
BEMÆRK: Test blodsukkeret 1 dag før injektionen og 1 og 2 måneder efter injektionen.
- Hurtig musene i 15 timer før blodsukkertesten. Der kan fortsat leveres vand.
- Åbn teststrimlerne, og marker datoen. Når teststrimlerne er åbnet, skal du bruge dem inden for 3 måneder. Teststrimlerne opbevares ved 2-30 °C. Luk låget tæt efter fjernelse af strimlen for at forhindre dannelse af fugt.
- Placer dyret i induktionskammeret. Tænd fordamperen ved et induktionsniveau på 4% for isofluran og 4 L/min for ilt. Når dyret er fuldt bedøvet, skal bedøvelsesmidlet med næsekeglen og bedøvelsesafgivelsen holdes på et niveau på 1,5% for isofluran og 0,4 l / min for ilt.
- Tør halen af med vatpinde/vatpinde gennemblødt i 70%-75% alkohol.
- Start fra det laveste punkt i halen, lav en lille punktering på den laterale halevene med en 25G nålestik og pres en dråbe blod ud.
- Tør bloddråben af med et silkepapir.
- Klem en anden dråbe blod ud og saml den på kanten af en teststrimmel.
- Læs og registrer resultatet, der vises på glukosemåleren.
- For at stoppe blødningen skal du klemme musens hale med en steril gasbind og tørre området med 75% alkohol.
- Yderligere prøver kan opnås ved en lignende teknik, der bevæger sig kranielt op ad halen.
5. TRAP farvning
- Forberedelse af dias
- Udfør fastende blodglukosetest på musene en gang om ugen. Når blodsukkerniveauet er ≥ 11,1 mmol / L (tegn på vellykket type II-diabetesmus model 24), skal du aflive musene ved hjælp af CO2 efterfulgt af cervikal disklokation og indsamle lændehvirvelsøjlen 4.-6. (L4-L6) (ingen eutanasi udføres under fastende blodglukosetest).
- Fix L4-L6-prøverne med 4% paraformaldehyd i 24 timer (sørg for, at volumenet af paraformaldehyd er >20x vævets volumen), og vask derefter i 2 timer i kontinuerlig strøm af ledningsvand.
- For at afkalke prøverne nedsænkes de i en 10% ethylendiamintetraeddikesyreopløsning (EDTA) i 2 uger ved RT i statisk tilstand, indtil prøverne er blødgjort. Sørg for, at volumenet af den afkalkningsopløsning er 20-30 gange volumenet af vævet / prøven. Skift EDTA-løsningen hver anden dag.
- Dehydrere prøven ved hjælp af en dehydrator.
- Anbring prøverne i vævsbehandling, der indlejrer kassetter. Nummerer kassetten ved hjælp af en blyant.
- Indstil dehydratorprogrammet som følger: 75% alkohol i 2 timer, 85% alkohol i 1 time, 95% alkohol i 1 time, 95% alkohol i 2 timer, vandfri ethanol (I) i 2 timer, vandfri ethanol (II) i 2 timer, vandfri ethanol (III) i 2 timer, xylen (I) i 1 time, xylen (II) i 1 time, xylen (III) i 1 time, paraffinvoks (I) i 2 timer og paraffinvoks (II) i 2 timer ved RT.
- Integrer prøverne i paraffinvoks.
- Der tilsættes paraffinvoks til kassettebakken på paraffinindlejringsstationen, og opvarm den til 60 °C. Nedsænk de dehydrerede prøver i mindst 2 timer.
- Anbring vævskassetten i kassettebakken og forvarm.
- Der tilsættes paraffinvoks til paraffinbeholderen og opvarmes til 60 °C.
- Efter 2 timer skal du tage både vævskassette og prøver til arbejdsområdet. Hæld den forvarmede paraffinvoks fra paraffinbeholderen i vævskassetten. Placer prøven i paraffinvoksen, sørg for, at paraffinvoksen helt dækker vævet, og flyt derefter straks kassetten til en glasurstation.
- Brug en mikrotom til at skære de paraffinindlejrede prøver i 5-6 μm sektioner. Fold sektionerne ud i 40 °C varmt vand i mindre end 10 s. Saml sektionerne på APS (amino silan) belagte glasrutschebaner. Tør rutsjebanerne ved RT i 1 time, og flyt derefter rutsjebanerne ind i en ovn, der er indstillet til 60 °C natten over.
- Forberedelse af TRAP-reagens
- Basisinkubationsopløsning: 9,2 g vandfri natriumacetat, 11,4 g L-(+) vinsyre og 2,8 ml istid opløses i 1000 ml destilleret vand. Juster pH til 4,7-5,0, og opbevar ved RT i op til 6 måneder.
- Naphthol-etheropløsning: Opløs 0,1 g naphthol AS-BI-phosphat i 5 ml ethylenglycolmonoethylether. Opbevares ved 4 °C i op til 5 uger.
- Forbered natriumnitritopløsning: Opløs 1 g natriumnitrit i 25 ml destilleret vand. Opbevares ved 4 °C.
- Forbered pararosanilinfarvestof: Tilsæt 1 g pararosanilinbase til 20 ml 2N HCI (83 ml HCl i 417 ml vand). Brug en omrøringsplade til at opløse basen og filtrere den før brug.
- TRAP farvning
- Fyld to Coplin-krukker med 50 ml basisinkubationsopløsning, og anbring i en 37 °C ovn i 2 timer.
- Tag en Coplin krukke og tilsæt 0,5 ml naptol-ether opløsning.
- Rutsjebanerne anbringes i Coplin-krukken, og der inkuberes ved 37 °C i 1 time.
BEMÆRK: Forbered mindst tre dias til hver gruppe. - Et par minutter før inkubationstiden er forbi, tilsættes 1 ml natriumnitritopløsning og 1 ml pararosanilinfarvestof. Bland forsigtigt i 30 s og lad det stå i 2 min.
- Den opløsning, der er fremstillet i trin 5.2.2, tilsættes den anden forvarmede Coplin-krukke, der indeholder basisstamopløsningen. Bland opløsningen godt, og indsæt diasene fra Coplin-krukken i trin 5.3.3.
- Inkuber i 15-20 min ved RT.
- Skyl skiverne i en anden Coplin krukke med 200 ml PBS i 5 min.
- Modpletter skiverne med 100% hæmatoxylin i 30 s i en Coplin-krukke.
- Dehydrere skiverne med 85%, 95% og 100% alkohol (200 ml) i 2 min hver og behandle i xylen (200 ml) i 2 minutter i 3x. Brug Coplin-krukker til at udføre hvert trin.
- Fastgør sektionen på dækglasset med en dækslip med harpiks. Sørg for at undgå fangst af luftbobler.
6. ELISA
- Forberedelse af prøver
- Fjern det bløde væv fra lårbenet og skinnebenet på musen. Rengør knoglerne med gasbind.
- Knogleprøverne anbringes i et 1 ml mikrocentrifugerør, og prøverørene opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Prøverne kan også opbevares i en flydende nitrogentank i højst 6 måneder. - Væg knogleprøven. Fortynd med 0,9% PS i et forhold på 1:10. For eksempel fortyndes 0,1 g knogle med 1 ml PS.
- Tilsæt 3 mm zirkoniaperler i røret og slib prøverne 3x ved 70 Hz i 30 s med 20 s hvile imellem.
- Prøverne centrifugeres ved 4 °C og 12 000 x g i 5 min. Saml supernatanten.
- ELISA analysesæt
BEMÆRK: Udfør ELISA i henhold til den analyseprotokol, der er angivet af producenten.- Der tilsættes 100 μL af hver fortynding af standard, blindprøve og prøve i de relevante brønde. Inkuberes i 90 minutter ved 37 °C.
- Dekantér væsken fra hver brønd, og tilsæt 100 μL biotinyleret detektionsantistofarbejdsopløsning. Inkuberes i 1 time ved 37 °C.
- Dekantér opløsningen, tilsæt 350 μL vaskebuffer til hver brønd. Sug i 1 min, gentag 3x.
- Tilsæt 100 μL HRP-konjugeret arbejdsløsning til hver brønd. Inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- Dekanter opløsningen. Vaskeprocessen gentages 5x som beskrevet i trin 6.2.3.
- Der tilsættes 90 μL substratreagens. Inkuberes i 15 minutter ved 37 °C beskyttet mod lys.
- Der tilsættes 50 μL stopopløsning.
- Brug en pladelæser til at registrere absorbansen af hver brønd ved 450 nm.
- Generering af standardkurve
- De respektive gennemsnitlige absorbansværdier afbildes i forhold til de serielt fortyndede proteinkoncentrationer.
- Deltag i punkterne for at skabe den bedste pasformkurve. Brug et hvilket som helst passende computerprogram (regneark) til at generere standardkurveligningen.
- Absorbansværdien for hver prøve erstattes i standardkurveligningen for at opnå koncentrationen af den respektive prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kropsvægten af de fedtfattige diætfodrede og STZ-inducerede diabetiske mus viste sig at falde sammenlignet med kontrolgrupperne fra 0-8 uger efter STZ-behandling. Vægttabet hos naringeninbehandlede mus var signifikant sammenlignet med de ikke-behandlede mus (STZ-gruppen) i uge 4. Kontrol- og STZ-grupperne blev administreret med samme mængde PS (tabel 1). Blodsukkerniveauet hos diabetiske mus steg dramatisk inden for 1 måned efter STZ-induktion. Det faldt derefter automatisk til et niveau, der blev observeret for 2 måneder siden, da dyremodellen blev etableret. Naringenin-behandling sænkede blodsukkerniveauet med henholdsvis 51,8 % og 34,8 % efter henholdsvis 1 og 2 måneder (tabel 2). STZ-inducerede diabetiske mus udviste knogletab, som det fremgår af faldet i knoglevolumen / vævsvolumen (BV / TV) (30,97%) og antallet af trabeculae (Tb.N) (11,4%). Ændringerne i værdierne for disse to parametre tyder på, at naringeninbehandling signifikant reddede knogletabet (tabel 3). Osteoklastaktivitet som angivet ved N.oc/Tb.Ar (osteoklasttal pr. trabekulært knogleområde) blev øget i fedtfattig kost og STZ-inducerede diabetiske mus, selvom der ikke blev observeret nogen statistisk signifikans mellem kontrol- og sygdomsmodellerne. Naringenin-behandling reducerede signifikant osteoklastaktiviteterne, som vist i figur 4 og tabel 4. Det C-terminale telopeptid af type I kollagen (CTIX) og N-terminalpropeptid af type I procollagen (PINP) blev forhøjet med henholdsvis 68,09% og 204,88% hos diabetiske dyr, hvilket indikerer en dramatisk stigning i knogleresorptionshastigheden. Naringenin reducerede signifikant begge indikatorer for knogleresorptionshastigheden (tabel 5).
Figur 1: Opløsning af naringenin i ethanol. (A) Naringeninpulver i røret efter spin ned. (B) Naringenin + ethanol (400 mg/ml - 3,52 mg naringenin i 8,8 μL ethanol). (C) Naringenin + ethanol (40 mg/ml - 3,52 mg naringenin i 8,8 μL ethanol) (D) Naringenin i 5% (v/v) ethanol og 95% PS (0,9%). (E) Udfældes i D efter spin down. (F) Måling til opnåelse af skalabjælke for figur 1, figur 2 og figur 3. Nar: Naringenin. Skalastang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opløsning af naringenin i DMSO. (A) Naringenin + DMSO (400 mg/ml - 3,95 mg naringenin i 9,8 μL DMSO). (B) Naringenin + DMSO (40 mg / ml- 3,95 mg naringenin i 98 μL DMSO). C) Naringenin i 5% (v/v) DMSO og 95% PS (0,9%). (D) Udfældes i C efter spin down. Nar: Naringenin. Skalastang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Opløsning af naringenin i DMSO og Tween 80. (A) Naringenin + DMSO (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenin i 117,7 μL DMSO). (B) Naringenin + DMSO + Tween (57,2 mg/ml - 6,69 mg naringenin i 117,7 μL DMSO og 117,7 μL Tween 80). (C) Naringenin i blandingen af 3,5% (v/v) DMSO, 3,5% (v/v) Tween 80 og 93% PS (0,9%). (D) Ingen bundfald i C efter spin down. Nar: Naringenin. Skalastang = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Effekten af naringenin på osteoklastaktiviteten hos de fedtfattige kostfodrede og STZ-injicerede (STZ) mus. TRAP farvning af trabekulær knogle og osteoklaster af L4 hvirvler. Trekanter angav osteoklaster. Skala bar = 100 μm. Dette tal er blevet ændret fra Liu et al.25. Klik her for at se en større version af denne figur.
| g) | 0 uge | 1 uge | 2 uger | 4 uger | 5 uger | 6 uger | 8 uger |
| Kontrol | 23,7 ± 0,2 | 25,1 ± 1,3 | 26.2 ± 1.0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32,7 ± 1,3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18,2 ± 2,5** | 18,6 ± 2,5** | 18,2 ± 1,4** | 21,3 ± 1,6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringenin | 16,6 ± 1,1** | 17,6 ± 1,5** | 17,4 ± 1,7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 vs. kontrol | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 mod STZ | |||||||
Tabel 1: Kropsvægt af fedtfattige kostfodrede og STZ-injicerede (STZ) mus på tværs af grupper og perioder. Data vises som middelværdien ± s.d. ** p < 0,01 vs. Kontrol, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol/L) | 0 måned | 1 måned | 2 måneder |
| Kontrol | 4,9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12,8 ± 4,2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringenin | 13,2 ± 3,5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 vs. kontrol | |||
| ΔΔ p < 0,01 mod STZ | |||
Tabel 2: Fastende blodsukker hos STZ-mus på tværs af grupper og perioder. Data vises som gennemsnittet ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 vs . kontrol, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| BV/TV (%) | Tb.N (1/mm) | |
| Kontrol | 0,268 ± 0,046 | 5.35 ± 0,31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringenin | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. kontrol | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabel 3: Knoglemasserelaterede parametre for STZ-mus på tværs af grupper. Data vises som middelværdien ± s.d. * p < 0,05 vs. kontrol, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Kontrol | 0,000182 ± 8,84E-05 |
| STZ | 0,00024 ± 2,06E-05 |
| Naringenin | 0,000156 ± 3,88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 mod STZ | |
Tabel 4: Osteoklastaktivitet hos STZ-mus på tværs af grupper. Data vises som gennemsnittet ± s.d. ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| ng/ml | CTIX | Pinp |
| Kontrol | 22 ± 8,98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36,98 ± 22,57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringenin | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 vs. kontrol | ||
| ΔΔ p < 0,01 mod STZ | ||
Tabel 5: Knogleresorptionshastighed for STZ-mus på tværs af grupper. Data vises som gennemsnittet ± s.d. * p < 0,05 vs. kontrol, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremstillingen af fytokemisk opløsning er grundlaget for dens anvendelse in vivo. I denne protokol blev fremstillingen af naringeninopløsning demonstreret ved anvendelse af forskellige opløsningsmidler, såsom ethanol, DMSO, Tween 80 og 0,9% PS. Opløsningen i fuldstændig opløst tilstand skal overvåges yderligere ved at lade den forblive ved stuetemperatur i nogle længere timer og derefter filtreres, før den bruges in vivo.
Bestemmelse af opløsningsmiddel er et kritisk trin i denne protokol. Der er mange opløsningsmiddelmuligheder til opløsning af forbindelser, hvoraf ethanol, DMSO og PS er de mest anvendte. Ethanol kan opløse mange vanduopløselige forbindelser på grund af dets meget polære egenskaber, hvilket tillader hydrogenbinding og dermed opløser både polære og ikke-polære stoffer. Desuden kan koncentrationen af ethanol bestemme egenskaberne af den fytokemiske forbindelse. For eksempel betragtes 75 vægt% ethanol / vandopløsningsmiddel som det bedste til ekstraktion af det højeste udbytte af polyfenoler og har de stærkeste antioxidantegenskaber26. En anden undersøgelse viste, at ethanolkoncentrationen kunne sænkes til 32,5% ved 150 ° C for polyphenolekstrakter til at udtrykke antioxidantegenskab27. En høj koncentration af ethanol kan imidlertid forårsage neurotoksicitet og hepatotoksicitet28. Ethanolinjektion (i.p.) i en række koncentrationer fra 8% -32% v / v er almindeligt anvendt til adfærdsmæssig evaluering og kan forårsage betinget smagsaversion og hypotermi29. DMSO er et dipolært aprotisk opløsningsmiddel med høj polaritet og anvendes som opløsningsmiddel til at opløse adskillige organiske forbindelser. En sammenlignende undersøgelse viste, at DMSO/methanol (50:50 v/v) resulterede i det optimale udbytte af phenolsyrer i citrusskaller30. Dosis, koncentration og hyppighed er dog ikke uvidende faktorer, når DMSO leveres til dyr. En dosis på 17,7 g/kg givet intraperitonealt hos mus opnåede LD50, mens dosis blev sænket til 2,5 g/kg i 6 uger hos mus, forårsagede ikke observerbare bivirkninger31. Selvom den foreslåede DMSO-koncentration er 0,5% -5%, er DMSO ikke i stand til at opløse mange forbindelser. Colucci et al. testede virkningerne af DMSO og DMSO-indeholdende saltvand i forskellige koncentrationer ved intracerebroventrikulær og oral administration hos mus. Undersøgelsen viste, at en opløsning på 25% DMSO i saltvand ikke ændrede dyrs adfærdsmæssige reaktioner32. Tween 80 er et nonionisk overfladeaktivt stof og anvendes i vid udstrækning som co-opløsningsmiddel for at øge opløseligheden af dårligt opløselige lægemidler og forbedre farmakokinetiske egenskaber33. En koncentration på 1% Tween 80 blev valgt under hensyntagen til sikkerhed33. Således blev ovennævnte opløsningsmidler og overfladeaktive stoffer i forskellige koncentrationer anvendt til fuldt opløselighed af naringenin til intraperitoneal administration.
Nogle forslag er angivet her til overvejelse. For det første foreslår vi at starte fra en lille mængde fytokemisk forbindelse til indledende eksperimenter i betragtning af forbrugsomkostninger. For det andet er det nødvendigt at udføre omfattende litteraturforskning, især tætte undersøgelser vedrørende dyrearter, sygdomme, administrationsveje og hyppighed, inden løsningen forberedes. For det tredje afhænger koncentrationsintervallerne for opløsningsmidler og co-opløsningsmidler såsom overfladeaktive stoffer af den tilgængelige litteratur, indledende eksperimenter og formålet med undersøgelsesdesignet. For det fjerde anbefales det at bruge en insulinsprøjte i stedet for en almindelig sprøjte for at reducere injektionskaden fra en relativt høj administrationsfrekvens. For det femte anbefales det at sterilisere opløsningen ved hjælp af et 0,2 μm filter for at opretholde sterile forhold og anvende sterile sprøjter og vatpinde gennemblødt i alkohol ved injektion af opløsningen i levende dyr.
Fordelene ved protokollen er dens enkle betjening og lave omkostninger. Sammenfattende viser protokollen fremstillingen af en fytokemisk opløsning til intraperitoneal administration hos mus med naringenin som et eksempel. Protokollen vil gavne de forskere, der beskæftiger sig med lægemiddelscreening eller farmakologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81973607 og 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. , Pharmaceutical Press. London, Chicago. (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), Basel, Switzerland. (2019).
- van Thriel, C.
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
