Summary
Здесь в протоколе представлен препарат раствора нарингенина для внутрибрюшинного введения in vivo . Нарингенин полностью растворен в смеси диметилсульфоксида, Tween 80 и физиологического раствора. Антидиабетические остеопоротические эффекты нарингенина оценивали с помощью тестирования глюкозы в крови, окрашивания тартраторезистентной кислотной фосфатазы и иммуноферментного анализа.
Abstract
Приготовление соединения (фитохимического) раствора является упущенным, но критическим этапом до его применения в таких исследованиях, как скрининг лекарств. Полная солюбилизация соединения необходима для его безопасного использования и относительно стабильных результатов. Здесь в качестве примера показан протокол приготовления раствора нарингенина и его внутрибрюшинного введения в диете с высоким содержанием жиров и диабетическая модель, индуцированная стрептозотоцином (СТЗ). Небольшое количество нарингенина (3,52-6,69 мг) использовалось для проверки его солюбилизации в растворителях, включая этанол, диметилсульфоксид (ДМСО) и ДМСО плюс Tween 80, восстановленный в физиологическом растворе (PS), соответственно. Полную солюбилизацию соединения определяют наблюдением за цветом раствора, наличием осадков после центрифугирования (2000 х г в течение 30 с) или разрешением раствору стоять в течение 2 ч при комнатной температуре (РТ). После получения стабильного соединения/фитохимического раствора конечную концентрацию/количество соединения, необходимое для исследований in vivo , можно приготовить в растворе только для растворителя (без PS), а затем разбавить/смешать с PS по желанию. Антидиабетические остеопоротические эффекты нарингенина у мышей (внутрибрюшинное введение при 20 мг/кг веса тела, 2 мг/мл) оценивали путем измерения уровня глюкозы в крови, костной массы (микро-КТ) и скорости резорбции кости (окрашивание TRAP и ИФА). Исследователи, ищущие подробные органические / фитохимические препараты растворов, выиграют от этого метода.
Introduction
В связи с расширением исследований, касающихся использования фитохимических соединений для скрининга лекарственных средств, следует обратить внимание на подходы к приготовлению фитохимических растворов для оценки их оптимального воздействия. Многие аспекты, такие как методология растворения, дозировка и концентрация, должны учитываться при приготовлении соединения1.
Растворение на основе растворителя широко используется для получения органических соединений1. Обычно используемые растворители включают воду, масло, диметилсульфоксид (DMSO), метанол, этанол, муравьиную кислоту, Tween, глицерин и т.д.2. Хотя суспензия с нерастворенными веществами приемлема, когда соединение вводится желудочным раствором, полностью растворенное растворенное вещество имеет решающее значение для внутривенного введения. Поскольку масляный раствор, суспензия и эмульсия могут вызывать капиллярные эмболии, предлагается водный раствор для приготовления соединения, особенно при введении внутривенных, внутримышечных и внутрибрюшинных инъекций3.
Эффективный диапазон доз варьируется между соединениями и даже между заболеваниями, обработанными одним и тем же соединением. Определение эффективной и безопасной дозы и концентрации зависит от литературы и предварительных экспериментов4. Здесь в качестве примера демонстрируется препарат соединения нарингенин.
Нарингенин (4,5,7-тригидрокси-флаванон), полифенольное соединение, был изучен при лечении заболевания по его гепатопротекторной5, антидиабетической6, противовоспалительной7 и антиоксидантной активности8. Для применения in vivo обычно используется пероральное введение нарингенина. В предыдущих исследованиях сообщалось о приготовлении раствора нарингенина в 0,5%-1% карбоксиметилцеллюлозы, 0,5% дозы метилцеллюлозы, 0,01% ДМСО и физиологического физиологического раствора (PS) в 50-100 мг/кг, вводимого пероральным приемом 9,10,11,12. Кроме того, в других исследованиях сообщалось о добавлении нарингенина чау в 3% (масс./мас.) для перорального приема в дозе 3,6 г/кг/сут13,14. Исследования также сообщали об использовании этанола (0,5% v/v), PS и DMSO для растворения нарингенина для внутрибрюшинной инъекции при 10-50 мг/кг 15,16,17,18. В исследовании эпилепсии височной доли мыши получали инъекцию нарингенина, суспендированного в 0,25% карбоксиметилцеллюлозы, растворенной в PS19. Хотя в этих исследованиях сообщается об использовании различных растворителей для приготовления растворов нарингенина, дальнейшие подробности, такие как статус растворения и реакция животных, не были сообщены.
Этот протокол вводит процедуру приготовления раствора нарингенина для применения in vivo при диабетическом остеопорозе. Приготовление раствора для инъекций включает приготовление растворителей и соединений, оценку дозировки, процесс растворения и фильтрацию. Дозировка была определена на основе литературных исследований и предварительных экспериментов путем мониторинга мышей после введения инъекций каждый день в течение 3 дней и изменения дозировки в соответствии с поведением мыши. Окончательную выбранную концентрацию (20 мг/кг веса тела) вводили внутрибрюшинно 5 дней в неделю в течение 8 недель в диете с высоким содержанием жиров и индуцированным стрептозотоцином (STZ)-индуцированными диабетическими мышами20,21. Эффекты нарингенина при диабетическом остеопорозе оценивались с помощью тестирования глюкозы в крови, микро-КТ, окрашивания тартраторезистентной кислотной фосфатазы (TRAP) и иммуноферментного анализа (ИФА).
В целом было отмечено, что нарингенин в диапазоне концентраций 40-400 мг/мл полностью не растворялся ни в этаноле, ни в ДМСО, ни в 5% (этанол или ДМСО) плюс 95% PS (v/v). Однако нарингенин полностью растворяют в смеси 3,52% ДМСО, 3,52% Tween 80 и 92,96% PS. Подробная процедура поможет исследователям приготовить соединение в виде инъекционного раствора для применения in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанные исследования соответствовали Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальным исследовательским советом и были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Шанхайского университета традиционной китайской медицины. При проведении экспериментов в целях безопасности требуются лабораторные халаты, одноразовые нитриловые перчатки и очки.
1. Получение растворителей и оценка нарингенина, необходимого для применения in vivo
- Готовят следующие растворители: Tween-80 (конечный диапазон концентраций: 0,5%-1%), DMSO, глицерин (конечный диапазон концентраций: 15%-20%), этанол (конечный диапазон концентраций: 12% для внутримышечной инъекции)22 и 0,9% PS.
- Оцените необходимое количество нарингенина на основе дозы, количества мышей и частоты инъекций.
- Закажите 10 мышам (C57BL/6, самец, 5 недель, SPF) вводить нарингенин 5 дней в неделю в течение 8 недель. Держите мышей в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF).
ПРИМЕЧАНИЕ: Доза, необходимая для внутрибрюшинной инъекции, составляет 20 мг/кг b.w.23. - Взвесьте 160 мг нарингенина на основе следующего расчета: 20 мг/ кг х 0,02 кг / мышь х 10 мышей х 5 дней в неделю х 8 недель = 160 мг.
- Закажите 10 мышам (C57BL/6, самец, 5 недель, SPF) вводить нарингенин 5 дней в неделю в течение 8 недель. Держите мышей в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF).
- Рассчитайте концентрацию нарингенина, вводимого in vivo.
- Подготовьте рекомендуемый объем, исходя из массы тела мышей. Рекомендуемый объем нарингенина, применяемого к каждой мыши, составляет 1% от массы тела (0,3 мл). В этом эксперименте использовалось 0,2 мл на мышь.
- Рассчитайте общий объем: 0,2 мл на мышь x 10 мышей x 5 дней в неделю x 8 недель = 80 мл.
- Рассчитайте концентрацию нарингенина в наличии: 160 мг/80 мл растворителей = 2 мг/мл.
- Рассчитайте объем за каждый день: 0,2 мл на мышь x 10 мышей = 2 мл.
2. Роспуск
- Раствор этанола
- Чтобы приготовить раствор нарингенина в дозе 2 мг/мл, взвесьте 3,52 мг нарингенина и добавьте его в пробирку объемом 2,0 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения концентрации 2 мг/мл общий требуемый объем составит 1760 мкл (расчет: 3,52 мг/1760 мкл = 2 мг/мл). - Быстро вращайтесь вниз (2000 х г в течение 30 с), чтобы порошок нарингенина оседал на дне трубки (рисунок 1А).
- Добавьте в пробирку 8,8 мкл 100% этанола для приготовления 0,5% (v/v) раствора по отношению к общему требуемому объему2. Нарингенин не растворяется полностью (рисунок 1B).
- Продолжают добавлять 79,2 мкл 100% этанола в пробирку для приготовления 5% (v/v) раствора по отношению к общему требуемому объему (расчет: (79,2 мкл + 8,8 мкл) / 1760 мкл x 100% = 5%). Нарингенин не растворяется полностью (рисунок 1B).
- Добавьте 1672 мкл 0,9% PS в пробирку, содержащую 5% этанола, как описано на этапе 2.1.4. Это приведет к образованию эмульсии (рисунок 1D). Центрифуга (2000 х г в течение 30 с) раствор для проверки того, полностью ли растворен нарингенин в растворе. Белые осадки нерастворенного нарингенина появляются в растворе (рисунок 1Е).
- Чтобы приготовить раствор нарингенина в дозе 2 мг/мл, взвесьте 3,52 мг нарингенина и добавьте его в пробирку объемом 2,0 мл.
- Решение DMSO
- Для приготовления раствора нарингенина в дозе 2 мг/мл взвесьте 3,95 мг нарингенина и добавьте в пробирку объемом 2,0 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения концентрации 2 мг/мл общий требуемый объем составит 1975 мкл (расчет: 3,95 мг/1975 мкл = 2 мг/мл). - Быстро вращайтесь вниз (2000 х г в течение 30 с), чтобы порошок нарингенина оседал на дне трубки.
- Добавьте 9,8 мкл ДМСО в пробирку для получения 0,5% (v/v) раствора (расчет: 9,8 мкл/1975 мкл x 100% = 5%). Нарингенин полностью растворяется (рисунок 2А).
- Добавьте 88,2 мкл ДМСО в пробирку для получения 5% (v/v) раствора по отношению к общему требуемому объему (расчет: (88,2 мкл + 9,8 мкл) /1975 мкл x 100% = 5%). Нарингенин растворяется полностью (рисунок 2B).
- Добавьте 1877 мкл 0,9% PS (v/v% 95%) к раствору, приготовленному на стадии 2.2.4. Получают эмульсию (рисунок 1С). Центрифуга (2000 х г в течение 30 с) раствор для проверки того, полностью ли растворен нарингенин в растворе. Белые осадки нерастворенного нарингенина появляются в растворе (рисунок 1D).
- Для приготовления раствора нарингенина в дозе 2 мг/мл взвесьте 3,95 мг нарингенина и добавьте в пробирку объемом 2,0 мл.
- Решение Tween-80 и DMSO
- Чтобы приготовить раствор нарингенина в дозе 2 мг/мл, взвесьте 6,69 мг нарингенина и добавьте в пробирку объемом 5,0 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения конечной концентрации 2 мг/мл общий требуемый объем раствора составит 3345 мкл (расчет: 6,69 мг/3345 мкл = 2 мг/мл). - Быстро вращайтесь вниз (2000 х г в течение 30 с), чтобы порошок нарингенина оседал на дне трубки.
- Добавить 117,7 мкл ДМСО для получения 3,5% (v/v) раствора по отношению к общему требуемому объему (расчет: 117,7 мкл /3345 мкл x 100% = 3,5%). Нарингенин полностью растворяется (рисунок 3А)
- Добавьте 117,7 мкл Tween 80 к раствору, приготовленному на стадии 2.3.3, чтобы получить 3,5% (v/v) Tween 80 и 3,5% (v/v) DMSO. Наблюдать полное растворение нарингенина (рисунок 3B)
- Медленно добавляют раствор, приготовленный на стадии 2.3.4, в пробирку объемом 5,0 мл, содержащую 3109,6 мкл 0,9% PS (v/v% от 93%), и хорошо встряхивают для получения очевидного раствора нарингенина (фиг.3C).
- Дайте раствору, приготовленному на стадии 2.3.5, остаться при комнатной температуре (RT) в течение 2 ч. Решение все еще очевидно без каких-либо видимых осадков (рисунок 3D).
- Чтобы приготовить раствор нарингенина в дозе 2 мг/мл, взвесьте 6,69 мг нарингенина и добавьте в пробирку объемом 5,0 мл.
- Приготовление раствора нарингенина для приема in vivo
- Согласно шагу 1.2.2 вегетируют 160 мг нарингенина (160 мг/2 мг/мл = 80 мл).
- Добавьте 2,8 мл DMSO для достижения 3,5% (v/v) раствора (расчет: 2,8 мл / 80 мл x 100% = 3,5%)
- Затем добавляют 2,8 мл Tween 80 к раствору, приготовленному на стадии 2.4.2, чтобы получить 3,5% (v/v) Tween 80 и 3,5% (v/v) DMSO.
- Аликвот раствор готовят на стадии 2.4.3 в четыре пробирки по 1,4 мл на пробирку [(2,8 мл + 2,8 мл)/4 = 1,4 мл].
- Aliquot 18,6 мл 0,9% PS до пяти 15 мл трубок.
- Хранить раствор, приготовленный на стадии 2.4.3 (стандартный раствор) и 2,4,5 при 4 °C (2,8 мл + 2,8 мл + 18,6 мл x 4 = 80 мл).
- Взять 140 мкл исходного раствора (стадия 2.4.3) и смешать его с 1860 мкл 0,9% PS для приготовления 2 мл раствора нарингенина в течение 1 дня введения.
- Отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 мкм.
3. Администрирование раствора Нарингенина
- Управляемость и сдерживание
- Опрыскивайте клетку и руки 70-75% спиртом перед открытием крышки. Поднимите мышь за основание хвоста и поместите ее на твердую поверхность, чтобы аккуратно расположить хвост назад.
- Обхватите шею за уши большим и указательным пальцами левой руки и расположите хвост между маленьким и безымянным пальцами. Держите мышь в положении лежа на спине со слегка приподнятым задним концом.
- Инъекция
- Захватите заднюю кожу мыши так, чтобы кожа живота была подтянутой.
- Протолкните иглу (инсулиновый шприц) под углом 10° между иглой и брюшной поверхностью, в правом нижнем или левом квадранте живота, чтобы избежать попадания в мочевой пузырь, печень или другие внутренние органы.
- Проведите иглу подкожно в черепном направлении на 3-5 мм, а затем вставьте ее под углом 45° в брюшную полость.
- Когда игла проходит через брюшную стенку и сопротивление исчезает, выполните аспирацию, чтобы подтвердить, что рефлюксный материал не изъят. Затем медленно протолкните решение.
- После инъекции медленно вытащите иглу и слегка поверните ее, чтобы предотвратить утечку. Рекомендуемый объем 50-100 мкл/10 г.
- Утилизируйте остатки нарингенина в контейнер с биологической опасностью.
4. Анализ глюкозы в крови
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте уровень глюкозы в крови за 1 день до инъекции и через 1 и 2 месяца после инъекции.
- Голодайте мышей за 15 ч до анализа крови на глюкозу. Вода может по-прежнему предоставляться.
- Откройте тест-полоски и отметьте дату. После вскрытия используйте тест-полоски в течение 3 месяцев. Храните тест-полоски при температуре 2-30 °C. Плотно закройте крышку после снятия полоски, чтобы предотвратить образование влаги.
- Поместите животное в индукционную камеру. Включите испаритель на уровне индукции 4% для изофлурана и 4 л/мин для кислорода. После того, как животное будет полностью обезболено, поддерживайте анестетик с носовым конусом и доставку анестетика на уровне 1,5% для изофлунана и 0,4 л/мин для кислорода.
- Протрите хвост ватными шариками/тампонами, пропитанными 70%-75% спиртом.
- Начиная с самой нижней точки хвоста, сделайте небольшой прокол на боковой вене хвоста с помощью укола иглой 25G и выдавите каплю крови.
- Протрите каплю крови папиросной бумагой.
- Выдавите еще одну каплю крови и соберите ее на краю тест-полоски.
- Считывание и запись результата, отображаемого на глюкометре.
- Чтобы остановить кровотечение, зажмите хвост мыши стерильной марлей и протрите область 75% спиртом.
- Дополнительные образцы могут быть получены аналогичной техникой, двигаясь вверх по хвосту краниально.
5. Окрашивание TRAP
- Подготовка слайдов
- Выполняйте анализы глюкозы в крови натощак на мышах один раз в неделю. Когда уровень глюкозы в крови составляет ≥ 11,1 ммоль / л (что свидетельствует об успешном развитии диабета II типа у мышей модели24), усыпляют мышей с использованием CO2 с последующим дисклокацией шейки матки и собирают поясничный 4-6-й (L4-L6) (эвтаназия не проводится во время теста на глюкозу в крови натощак).
- Зафиксируйте образцы L4-L6 4% параформальдегидом в течение 24 ч (убедитесь, что объем параформальдегида >20x объема ткани), а затем промывайте в течение 2 ч непрерывным потоком водопроводной воды.
- Чтобы декальцинировать образцы, погрузите их в 10% раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 2 недель на РТ в статическом состоянии до тех пор, пока образцы не будут размягчены. Убедитесь, что объем декальцифицирующего раствора в 20-30 раз превышает объем ткани/образца. Меняйте раствор ЭДТА через день.
- Обезвоживание образца с помощью дегидратора.
- Поместите образцы во встраиваемые кассеты для обработки тканей. Пронумеруйте кассету карандашом.
- Установите программу дегидратора следующим образом: 75% спирт в течение 2 ч, 85% спирт в течение 1 ч, 95% спирт в течение 1 ч, 95% спирт в течение 2 ч, безводный этанол (I) в течение 2 ч, безводный этанол (II) в течение 2 ч, безводный этанол (III) в течение 2 ч, ксилол (I) в течение 1 ч, ксилол (II) в течение 1 ч, ксилол (III) в течение 1 ч, парафиновый воск (I) в течение 2 ч, и парафиновый воск (II) в течение 2 ч, на РТ.
- Вставить образцы в парафиновый воск.
- Добавьте парафиновый воск в кассетный лоток станции встраивания парафина и нагрейте до 60 °C. Погружайте обезвоженные образцы не менее чем на 2 ч.
- Поместите тканевую кассету в лоток для кассет и разогрейте.
- Добавьте парафиновый воск в резервуар парафина и нагрейте до 60 °C.
- Через 2 ч отнесите в рабочую зону как тканевую кассету, так и образцы. Вылейте предварительно нагретый парафиновый воск из парафинового резервуара в тканевую кассету. Поместите образец в парафиновый воск, убедитесь, что парафиновый воск полностью покрывает ткань, а затем немедленно переместите кассету на противообледенительную станцию.
- Используйте микротом, чтобы разрезать образцы, встроенные в парафин, на участки размером 5-6 мкм. Разверните секции в теплой воде при температуре 40 °C менее 10 с. Соберите разделы на стеклянных слайдах с покрытием APS (аминосилан). Высушите горки на RT в течение 1 ч, а затем переместите их в духовку, установленную при 60 °C на ночь.
- Подготовка реагента TRAP
- Приготовьте основной раствор для инкубации: Растворите 9,2 г безводного ацетата натрия, 11,4 г зубной кислоты L-(+) и 2,8 мл ледниковой кислоты в 1000 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 4,7-5,0 и храните при RT до 6 месяцев.
- Приготовить раствор нафтол-эфира: Растворить 0,1 г нафтола AS-BI фосфата в 5 мл моноэтилового эфира этиленгликоля. Хранить при температуре 4 °C до 5 недель.
- Приготовить раствор нитрита натрия: Растворить 1 г нитрита натрия в 25 мл дистиллированной воды. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовить краситель параросанилин: Добавить 1 г парарозанилиновой основы к 20 мл 2N HCl (83 мл HCl в 417 мл воды). Используйте перемешиваемую пластину, чтобы растворить основание и отфильтровать его перед использованием.
- Окрашивание TRAP
- Наполните две банки Coplin 50 мл основного инкубационного раствора и поместите в духовку с температурой 37 °C на 2 ч.
- Возьмите одну банку Коплина и добавьте 0,5 мл раствора наптол-эфира.
- Поместите горки в банку Coplin и высиживайте при температуре 37 °C в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте не менее трех слайдов для каждой группы. - За несколько минут до окончания инкубации добавить 1 мл раствора нитрита натрия и 1 мл парарозанилинового красителя. Осторожно перемешать в течение 30 с и оставить на 2 мин.
- Добавьте раствор, приготовленный на этапе 5.2.2, в другую предварительно нагретую банку Коплина, содержащую основной запасной раствор. Хорошо перемешайте раствор и вставьте слайды из банки Coplin на шаге 5.3.3.
- Инкубировать в течение 15-20 мин на РТ.
- Смойте ломтики в другой банке Coplin с 200 мл PBS в течение 5 минут.
- Окрасьте ломтики 100% гематоксилином на 30 с в банку Коплина.
- Обезвоживать ломтики 85%, 95% и 100% спиртом (200 мл) в течение 2 мин каждый и обрабатывать ксилолом (200 мл) в течение 2 мин в течение 3x. Используйте банки Coplin для выполнения каждого шага.
- Закрепите секцию на покровном стекле с помощью крышки с помощью смолы. Следите за тем, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха.
6. ИФА
- Пробоподготовка
- Удалите мягкие ткани из бедренной кости и большеберцовой кости мыши. Очистите кости марлей.
- Поместите образцы кости в пробирку микроцентрифуги объемом 1 мл и храните пробирки при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы также могут храниться в резервуаре для жидкого азота не более 6 месяцев. - Взвесьте образец кости. Разбавить 0,9% ПС в соотношении 1:10. Например, развести 0,1 г кости 1 мл ПС.
- Добавьте в трубку шарики циркония толщиной 3 мм и измельчите образцы 3 раза при 70 Гц в течение 30 с с отдыхом 20 с между ними.
- Центрифугирование образцов при 4 °C и 12 000 x g в течение 5 мин. Соберите супернатант.
- Набор для анализа ИФА
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните ИФА в соответствии с протоколом анализа, указанным производителем.- Добавить 100 мкл каждого разбавления стандартной, заготовки и пробы в соответствующие скважины. Инкубировать в течение 90 мин при 37 °C.
- Декантируйте жидкость из каждой лунки и добавляйте 100 мкл рабочего раствора антитела к биотинилированному детектированию. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C.
- Декантируйте раствор, добавляйте в каждую лунку по 350 мкл промывочного буфера. Замочите на 1 мин, повторите 3 раза.
- Добавьте 100 мкл сопряженного рабочего раствора HRP в каждую лунку. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C.
- Декантируйте раствор. Повторите процесс стирки 5x, как описано в шаге 6.2.3.
- Добавьте 90 мкл субстратного реагента. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C в защищенном от света месте.
- Добавьте 50 мкл стоп-раствора.
- Используйте пластинчатый считыватель для записи поглощения каждой скважины при 450 нм.
- Генерация стандартных кривых
- Постройте график соответствующих средних значений абсорбции по отношению к последовательно разбавленным концентрациям белка.
- Соедините точки, чтобы создать кривую наилучшего соответствия. Используйте любое соответствующее компьютерное приложение (электронную таблицу) для создания стандартного уравнения кривой.
- Замените значение поглощения каждого образца в стандартном уравнении кривой для получения концентрации соответствующего образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Было обнаружено, что масса тела мышей с высоким содержанием жиров и диабетом, и вызванных STZ, снижается по сравнению с массой тела контрольных групп через 0-8 недель после лечения STZ. Потеря веса мышей, получавших нарингенин, была значительной по сравнению с необработанными мышами (группа STZ) на 4-й неделе. Контрольная и STZ-группы вводились с одинаковым объемом PS (таблица 1). Уровень глюкозы в крови у мышей с диабетом резко повысился в течение 1 месяца после индукции СТЗ. Затем он автоматически снизился до уровня, наблюдавшегося 2 месяца назад, когда была установлена животная модель. Лечение нарингенином снижало уровень глюкозы в крови на 51,8% и 34,8% через 1 и 2 месяца соответственно (таблица 2). У мышей с диабетом, индуцированной STZ, наблюдалась потеря костной массы, о чем свидетельствует уменьшение объема кости / объема ткани (BV / TV) (30,97%) и количества трабекул (Tb.N) (11,4%) соответственно. Изменения значений этих двух параметров свидетельствуют о том, что лечение нарингенином значительно спасло потерю костной массы (таблица 3). Активность остеокластов, как указано N.oc/Tb.Ar (число остеокластов на область трабекулярной кости), была увеличена у мышей с сахарным диабетом с высоким содержанием жиров и STZ-индуцированной, хотя статистической значимости между контрольной и болезнью не наблюдалось. Лечение нарингенином значительно снижало активность остеокластов, как показано на рисунке 4 и в таблице 4. С-концевой телопептид коллагена I типа (CTIX) и N-концевой пропептид проколлагена I типа (PINP) были повышены на 68,09% и 204,88% у диабетических животных соответственно, что указывает на резкое увеличение скорости резорбции кости. Нарингенин достоверно снижал оба показателя скорости резорбции кости (таблица 5).
Рисунок 1: Растворение нарингенина в этаноле. (А) Порошок нарингенина в пробирке после отжима. (B) Нарингенин + этанол (400 мг/мл - 3,52 мг нарингенина в 8,8 мкл этанола). (C) Нарингенин + этанол (40 мг/мл - 3,52 мг нарингенина в 8,8 мкл этанола) (D) Нарингенин в 5% (v/v) этаноле и 95% PS (0,9%). (E) Выпадает в осадок в D после отката. (F) Измерение для получения шкалы для рисунка 1, рисунка 2 и рисунка 3. Нар: Нарингенин. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Растворение нарингенина в ДМСО. (А) Нарингенин + ДМСО (400 мг/мл - 3,95 мг нарингенина в 9,8 мкл ДМСО). (B) Нарингенин + ДМСО (40 мг/мл- 3,95 мг нарингенина в 98 мкл ДМСО). (C) Нарингенин в 5% (v/v) DMSO и 95% PS (0,9%). (D) Выпадает в осадок в C после раскрутки. Нар: Нарингенин. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Растворение нарингенина в DMSO и Tween 80. (A) Нарингенин + ДМСО (57,2 мг/мл - 6,69 мг нарингенина в 117,7 мкл ДМСО). (B) Нарингенин + DMSO + Tween (57,2 мг/мл - 6,69 мг нарингенина в 117,7 мкл ДМСО и 117,7 мкл Tween 80). (C) Нарингенин в смеси 3,5% (v/v) DMSO, 3,5% (v/v) Tween 80 и 93% PS (0,9%). (D) Отсутствие осадков в C после вращения вниз. Нар: Нарингенин. Шкала = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Влияние нарингенина на активность остеокластов мышей с высоким содержанием жиров, вскармливаемых диетой и STZ-инъекциями (STZ). ОКРАШИВАНИЕ TRAP трабекулярной кости и остеокластов позвонков L4. Треугольники обозначали остеокласты. Шкала шкалы = 100 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Liu et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| (г) | 0 неделя | 1 неделя | 2 недели | 4 недели | 5 недель | 6 недель | 8 недель |
| Контроль | 23.7 ± 0.2 | 25.1 ± 1.3 | 26.2 ± 1.0 | 27.7 ± 0.5 | 31.1 ± 0.7 | 31.7 ± 0.8 | 32,7 ± 1,3 |
| СТЗ | 16.8 ± 1.7** | 18.2 ± 2.5** | 18,6 ± 2,5** | 18.2 ± 1.4** | 21.3 ± 1.6** | 22.0 ± 1.4** | 20.8 ± 1.4** |
| Нарингенин | 16.6 ± 1.1** | 17.6 ± 1.5** | 17.4 ± 1.7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 против контроля | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 против STZ | |||||||
Таблица 1: Масса тела мышей с высоким содержанием жиров, вскармливаемых диетой и вводимых STZ (STZ), по группам и периодам. Данные показаны как среднее ± s.d. ** p < 0,01 против Control, ΔΔ p < 0,01 против. СТЗ.
| (ммоль/л) | 0 месяц | 1 месяц | 2 месяца |
| Контроль | 4.9 ± 0.9 | 8.4 ± 0.7 | 8.3 ± 0.5 |
| СТЗ | 12.8 ± 4.2** | 22.8 ± 4.3** | 15.5 ± 2.7* |
| Нарингенин | 13.2 ± 3.5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 против контроля | |||
| ΔΔ p < 0,01 против STZ | |||
Таблица 2: Уровень глюкозы в крови натощак мышей STZ по группам и периодам. Данные показаны как среднее ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 против Control, ΔΔ p < 0,01 против STZ.
| БВ/ТВ (%) | Тб.Н (1/мм) | |
| Контроль | 0,268 ± 0,046 | 5.35 ± 0.31 |
| СТЗ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Нарингенин | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 против контроля | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 против STZ | ||
Таблица 3: Параметры, связанные с костной массой мышей STZ в разных группах. Данные показаны как среднее ± s.d. * p < 0,05 против Control, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 против STZ.
| 1/мкм2 | Н.ок/Т.Ар |
| Контроль | 0.000182 ± 8.84E-05 |
| СТЗ | 0.00024 ± 2.06E-05 |
| Нарингенин | 0.000156 ± 3.88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 против STZ | |
Таблица 4: Остеокластная активность мышей STZ в разных группах. Данные показаны как среднее ± s.d. ΔΔ p < 0,01 против STZ.
| нг/мл | КТИКС | ПИНП |
| Контроль | 22 ± 8.98 | 1.64 ± 0.95 |
| СТЗ | 36.98 ± 22.57 | 5 ± 2.33 * |
| Нарингенин | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 против контроля | ||
| ΔΔ p < 0,01 против STZ | ||
Таблица 5: Скорость резорбции костной ткани мышей STZ в разных группах. Данные показаны как среднее ± s.d. * p < 0,05 против Control, ΔΔ p < 0,01 против STZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Приготовление фитохимического раствора является основой для его применения in vivo. В этом протоколе получение раствора нарингенина было продемонстрировано с использованием различных растворителей, таких как этанол, DMSO, Tween 80 и 0,9% PS. Раствор в полностью растворенном состоянии необходимо дополнительно контролировать, позволяя ему оставаться при комнатной температуре в течение нескольких длительных часов, а затем фильтровать перед использованием in vivo.
Определение растворителя является критическим шагом в этом протоколе. Существует много вариантов растворителей для растворения соединений, из которых этанол, ДМСО и ПС являются наиболее широко используемыми. Этанол может растворять многие нерастворимые в воде соединения из-за его высокополярных свойств, что позволяет связывать водород и, таким образом, растворять как полярные, так и неполярные вещества. Более того, концентрация этанола может определять свойства фитохимического соединения. Например, 75 мас.% растворителя этанола/воды считается лучшим для извлечения наибольшего выхода полифенолов и обладает сильнейшими антиоксидантными свойствами26. Другое исследование показало, что концентрация этанола может быть снижена до 32,5% при 150 °C для полифенольных экстрактов для экспрессии антиоксидантного свойства27. Однако высокая концентрация этанола может вызывать нейротоксичность и гепатотоксичность28. Инъекция этанола (т..) в диапазоне концентраций от 8%-32% v/v обычно используется для поведенческой оценки и может вызывать условное неприятие вкуса и переохлаждение29. ДМСО является диполярным апротонным растворителем высокой полярности и используется в качестве растворителя для растворения многочисленных органических соединений. Сравнительное исследование показало, что ДМСО/метанол (50:50 v/v) приводит к оптимальному выходу фенольных кислот в кожурах цитрусовых30. Тем не менее, доза, концентрация и частота не являются игнорируемыми факторами, когда ДМСО доставляется животным. Доза 17,7 г/кг, введенная внутрибрюшинно у мышей, достигших LD50, при одновременном снижении дозы до 2,5 г/кг в течение 6 недель у мышей не вызывала наблюдаемых побочных эффектов31. Хотя рекомендуемая концентрация ДМСО составляет 0,5%-5%, ДМСО не способен растворять многие соединения. Colucci et al. проверили эффекты DMSO и ДМСО-содержащего физиологического раствора в различных концентрациях при внутрицеребровентрикулярном и пероральном введении у мышей. Исследование показало, что раствор 25% ДМСО в физиологическом растворе не изменяет поведенческие реакции животных32. Tween 80 является неионным поверхностно-активным веществом и широко используется в качестве сорастворителя для повышения растворимости плохо растворимых лекарственных средств и усиления фармакокинетических свойств33. Концентрация 1% Tween 80 была выбрана с учетом безопасности33. Таким образом, вышеуказанные растворители и поверхностно-активные вещества в различных концентрациях использовали для полной солюбилизации нарингенина для внутрибрюшинного введения.
Некоторые предложения перечислены здесь для рассмотрения. Во-первых, мы предлагаем начать с небольшого количества фитохимического соединения для предварительных экспериментов с учетом стоимости потребления. Во-вторых, перед приготовлением раствора необходимо провести всесторонние исследования литературы, особенно тщательные исследования, касающиеся видов животных, заболеваний, путей введения и частоты. В-третьих, диапазоны концентраций растворителей и сорастворителей, таких как поверхностно-активные вещества, зависят от имеющейся литературы, предварительных экспериментов и цели дизайна исследования. В-четвертых, использование инсулинового шприца вместо обычного шприца рекомендуется для уменьшения инъекционной травмы от относительно высокой частоты введения. В-пятых, для поддержания стерильных условий рекомендуется стерилизовать раствор с помощью фильтра 0,2 мкм и использовать стерильные шприцы и ватные тампоны, смоченные в спирте, при введении раствора живым животным.
Преимуществами протокола являются его простота в эксплуатации и низкая стоимость. Таким образом, протокол демонстрирует приготовление фитохимического раствора для внутрибрюшинного введения у мышей, на примере нарингенина. Протокол принесет пользу исследователям, занимающимся скринингом лекарств или фармакологией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81973607 и 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley Online Library. (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. , Pharmaceutical Press. London, Chicago. (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), Basel, Switzerland. (2019).
- van Thriel, C.
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
