Summary
Qui, il protocollo presenta la preparazione della soluzione di naringenina per la somministrazione intraperitoneale in vivo . La naringenina è completamente sciolta in una miscela di dimetilsolfossido, Tween 80 e soluzione salina. Gli effetti osteoporotici antidiabetici della naringenina sono stati valutati mediante test della glicemia, colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati e saggio immunoassorbente enzimatico.
Abstract
La preparazione di una soluzione composta (fitochimica) è un passaggio trascurato ma critico prima della sua applicazione in studi come lo screening farmacologico. La completa solubilizzazione del composto è necessaria per il suo uso sicuro e risultati relativamente stabili. Qui, un protocollo per la preparazione della soluzione di naringenina e la sua somministrazione intraperitoneale in una dieta ricca di grassi e un modello diabetico indotto da streptozotocina (STZ) è dimostrato come esempio. Una piccola quantità di naringenina (3,52-6,69 mg) è stata utilizzata per testare la sua solubilizzazione in solventi, tra cui etanolo, dimetilsolfossido (DMSO) e DMSO più Tween 80 ricostituito in soluzione fisiologica (PS), rispettivamente. La completa solubilizzazione del composto viene determinata osservando il colore della soluzione, la presenza di precipitati dopo la centrifugazione (2000 x g per 30 s) o lasciando riposare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente (RT). Dopo aver ottenuto un composto stabile/soluzione fitochimica, la concentrazione/quantità finale del composto necessaria per gli studi in vivo può essere preparata in una soluzione madre di solo solvente (senza PS) e quindi diluita/miscelata con PS come desiderato. Gli effetti osteoporotici antidiabetici della naringenina nei topi (somministrazione intraperitoneale a 20 mg/kg p.c., 2 mg/ml) sono stati valutati misurando la glicemia, la massa ossea (micro-CT) e la velocità di riassorbimento osseo (colorazione TRAP ed ELISA). I ricercatori alla ricerca di preparazioni dettagliate di soluzioni organiche / fitochimiche trarranno beneficio da questa tecnica.
Introduction
Con l'aumento degli studi sull'uso di composti fitochimici per lo screening dei farmaci, vale la pena prestare attenzione agli approcci per preparare soluzioni fitochimiche per valutare i loro effetti ottimali. Molti aspetti come la metodologia di dissoluzione, il dosaggio e la concentrazione devono essere considerati quando si prepara il composto1.
La dissoluzione a base di solvente è ampiamente utilizzata per la preparazione di composti organici1. I solventi comunemente usati includono acqua, olio, dimetilsolfossido (DMSO), metanolo, etanolo, acido formico, Tween, glicerina, ecc2. Sebbene una sospensione con sostanze non disciolte sia accettabile quando il composto viene somministrato mediante sonda gastrica, un soluto completamente disciolto è fondamentale per la somministrazione endovenosa. Poiché la soluzione oleosa, la sospensione e l'emulsione possono causare embolie capillari, si suggerisce una soluzione acquosa per la preparazione del composto, specialmente quando si somministrano iniezioni endovenose, intramuscolari e intraperitoneali3.
L'intervallo di dosaggio efficace varia tra i composti e anche tra le malattie trattate con lo stesso composto. Le determinazioni della dose efficace e sicura e della concentrazione dipendono dalla letteratura e dagli esperimenti preliminari4. Qui, la preparazione del composto naringenina è dimostrata come esempio.
La naringenina (4,5,7-triidrossi-flavanone), un composto polifenolico, è stata studiata nel trattamento della malattia per le sue attività epatoprotettive5, antidiabetiche6, antinfiammatorie7 e antiossidanti8. Per le applicazioni in vivo, la somministrazione orale di naringenina è comunemente usata. Studi precedenti hanno riportato la preparazione di una soluzione di naringenina in carbossimetilcellulosa allo 0,5%-1%, dose di metilcellulosa allo 0,5%, DMSO allo 0,01% e soluzione fisiologica (PS) a 50-100 mg/kg, somministrata mediante sonda gastrica orale 9,10,11,12. Inoltre, altri studi hanno riportato l'integrazione di naringenina con chow al 3% (wt/wt) per assunzione orale alla dose di 3,6 g/kg/die13,14. Gli studi hanno anche riportato l'uso di etanolo (0,5% v / v), PS e DMSO per sciogliere la naringenina per iniezione intraperitoneale a 10-50 mg / kg15,16,17,18. In uno studio sull'epilessia del lobo temporale, i topi hanno ricevuto un'iniezione di naringenina sospesa in carbossimetilcellulosa allo 0,25% disciolta in PS19. Sebbene questi studi riportino l'uso di diversi solventi per preparare soluzioni di naringenina, ulteriori dettagli, come lo stato di dissoluzione e la risposta animale, non sono stati riportati.
Questo protocollo introduce una procedura per la preparazione della soluzione di naringenina per l'applicazione in vivo nell'osteoporosi indotta da diabete. La preparazione della soluzione iniettabile comprende la preparazione di solventi e composti, la stima del dosaggio, il processo di dissoluzione e la filtrazione. Il dosaggio è stato determinato sulla base della ricerca bibliografica e di esperimenti preliminari monitorando i topi dopo aver somministrato iniezioni ogni giorno per 3 giorni e modificando il dosaggio in base ai comportamenti del topo. La concentrazione finale scelta (20 mg/kg p.c.) è stata somministrata per via intraperitoneale 5 giorni alla settimana per 8 settimane in una dieta ricca di grassi e topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ)20,21. Gli effetti della naringenina nell'osteoporosi diabetica sono stati valutati mediante test della glicemia, micro-CT, colorazione con fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP) e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
Nel complesso, è stato osservato che la naringenina in un intervallo di concentrazione di 40-400 mg/ml non si dissolve completamente né in etanolo né in DMSO né al 5% (etanolo o DMSO) più il 95% di PS (v/v). Tuttavia, la naringenina si è sciolta completamente in una miscela di 3,52% DMSO, 3,52% Tween 80 e 92,96% PS. La procedura dettagliata aiuterà i ricercatori a preparare il composto come soluzione di iniezione per l'applicazione in vivo .
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Protocol
Le indagini descritte erano conformi alle linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche e sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Shanghai della medicina tradizionale cinese. Quando si eseguono gli esperimenti, sono necessari camici da laboratorio, guanti monouso in nitrile e occhiali protettivi per motivi di sicurezza.
1. Preparazione dei solventi e stima della naringenina necessaria per l'applicazione in vivo
- Preparare i seguenti solventi: Tween-80 (intervallo di concentrazione finale: 0,5% -1%), DMSO, glicerina (intervallo di concentrazione finale: 15% -20%), etanolo (intervallo di concentrazione finale: 12% per iniezione intramuscolare)22 e 0,9% PS.
- Stimare la quantità di naringenina necessaria in base alla dose, al numero di topi e alla frequenza di iniezione.
- Ordinare 10 topi (C57BL/6, maschio, 5 settimane, SPF) per somministrare naringenina 5 giorni alla settimana per 8 settimane. Mantenere i topi in specifiche condizioni prive di agenti patogeni (SPF).
NOTA: La dose necessaria per l'iniezione intraperitoneale è di 20 mg/kg p.c.23. - Pesare 160 mg di naringenina in base al seguente calcolo: 20 mg/kg x 0,02 kg/topo x 10 topi x 5 giorni/settimana x 8 settimane = 160 mg.
- Ordinare 10 topi (C57BL/6, maschio, 5 settimane, SPF) per somministrare naringenina 5 giorni alla settimana per 8 settimane. Mantenere i topi in specifiche condizioni prive di agenti patogeni (SPF).
- Calcolare la concentrazione di naringenina da iniettare in vivo.
- Preparare il volume raccomandato in base al peso corporeo dei topi. Il volume raccomandato di naringenina applicato a ciascun topo è pari all'1% del peso corporeo (0,3 ml). In questo esperimento, sono stati utilizzati 0,2 ml per mouse.
- Calcola il volume totale: 0,2 ml per mouse x 10 mouse x 5 giorni/settimana x 8 settimane = 80 ml.
- Calcolare la concentrazione della Naringenina in magazzino: 160 mg/80 mL solventi = 2 mg/ml.
- Calcola il volume per ogni giorno: 0,2 ml per mouse x 10 topi = 2 ml.
2. Scioglimento
- Soluzione di etanolo
- Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 3,52 mg di naringenina e aggiungerla in una provetta da 2,0 ml.
NOTA: Per ottenere una concentrazione di 2 mg/ml, il volume totale richiesto sarà di 1760 μL (calcolo: 3,52 mg/1760 μL = 2 mg/ml). - Girare rapidamente verso il basso (2000 x g per 30 s) per far depositare la polvere di naringenina sul fondo del tubo (Figura 1A).
- Aggiungere 8,8 μL di etanolo al 100% nel tubo per preparare una soluzione allo 0,5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto2. La naringenina non si dissolve completamente (Figura 1B).
- Continuare ad aggiungere 79,2 μL di etanolo al 100% al tubo per preparare una soluzione al 5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto (calcolo: (79,2 μL + 8,8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). La naringenina non si dissolve completamente (Figura 1B).
- Aggiungere 1672 μL di 0,9% PS al tubo contenente il 5% di etanolo, come descritto al punto 2.1.4. Questo produrrà un'emulsione (Figura 1D). Centrifuga (2000 x g per 30 s) la soluzione per verificare se la naringenina è completamente disciolta nella soluzione. Nella soluzione compaiono precipitati bianchi di naringenina non disciolta (Figura 1E).
- Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 3,52 mg di naringenina e aggiungerla in una provetta da 2,0 ml.
- Soluzione DMSO
- Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 3,95 mg di naringenina e aggiungere in una provetta da 2,0 ml.
NOTA: Per ottenere una concentrazione di 2 mg/ml, il volume totale richiesto sarà di 1975 μL (calcolo: 3,95 mg/1975 μL = 2 mg/ml). - Girare rapidamente verso il basso (2000 x g per 30 s) per far depositare la polvere di naringenina sul fondo del tubo.
- Aggiungere 9,8 μL di DMSO alla provetta per preparare una soluzione allo 0,5% (v/v) (calcolo: 9,8 μL/1975 μL x 100% = 5%). La naringenina si dissolve completamente (Figura 2A).
- Aggiungere 88,2 μL di DMSO al tubo per preparare una soluzione al 5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto (calcolo: (88,2 μL + 9,8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). La naringenina si dissolve completamente (Figura 2B).
- Aggiungere 1877 μL di 0,9% PS (v/v per cento del 95%) alla soluzione preparata al punto 2.2.4. Viene prodotta un'emulsione (Figura 1C). Centrifuga (2000 x g per 30 s) la soluzione per verificare se la naringenina è completamente disciolta nella soluzione. Nella soluzione compaiono precipitati bianchi di naringenina non disciolta (Figura 1D).
- Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 3,95 mg di naringenina e aggiungere in una provetta da 2,0 ml.
- Soluzione Tween-80 e DMSO
- Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 6,69 mg di naringenina e aggiungerla in una provetta da 5,0 ml.
NOTA: Per raggiungere la concentrazione finale di 2 mg/ml, il volume totale della soluzione richiesto sarà di 3345 μL (calcolo: 6,69 mg/3345 μL = 2 mg/ml). - Girare rapidamente verso il basso (2000 x g per 30 s) per far depositare la polvere di naringenina sul fondo del tubo.
- Aggiungere 117,7 μL di DMSO per preparare una soluzione al 3,5% (v/v) rispetto al volume totale richiesto (calcolo: 117,7 μL /3345 μL x 100% = 3,5%). La naringenina si dissolve completamente (Figura 3A)
- Aggiungere 117,7 μL di Tween 80 alla soluzione preparata al punto 2.3.3 per ottenere il 3,5% (v/v) di Tween 80 e il 3,5% (v/v) di DMSO. Osservare la completa dissoluzione della naringenina (Figura 3B)
- Aggiungere lentamente la soluzione preparata al punto 2.3.4 in una provetta da 5,0 mL contenente 3109,6 μL di 0,9% PS (v/v per cento del 93%) e agitare bene per ottenere una soluzione apparente di naringenina (Figura 3C).
- Lasciare che la soluzione preparata al punto 2.3.5 rimanga a temperatura ambiente (RT) per 2 ore. La soluzione è ancora evidente senza precipitati visibili (Figura 3D).
- Per preparare la soluzione di naringenina a 2 mg/ml, pesare 6,69 mg di naringenina e aggiungerla in una provetta da 5,0 ml.
- Preparazione della soluzione di naringenina per la somministrazione in vivo
- Secondo il punto 1.2.2, pesare 160 mg di naringenina (160 mg / 2 mg / ml = 80 ml).
- Aggiungere 2,8 ml di DMSO per ottenere una soluzione al 3,5% (v/v) (calcolo: 2,8 mL / 80 mL x 100% = 3,5%)
- Quindi, aggiungere 2,8 mL di Tween 80 alla soluzione preparata al punto 2.4.2 per ottenere il 3,5% (v/v) di Tween 80 e il 3,5% (v/v) di DMSO.
- Aliquot la soluzione preparata al punto 2.4.3 in quattro provette, 1,4 mL per provetta [(2,8 mL + 2,8 mL) / 4 = 1,4 mL].
- Aliquote 18,6 mL di 0,9% PS a cinque tubi da 15 mL.
- Conservare la soluzione preparata nei punti 2.4.3 (soluzione madre) e 2.4.5 a 4 °C (2,8 mL + 2,8 mL + 18,6 mL x 4 = 80 mL).
- Prelevare 140 μL della soluzione madre (fase 2.4.3) e mescolarla con 1860 μL di PS allo 0,9% per preparare 2 mL di soluzione di naringenina per 1 giorno di somministrazione.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 μm.
3. Somministrazione della soluzione di Naringenin
- Movimentazione e contenzione
- Spruzzare la gabbia e le mani con alcool al 70-75% prima di aprire il coperchio. Sollevare il mouse per la base della coda e posizionarlo su una superficie solida per posizionare delicatamente la coda all'indietro.
- Afferrare la collottola dietro le orecchie con il pollice sinistro e l'indice e posizionare la coda tra il mignolo e l'anulare. Tenere il mouse in posizione supina con l'estremità posteriore leggermente sollevata.
- Iniezione
- Afferrare la pelle posteriore del topo in modo che la pelle addominale sia tesa.
- Spingere l'ago (siringa da insulina) con un angolo di 10° tra l'ago e la superficie addominale, nel quadrante inferiore destro o sinistro dell'addome per evitare di colpire la vescica, il fegato o altri organi interni.
- Far scorrere l'ago per via sottocutanea in direzione cranica per 3-5 mm, quindi inserirlo con un angolo di 45° nella cavità addominale.
- Quando l'ago passa attraverso la parete addominale e la resistenza scompare, eseguire un'aspirazione per confermare che nessun materiale di riflusso viene ritirato. Quindi, spingere lentamente la soluzione.
- Dopo l'iniezione, estrarre lentamente l'ago e ruotarlo leggermente per evitare perdite. Il volume raccomandato è 50-100 μL/10 g.
- Smaltire la Naringenina avanzata in un contenitore a rischio biologico.
4. Test della glicemia
NOTA: Testare la glicemia 1 giorno prima dell'iniezione e 1 e 2 mesi dopo l'iniezione.
- Digiunare i topi per 15 ore prima del test della glicemia. L'acqua può continuare ad essere fornita.
- Apri le strisce reattive e segna la data. Una volta aperte, utilizzare le strisce reattive entro 3 mesi. Conservare le strisce reattive a 2-30 °C. Chiudere ermeticamente il coperchio dopo aver rimosso la striscia per evitare la formazione di umidità.
- Posizionare l'animale nella camera di induzione. Accendere il vaporizzatore ad un livello di induzione del 4% per l'isoflurano e di 4 L/min per l'ossigeno. Dopo che l'animale è completamente anestetizzato, mantenere l'anestetico con il cono nasale e la somministrazione di anestetico ad un livello dell'1,5% per l'isoflurano e di 0,4 L/min per l'ossigeno.
- Pulire la coda con batuffoli di cotone / tamponi imbevuti di alcool al 70% -75%.
- Partendo dal punto più basso della coda, fare una piccola puntura sulla vena laterale della coda con una puntura dell'ago da 25G e spremere una goccia di sangue.
- Pulire la goccia di sangue con una carta velina.
- Spremere un'altra goccia di sangue e raccoglierla sul bordo di una striscia reattiva.
- Leggere e registrare il risultato visualizzato sul misuratore di glucosio.
- Per fermare l'emorragia, pizzicare la coda del topo con una garza sterile e pulire l'area con alcol al 75%.
- Ulteriori campioni possono essere ottenuti con una tecnica simile che si muove lungo la coda cranicamente.
5. Colorazione TRAPPOLA
- Preparazione diapositive
- Eseguire test della glicemia a digiuno sui topi una volta alla settimana. Quando i livelli di glucosio nel sangue sono ≥ 11,1 mmol / L (indicativi di topi diabetici di tipo II di successomodello 24), eutanasia i topi usando CO2, seguita da dislocazione cervicale, e raccogliere il lombare 4 ° -6° (L4-L6) (non viene eseguita eutanasia durante il test della glicemia a digiuno).
- Fissare i campioni L4-L6 con paraformaldeide al 4% per 24 ore (assicurarsi che il volume di paraformaldeide sia >20x il volume del tessuto), quindi lavare per 2 ore in flusso continuo di acqua di rubinetto.
- Per decalcificare i campioni, immergerli in una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) al 10% per 2 settimane a RT in condizioni statiche fino a quando i campioni non si ammorbidiscono. Assicurarsi che il volume della soluzione decalcificante sia 20-30 volte il volume del tessuto/campione. Cambiare la soluzione EDTA a giorni alterni.
- Disidratare il campione utilizzando un disidratatore.
- Posizionare i campioni in cassette di incorporamento per la lavorazione dei tessuti. Numerare la cassetta usando una matita.
- Impostare il programma disidratatore come segue: alcol al 75% per 2 ore, alcol all'85% per 1 ora, alcol al 95% per 1 ora, alcol al 95% per 2 ore, etanolo anidro (I) per 2 ore, etanolo anidro (II) per 2 ore, etanolo anidro (III) per 2 ore, xilene (I) per 1 ora, xilene (II) per 1 ora, xilene (III) per 1 ora, cera di paraffina (I) per 2 ore e cera di paraffina (II) per 2 ore, a RT.
- Incorporare i campioni nella cera di paraffina.
- Aggiungere la cera di paraffina al vassoio della cassetta della stazione di incorporamento della paraffina e portare a 60 °C. Immergere i campioni disidratati per almeno 2 ore.
- Posizionare la cassetta velina nel vassoio della cassetta e preriscaldare.
- Aggiungere la cera di paraffina nel serbatoio di paraffina e portare a 60 °C.
- Dopo 2 ore, portare sia la cassetta del tessuto che i campioni nell'area di lavoro. Versare la cera di paraffina preriscaldata dal serbatoio di paraffina nella cassetta dei tessuti. Posizionare il campione nella cera di paraffina, assicurarsi che la cera di paraffina copra completamente il tessuto, quindi spostare immediatamente la cassetta su una stazione di glassa.
- Utilizzare un microtomo per tagliare i campioni incorporati in paraffina in sezioni da 5-6 μm. Dispiegare le sezioni in acqua calda a 40 °C per meno di 10 s. Raccogli le sezioni sui vetrini rivestiti di APS (amminosilano). Asciugare i vetrini a RT per 1 ora, quindi spostare i vetrini in un forno impostato a 60 °C per la notte.
- Preparazione del reagente TRAP
- Preparare la soluzione di incubazione madre di base: sciogliere 9,2 g di acetato di sodio anidro, 11,4 g di acido L-(+) tartarico e 2,8 ml di acido glaciale in 1000 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 4,7-5,0 e conservare a RT per un massimo di 6 mesi.
- Preparare la soluzione di naftolo-etere: sciogliere 0,1 g di naftolo AS-BI fosfato in 5 ml di glicole etilenico monoetil etere. Conservare a 4 °C per un massimo di 5 settimane.
- Preparare la soluzione di nitrito di sodio: sciogliere 1 g di nitrito di sodio in 25 ml di acqua distillata. Conservare a 4 °C.
- Preparare il colorante Pararosanilina: Aggiungere 1 g di base pararosanilina a 20 ml di 2N HCl (83 ml di HCl in 417 ml di acqua). Utilizzare una piastra di mescolare per sciogliere la base e filtrarla prima dell'uso.
- Colorazione TRAP
- Riempire due vasetti Coplin con 50 ml di soluzione di incubazione madre di base e metterli in forno a 37 °C per 2 ore.
- Prendi un barattolo Coplin e aggiungi 0,5 ml di soluzione di naptol-etere.
- Posizionare i vetrini nel barattolo Coplin e incubare a 37 °C per 1 ora.
NOTA: preparare almeno tre diapositive per ogni gruppo. - Pochi minuti prima della fine del tempo di incubazione, aggiungere 1 ml di soluzione di nitrito di sodio e 1 ml di colorante pararosanilina. Mescolare delicatamente per 30 secondi e lasciare agire per 2 minuti.
- Aggiungere la soluzione preparata al punto 5.2.2 all'altro barattolo Coplin preriscaldato contenente la soluzione madre di base. Mescolare bene la soluzione e inserire i vetrini dal barattolo Coplin al punto 5.3.3.
- Incubare per 15-20 minuti a RT.
- Risciacquare le fette in un altro barattolo Coplin con 200 ml di PBS per 5 minuti.
- Contro-colorare le fette con ematossilina al 100% per 30 s in un barattolo Coplin.
- Disidratare le fette con alcool all'85%, 95% e 100% (200 ml) per 2 minuti ciascuna e trattare con xilene (200 ml) per 2 minuti per 3x. Usa i barattoli Coplin per eseguire ogni passaggio.
- Fissare la sezione sul vetro di copertura con un coprivetrino con resina. Assicurarsi di evitare l'intrappolamento di bolle d'aria.
6. ELISA
- Preparazione del campione
- Rimuovere i tessuti molli dal femore e dalla tibia del topo. Pulire le ossa con una garza.
- Introdurre i campioni ossei in una provetta da microcentrifuga da 1 mL e conservare le provette a -80 °C.
NOTA: I campioni possono anche essere conservati in un serbatoio di azoto liquido per non più di 6 mesi. - Pesare il campione osseo. Diluire con 0,9% PS in un rapporto di 1:10. Ad esempio, diluire 0,1 g di osso con 1 ml di PS.
- Aggiungere perle di zirconia da 3 mm nel tubo e macinare i campioni 3 volte a 70 Hz per 30 s con 20 s di riposo in mezzo.
- Centrifugare i campioni a 4 °C e 12.000 x g per 5 minuti. Raccogli il surnatante.
- Kit di analisi ELISA
NOTA: Eseguire ELISA secondo il protocollo di analisi specificato dal produttore.- Aggiungere 100 μL di ogni diluizione di standard, bianco e campione nei pozzetti appropriati. Incubare per 90 min a 37 °C.
- Decantare il liquido da ciascun pozzetto e aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro anticorpale di rilevamento biotinilato. Incubare per 1 h a 37 °C.
- Decantare la soluzione, aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Immergere per 1 minuto, ripetere 3x.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro coniugata HRP a ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Decantare la soluzione. Ripetere il processo di lavaggio 5 volte come descritto al punto 6.2.3.
- Aggiungere 90 μL del reagente del substrato. Incubare per 15 minuti a 37 °C al riparo dalla luce.
- Aggiungere 50 μL della soluzione di arresto.
- Utilizzare un lettore di piastre per registrare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm.
- Generazione di curve standard
- Tracciare i rispettivi valori medi di assorbanza rispetto alle concentrazioni proteiche diluite in serie.
- Unisci i punti per creare la curva di adattamento migliore. Utilizzare qualsiasi applicazione informatica appropriata (foglio di calcolo) per generare l'equazione della curva standard.
- Sostituire il valore di assorbanza di ciascun campione nell'equazione della curva standard per ottenere la concentrazione del rispettivo campione.
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Representative Results
Il peso corporeo dei topi diabetici alimentati con dieta ad alto contenuto di grassi e indotti da STZ è diminuito rispetto a quello dei gruppi di controllo da 0-8 settimane dopo il trattamento con STZ. La perdita di peso dei topi trattati con naringenina è stata significativa rispetto ai topi non trattati (gruppo STZ) alla settimana 4. I gruppi di controllo e STZ sono stati somministrati con lo stesso volume di PS (Tabella 1). Il livello di glucosio nel sangue nei topi diabetici è aumentato drasticamente entro 1 mese dall'induzione di STZ. Poi è diminuito automaticamente a un livello osservato 2 mesi fa quando è stato stabilito il modello animale. Il trattamento con naringenina ha abbassato i livelli di glucosio nel sangue del 51,8% e del 34,8% rispettivamente a 1 e 2 mesi (Tabella 2). I topi diabetici indotti da STZ hanno mostrato perdita ossea, come indicato dalla diminuzione del volume osseo / volume tissutale (BV / TV) (30,97%) e del numero di trabecole (Tb.N) (11,4%), rispettivamente. I cambiamenti nei valori di questi due parametri suggeriscono che il trattamento con naringenina ha salvato significativamente la perdita ossea (Tabella 3). L'attività degli osteoclasti, come indicato da N.oc/Tb.Ar (numero di osteoclasti per area ossea trabecolare) è aumentata nella dieta ricca di grassi e nei topi diabetici indotti da STZ, sebbene non sia stata osservata alcuna significatività statistica tra il modello di controllo e quello di malattia. Il trattamento con naringenina ha ridotto significativamente le attività degli osteoclasti, come mostrato nella Figura 4 e nella Tabella 4. Il telopeptide C-terminale del collagene di tipo I (CTIX) e il propeptide N-terminale del procollagene di tipo I (PINP) erano elevati rispettivamente del 68,09% e del 204,88% negli animali diabetici, indicando un drammatico aumento del tasso di riassorbimento osseo. La naringenina ha ridotto significativamente entrambi gli indicatori del tasso di riassorbimento osseo (Tabella 5).
Figura 1: Dissoluzione della naringenina in etanolo. (A) Polvere di naringenina nel tubo dopo la centrifuga. (B) Naringenina + etanolo (400 mg/ml - 3,52 mg di naringenina in 8,8 μL di etanolo). (C) Naringenina + etanolo (40 mg/ml - 3,52 mg di naringenina in 8,8 μL di etanolo) (D) Naringenina in etanolo al 5% (v/v) e al 95% PS (0,9%). (E) Precipita in D dopo la rotazione. (F) Misurazione per ottenere la barra della scala per le figure 1, 2 e 3. Nar: Naringenina. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dissoluzione della naringenina nel DMSO. (A) Naringenina + DMSO (400 mg/ml - 3,95 mg di naringenina in 9,8 μL di DMSO). (B) Naringenina + DMSO (40 mg / mL- 3,95 mg di naringenina in 98 μL di DMSO). (C) Naringenina in DMSO al 5% (v/v) e al 95% PS (0,9%). (D) Precipita in C dopo lo spin down. Nar: Naringenina. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dissoluzione della naringenina in DMSO e Tween 80. (A) Naringenina + DMSO (57,2 mg/ml - 6,69 mg di naringenina in 117,7 μL di DMSO). (B) Naringenina + DMSO + Tween (57,2 mg/ml - 6,69 mg di naringenina in 117,7 μL di DMSO e 117,7 μL di Tween 80). (C) Naringenina nella miscela di 3,5% (v/v) DMSO, 3,5% (v/v) Tween 80 e 93% PS (0,9%). (D) Nessun precipitato in C dopo lo spin down. Nar: Naringenina. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'effetto della naringenina sull'attività osteoclastica dei topi ad alto contenuto di grassi alimentati con dieta e iniettati con STZ (STZ). Colorazione TRAP dell'osso trabecolare e degli osteoclasti delle vertebre L4. I triangoli indicavano osteoclasti. Barra di scala = 100 μm. Questa cifra è stata modificata da Liu et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| g) | 0 settimana | 1 settimana | 2 settimane | 4 settimane | 5 settimane | 6 settimane | 8 settimane |
| Controllo | 23,7 ± 0,2 | 25,1 ± 1,3 | 26,2 ± 1,0 | 27,7 ± 0,5 | 31,1 ± 0,7 | 31,7 ± 0,8 | 32,7 ± 1,3 |
| STZ | 16,8 ± 1,7** | 18,2 ± 2,5** | 18,6 ± 2,5** | 18,2 ± 1,4** | 21,3 ± 1,6** | 22,0 ± 1,4** | 20,8 ± 1,4** |
| Naringenina | 16,6 ± 1,1** | 17,6 ± 1,5** | 17,4 ± 1,7** | 15.6 ± 1.4**ΔΔ | 18.4 ± 1.5**ΔΔ | 17.7 ± 1.4**ΔΔ | 15.5 ± 1.0**ΔΔ |
| ** p < 0,01 vs. controllo | |||||||
| ΔΔ p < 0,01 vs STZ | |||||||
Tabella 1: Peso corporeo di topi ad alto contenuto di grassi alimentati con dieta e iniettati con STZ (STZ) in gruppi e periodi. I dati sono mostrati come media ± s.d. ** p < 0,01 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| (mmol/L) | 0 mese | 1 mese | 2 mesi |
| Controllo | 4,9 ± 0,9 | 8,4 ± 0,7 | 8,3 ± 0,5 |
| STZ | 12,8 ± 4,2** | 22,8 ± 4,3** | 15,5 ± 2,7* |
| Naringenina | 13,2 ± 3,5** | 11.0 ± 1.9ΔΔ | 10.1 ± 5.3ΔΔ |
| * p < 0,05, ** p < 0,01 vs controllo | |||
| ΔΔ p < 0,01 vs STZ | |||
Tabella 2: Glicemia a digiuno dei topi STZ in gruppi e periodi. I dati sono indicati come media ± s.d. * p < 0,05 ** p < 0,01 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| BV/TV (%) | Tb.N (1/mm) | |
| Controllo | 0,268 ± 0,046 | 5.35 ± 0.31 |
| STZ | 0,185 ± 0,081* | 4,74 ± 0,77* |
| Naringenina | 0.241 ± 0.032Δ | 5.47 ± 0.19ΔΔ |
| * p < 0,05 vs controllo | ||
| Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ | ||
Tabella 3: Parametri relativi alla massa ossea dei topi STZ tra i gruppi. I dati sono mostrati come media ± s.d. * p < 0,05 vs. Control, Δ p < 0,05, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| 1/μm2 | N.oc/T.Ar |
| Controllo | 0,000182 ± 8,84E-05 |
| STZ | 0,00024 ± 2,06E-05 |
| Naringenina | 0,000156 ± 3,88E-05ΔΔ |
| ΔΔ p < 0,01 vs STZ | |
Tabella 4: Attività osteoclastica dei topi STZ tra i gruppi. I dati sono mostrati come media ± s.d. ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
| ng/mL | CTIX | PINP |
| Controllo | 22 ± 8.98 | 1,64 ± 0,95 |
| STZ | 36,98 ± 22,57 | 5 ± 2,33 * |
| Naringenina | 5.31 ± 2.09 ΔΔ | 0.85 ± 0.02 ΔΔ |
| * p < 0,05 vs controllo | ||
| ΔΔ p < 0,01 vs STZ | ||
Tabella 5: Tasso di riassorbimento osseo dei topi STZ tra i gruppi. I dati sono indicati come media ± s.d. * p < 0,05 vs. Control, ΔΔ p < 0,01 vs. STZ.
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Discussion
La preparazione della soluzione fitochimica è la base per la sua applicazione in vivo. In questo protocollo, la preparazione della soluzione di naringenina è stata dimostrata utilizzando diversi solventi, come etanolo, DMSO, Tween 80 e 0,9% PS. La soluzione in stato completamente disciolto deve essere ulteriormente monitorata lasciandola rimanere a temperatura ambiente per alcune ore prolungate, e quindi filtrata prima di essere utilizzata in vivo.
La determinazione del solvente è un passo fondamentale in questo protocollo. Esistono molte opzioni di solventi per sciogliere i composti, di cui etanolo, DMSO e PS sono i più utilizzati. L'etanolo può dissolvere molti composti insolubili in acqua a causa delle sue proprietà altamente polari, consentendo il legame idrogeno e dissolvendo così sia le sostanze polari che quelle non polari. Inoltre, la concentrazione di etanolo può determinare le proprietà del composto fitochimico. Ad esempio, il 75% in peso di etanolo / solvente dell'acqua è considerato il migliore per estrarre la massima resa di polifenoli e ha le proprietà antiossidanti più forti26. Un altro studio ha rilevato che la concentrazione di etanolo potrebbe essere abbassata al 32,5% a 150 ° C per gli estratti di polifenoli per esprimere proprietà antiossidanti27. Tuttavia, un'alta concentrazione di etanolo può causare neurotossicità ed epatotossicità28. L'iniezione di etanolo (i.p.) in un intervallo di concentrazioni dall'8% al 32% v / v è comunemente usata per la valutazione comportamentale e può causare avversione condizionale al gusto e ipotermia29. DMSO è un solvente aprotico dipolare di alta polarità e viene utilizzato come solvente per dissolvere numerosi composti organici. Uno studio comparativo ha indicato che DMSO/metanolo (50:50 v/v) ha determinato la resa ottimale di acidi fenolici nelle scorze di agrumi30. Tuttavia, la dose, la concentrazione e la frequenza non sono fattori ignorabili quando il DMSO viene somministrato agli animali. Una dose di 17,7 g/kg somministrata per via intraperitoneale nei topi ha raggiunto la DL50 abbassando la dose a 2,5 g/kg per 6 settimane nei topi non ha causato effetti avversi osservabili31. Sebbene la concentrazione di DMSO suggerita sia dello 0,5% -5%, il DMSO non è in grado di sciogliere molti composti. Colucci et al. hanno testato gli effetti del DMSO e della soluzione salina contenente DMSO a diverse concentrazioni mediante somministrazione intracerebroventricolare e orale nei topi. Lo studio ha dimostrato che una soluzione del 25% di DMSO nella soluzione salina non ha modificato le risposte comportamentali degli animali32. Tween 80 è un tensioattivo non ionico ed è ampiamente usato come co-solvente per aumentare la solubilità di farmaci scarsamente solubili e migliorare le caratteristiche farmacocinetiche33. È stata scelta una concentrazione dell'1% di Tween 80 considerando la sicurezza33. Pertanto, i suddetti solventi e tensioattivi a diverse concentrazioni sono stati utilizzati per solubilizzare completamente la naringenina per la somministrazione intraperitoneale.
Alcuni suggerimenti sono elencati qui per essere presi in considerazione. In primo luogo, suggeriamo di partire da una piccola quantità di composto fitochimico per esperimenti preliminari considerando il costo del consumo. In secondo luogo, è necessario eseguire ricerche bibliografiche complete, in particolare studi approfonditi riguardanti le specie animali, le malattie, le vie di somministrazione e la frequenza, prima di preparare la soluzione. In terzo luogo, gli intervalli di concentrazione di solventi e co-solventi come i tensioattivi dipendono dalla letteratura disponibile, dagli esperimenti preliminari e dallo scopo del disegno dello studio. In quarto luogo, si raccomanda l'uso di una siringa da insulina invece di una siringa normale per ridurre il danno da iniezione da una frequenza relativamente elevata di somministrazione. In quinto luogo, per mantenere condizioni sterili, si raccomanda di sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm e utilizzare siringhe sterili e tamponi di cotone imbevuti di alcool quando si inietta la soluzione in animali vivi.
I vantaggi del protocollo sono il suo funzionamento semplice e basso costo. In sintesi, il protocollo dimostra la preparazione di una soluzione fitochimica per la somministrazione intraperitoneale nei topi, con la naringenina come esempio. Il protocollo andrà a beneficio dei ricercatori che si occupano di screening farmacologico o farmacologia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81973607 e 81573992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
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