Summary
गुर्दे की इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट अस्पताल में भर्ती रोगियों में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़ी हुई है। यहां, हम एकतरफा गुर्दे इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट का एक सरल और प्रभावी माउस मॉडल प्रस्तुत करते हैं और गुर्दे में देखे गए प्रतिनिधि रोग संबंधी परिवर्तनों का अनुक्रमिक अवलोकन प्रदान करते हैं।
Abstract
इस्किमिया-रिपरफ्यूजन इंजरी (आईआरआई) तीव्र गुर्दे की विफलता का प्रमुख कारण है और देरी से ग्राफ्ट फ़ंक्शन में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है। पशु मॉडल एकमात्र उपलब्ध संसाधन हैं जो विवो में आईआरआई से जुड़े नुकसान की जटिलताओं की नकल करते हैं। यह पत्र एकतरफा गुर्दे आईआरआई के एक प्रभावी माउस मॉडल का वर्णन करता है जो अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्रदान करता है। इस्किमिया 30 मिनट के लिए सही गुर्दे के पेडिकल को रोककर प्रेरित होता है, जिसके बाद पुनरावृत्ति होती है। सर्जिकल प्रक्रिया के अलावा, गुर्दे आईआरआई के बाद अपेक्षित शारीरिक और हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का अनुक्रमिक अवलोकन सात अलग-अलग रिपरफ्यूजन समय (4 घंटे, 8 घंटे, 16 घंटे, 1 दिन, 2 दिन, 4 दिन और 7 दिन) से डेटा की तुलना करके प्रदान किया जाएगा। आगे के प्रयोगों की योजना बनाने के लिए महत्वपूर्ण डेटा, जैसे कि औसत सर्जिकल समय, औसत संवेदनाहारी खपत, और समय के साथ शरीर के वजन में परिवर्तन, साझा किया जाएगा। यह काम शोधकर्ताओं को एक विश्वसनीय गुर्दे आईआरआई मॉडल को लागू करने में मदद करेगा और उचित रिपरफ्यूजन समय का चयन करेगा जो उनके इच्छित खोजी लक्ष्यों के साथ संरेखित करता है।
Introduction
गुर्दे शरीर में सबसे अधिक सुगंधित अंगों में से एक हैं और रक्त छिड़काव में परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशीलहैं 1. गुर्दे इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) तीव्र गुर्दे की विफलता 2,3 का प्रमुख कारण बनी हुई है और अस्पताल में भर्ती रोगियों में उच्च रुग्णता और उच्च मृत्यु दर से जुड़ी हुई है4. सीमित चिकित्सीय विकल्प उपलब्ध होने के साथ, 4,5 गुर्दे आईआरआई वर्तमान में बायोमेडिसिन 6,7 में कई शोध प्रयासों का ध्यान केंद्रित कर रहा है जिसका उद्देश्य उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्यों के विकास और गुर्दे की चोट 8,9,10 के शुरुआती और संवेदनशील मार्करों की विशेषता है . इन जरूरतों को पूरा करने के लिए एक विश्वसनीय, समय और लागत प्रभावी पशु मॉडल की पहचान करना आवश्यक माना जाता है। यह पत्र एकतरफा गुर्दे आईआरआई का एक सरल और प्रभावी माउस मॉडल प्रस्तुत करता है। इस्किमिया 30 मिनट11,12 के लिए सही गुर्दे पेडिकल के क्लैंपिंग से प्रेरित है। इस मॉडल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा सबसे उपयुक्त रिपरफ्यूजन समय का चयन कर रहा है जो ब्याज की पैथोलॉजिकल घटनाओं को पुन: पेश करेगा, जैसे ट्यूबलर नेक्रोसिस, पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर भड़काऊ सेल घुसपैठ, या फाइब्रोसिस। इसलिए, शोधकर्ताओं को आईआरआई गुर्दे में अपेक्षित प्रतिनिधि रोग संबंधी परिवर्तनों के इस अनुक्रमिक अवलोकन के साथ प्रदान किया जाता है।
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक उत्तरजीविता सर्जरी का वर्णन करता है। इसलिए, उच्चतम सड़न रोकनेवाला और सर्जिकल अभ्यास लागू किया जाता है। सभी पशु प्रयोगसंस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे। आईआरआई प्रभावों में लिंग और तनाव-आधारित मतभेदों को खत्म करने के लिए, अध्ययन में केवल पुरुष सी 57 बीएल 6 चूहों का उपयोग किया गया था। तुलनीय परिणाम उत्पन्न करने के लिए सभी जानवरों को उम्र और वजन में मिलान किया गया था।
1. तैयारी
नोट: विभिन्न प्रयोगात्मक चरणों और हस्तक्षेपों की एक समयरेखा चित्रा 1 ए में दिखाया गया है।
- प्रत्येक प्रक्रिया से पहले सर्जिकल टेबल को साफ और कीटाणुरहित करें। सर्जिकल टेबल पर सभी आवश्यक सामग्रियों (निष्फल उपकरण और कपास झाड़ू, बाँझ धुंध और पर्दे, पूर्व-पतला संवेदनाहारी, हीटिंग पैड, निष्फल संवहनी क्लैंप, बाँझ खारा समाधान, और त्वचा एंटीसेप्टिक्स और सिवनी) तैयार करें और रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- जाइलाज़िन (क्रमशः 100 मिलीग्राम / किग्रा और 20 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा नर सी 57 बीएल 6 चूहों (आयु सीमा 11-13 सप्ताह) को एनेस्थेटाइज़ करें, पहले बाँझ खारा में पतला)।
नोट: जानवर के लिए तनाव को कम करने के लिए कुशल पशु हैंडलिंग आवश्यक है, क्योंकि तनाव प्रतिक्रियाएं एनेस्थेटिक्स की कार्रवाई को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती हैं। - ज़ाइलाज़िन प्रशासन के बाद, रेजर ब्लेड और साबुन का उपयोग करके दाहिने फ्लैंक पर सर्जिकल क्षेत्र को दाढ़ी दें।
नोट: त्वचा को शेविंग करने से घाव भरने के साथ-साथ जीवित रहने की सर्जरी के सामान्य परिणामों में सुधार होता है। - सर्जिकल क्षेत्र में त्वचा को पहले 70% अल्कोहल के साथ कीटाणुरहित करें और फिर कपास झाड़ू का उपयोग करके पोविडोन आयोडीन समाधान के साथ।
- त्वचा की तैयारी के बाद, माउस को एक उदर डेक्यूबिटस स्थिति में हीटिंग टेबल पर रखें और शरीर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस (गुदा और पैड सेंसर जांच के माध्यम से निगरानी) पर स्थिर करें।
नोट: पार्श्व के बजाय उदर डेक्यूबिटस में रखे जाने पर गुर्दे अधिक आसानी से एक्सेस किए जाते हैं और शल्य चिकित्सा से उजागर होते हैं। - जबकि शरीर का तापमान स्थिर है, माउस की आंखों पर आंखों का मरहम लागू करें।
नोट: विघटनकारी संवेदनाहारी, जैसे कि केटामाइन, संवेदनाहारी होने पर जानवर की आंखें खुली रहती हैं।
2. सर्जरी
- एक बार जब दर्द सजगता अनुपस्थित हो जाती है (चिमटी के साथ पैर की अंगुली चुटकी), स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके दाहिने फ्लैंक पर लगभग 1 सेमी डोरसो-पार्श्व सर्जिकल चीरा करें। अंतिम रिब के पीछे चीरा शुरू करें और काठ का मध्य रेखा के समानांतर लगभग 1 सेमी जारी रखें।
- रेट्रोपरिटोनियल स्पेस की कल्पना करने के लिए कैंची का उपयोग करके पेट की मांसलता को ट्रांसेक्ट करें। बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके मांसपेशियों के विभाजन के दौरान उत्पादित रक्त की थोड़ी मात्रा को हटा दें।
नोट: क्योंकि डोरसो-पार्श्व दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है, रेट्रोपरिटोनियम, और पेरिटोनियल गुहा नहीं, इस प्रक्रिया के साथ एक्सेस किया जाता है। - पेट की गुहा से दाहिने गुर्दे को बाहर निकालें। ध्यान से गुर्दे को उजागर करने के लिए ग्रेफ संदंश का प्रयोग करें।
नोट: पेट पर रखे जाने पर गुर्दे को दर्दनाक चोट से बचने के लिए हमेशा संदंश बंद रखें और इसका उपयोग केवल सर्जिकल चीरा और उससे बाहर गुर्दे को सावधानीपूर्वक धक्का देने और मार्गदर्शन करने के लिए करें। - धीरे-धीरे दाहिने गुर्दे को उजागर करें और गुर्दे के पेडिकल की पहचान करें। ध्यान से पेडिकल के चारों ओर वसा ऊतक को हटा दें।
- इस्किमिया को प्रेरित करने के लिए, गुर्दे की धमनी और गुर्दे के पेडिकल में मौजूद नस पर संवहनी क्लैंप रखें, आसन्न मूत्रवाहिनी को क्लैंप करने से बचें। संवहनी क्लैंप में हेरफेर करने के लिए हैलस्टेड-मच्छर हेमोस्टैट का उपयोग करें।
नोट: इस्किमिया लाल-गुलाबी से गहरे बैंगनी (चित्रा 1 बी) तक गुर्दे के रंग में परिवर्तन के दृश्य द्वारा पुष्टि की जाती है। - निर्जलीकरण से बचने के लिए खारा में भिगोए गए बाँझ धुंध के साथ क्लैंप किए गए गुर्दे को कवर करें और इसे 30 मिनट के लिए छोड़ दें।
- इस समय के दौरान समय-समय पर धुंध की संज्ञाहरण गहराई और आर्द्रता की निगरानी करें।
नोट: संज्ञाहरण की प्रेरण खुराक इस्केमिक घटना के अंत तक एनाल्जेसिया प्रदान करने के लिए पर्याप्त है; इसलिए, कोई अतिरिक्त संवेदनाहारी इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं है। - इस्किमिया अवधि के अंत से कुछ समय पहले, धुंध को हटा दें और गुर्दे को उजागर करें। क्लैंप हटाने के लिए तैयार हैलस्टेड-मच्छर हेमोस्टैट पकड़ो।
- मिनट 30 पर, हेमोस्टैट के साथ संवहनी क्लैंप खोलें और गुर्दे के पुनरावृत्ति की अनुमति देने के लिए इसे गुर्दे के पेडिकल से हटा दें।
नोट: गहरे बैंगनी से लाल-गुलाबी (चित्रा 1 सी) तक गुर्दे के रंग में बदलाव के दृश्य द्वारा रिपरफ्यूजन की पुष्टि की जाती है। - वृक्क पेडिकल के क्लैंपिंग के बिना शम जानवरों के लिए ऊपर वर्णित समान प्रक्रियाएं करें।
- गुर्दे का रंग परिवर्तन के सत्यापन के बाद, गुर्दे को उदर गुहा में वापस कर दें। क्रूसिएट पैटर्न का उपयोग करके अवशोषित सिवनी 5-0 के साथ पेट की मांसपेशियों को बंद करें।
नोट: मांसपेशियों और त्वचा के टांके लगाने के दौरान एनाल्जेसिया को बनाए रखने के लिए एनेस्थेटिक्स के दूसरे इंजेक्शन की आवश्यकता हो सकती है। प्रारंभिक खुराक का आधा हिस्सा सर्जरी के समापन तक एनाल्जेसिया प्रदान करने में प्रभावी साबित हुआ है। - एक क्षैतिज गद्दे पैटर्न का उपयोग कर अवशोषक सिवनी 5-0 के साथ त्वचा को बंद करें। कपास झाड़ू का उपयोग करके पोविडोन आयोडीन समाधान के साथ घाव को साफ करें।
3. रिकवरी और सर्जरी के बाद
नोट: चूंकि पोस्ट-सर्जिकल समय वास्तविक पुनरावृत्ति समय है, इसलिए उचित पोस्ट-सर्जिकल देखभाल नैतिक रूप से अनिवार्य और वैज्ञानिक रूप से प्रासंगिक है। शोधकर्ता द्वारा आवश्यकतानुसार रिपरफ्यूजन समय का चयन किया जा सकता है। गुर्दे आईआरआई द्वारा प्रेरित रोग संबंधी परिवर्तनों का अनुक्रमिक अवलोकन प्राप्त करने के लिए 4 घंटे, 8 घंटे, 16 घंटे, 1 दिन, 2 दिन, 4 दिन और 7 दिनों के पुनरावृत्ति समय की तुलना की जाती है।
- माउस को हीटिंग पैड पर रखें जब तक कि यह संज्ञाहरण से ठीक होना शुरू न हो जाए।
नोट: माउस अपने पैरों को हिलाना शुरू कर देता है और चारों ओर स्थानांतरित करने का प्रयास करता है जब तक प्रतीक्षा करने की सिफारिश की जाती है। ऐसे मामलों में जब सर्जरी के दौरान अतिरिक्त संवेदनाहारी इंजेक्शन की आवश्यकता होती है, तो वसूली का समय लंबा होता है। एटिपामेज़ोल, एक अल्फा -2 रिसेप्टर विरोधी, ज़ाइलाज़िन प्रभावों को उलटने और वसूली चरण को छोटा करने के लिए शरीर के वजन के 0.5 मिलीग्राम / किग्रा की खुराक पर प्रशासित किया जा सकता है। दर्द प्रबंधन के लिए, ब्यूप्रेनोर्फिन (शरीर के वजन का 0.1 मिलीग्राम / किग्रा, इंट्रापेरिटोनियल रूप से) को वसूली और पोस्ट-सर्जिकल चरण के दौरान पूर्व-ऑपरेटिव और हर 6 घंटे में प्रशासित किया जाता है। गैर-स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं के उपयोग को हतोत्साहित किया जाता है क्योंकि इस परिवार में कई दवाएं नेफ्रोटॉक्सिसिटी को प्रेरित करती हैं और इसलिए, परिणामों को बदल सकती हैं। - संज्ञाहरण से वसूली के बाद, पानी और भोजन के लिए मुफ्त पहुँच के साथ माउस वापस अपने पिंजरे में जगह है।
नोट: मैश किया हुआ भोजन पेट्री डिश के साथ-साथ छिपाने और खेलने के लिए सामग्री (जैसे, पेपर शीट, पेपर तौलिया ट्यूब) में प्रदान किया जा सकता है। - घाव भरने, भोजन और पानी का सेवन, शरीर के वजन और व्यवहार का आकलन करने के लिए माउस दैनिक मॉनिटर करें।
नोट: घाव भरने की स्थिति का मूल्यांकन निम्नलिखित पैमाने का उपयोग करके किया गया था: 1, सूखा; 2, गीला; 3, आंशिक रूप से खोला गया; 4, खोला गया। इस अध्ययन में तेजी से घाव भरने का दस्तावेजीकरण किया गया था, जिसमें 2 दिन के बाद 90% से अधिक सूखे घाव थे।
4. इच्छामृत्यु और नमूना संग्रह
- सोडियम पेंटोबार्बिटल के साथ चूहों को एक खुराक पर इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित किया जाता है जो चूहों के लिए संवेदनाहारी खुराक (100 मिलीग्राम /
- आवश्यकतानुसार द्रव और ऊतक के नमूने एकत्र करें।
नोट: दोनों गुर्दे, पूरे रक्त (रक्त कोशिका गिनती के लिए), सीरम (रक्त जैव रसायन के लिए), मूत्र, हृदय और फेफड़े एकत्र किए गए थे। रक्त जैव रसायन विश्लेषण (रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन), क्रिएटिनिन, इलेक्ट्रोलाइट्स) के लिए सीरम के कुछ माइक्रोलीटर की आवश्यकता होती है। यदि आवश्यक हो, इच्छामृत्यु से 24 घंटे पहले, चूहों को उच्च मूत्र मात्रा एकत्र करने के लिए चयापचय पिंजरों में रखा जा सकता है जो गुर्दे के कार्य मापदंडों के निर्धारण की अनुमति देता है।
Representative Results
शारीरिक मापदंडों
चूहों इस एकतरफा गुर्दे आईआरआई सर्जरी से बरामद; सक्रिय और सतर्क दिखाई दिया; और अगले दिन तक सामान्य खाने, पीने और व्यवहार दिखाया। कुछ चूहों में आईआरआई शरीर के वजन में कमी हो सकती है, हालांकि यह आमतौर पर प्रारंभिक शरीर के वजन (चित्रा 2) के 10% से कम है। अधिक से अधिक शरीर के वजन में कमी (10%) हानिकारक हो सकती है, और उन जानवरों को अध्ययन से हटा दिया जाना चाहिए। शाम-संचालित चूहों ने सर्जरी के बाद शरीर के वजन में बदलाव नहीं दिखाया (सर्जरी के बाद 24 घंटे मापा गया)। अधिकांश चूहों ने सर्जरी के बाद 4 और 7 दिनों के बीच अपने प्रारंभिक शरीर के वजन को पुनर्प्राप्त किया (आईआरआई 7-दिवसीय समूह, चित्रा 2 देखें)। गुर्दे के कार्य का मूल्यांकन पारंपरिक मार्करों जैसे रक्त यूरिया नाइट्रोजन (बीयूएन) और क्रिएटिनिन का उपयोग करके किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, सीरम (सोडियम, पोटेशियम और क्लोराइड) में इलेक्ट्रोलाइट का स्तर और एक स्वचालित अंतर रक्त गणना विश्लेषण में शामिल थे।
हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तन
हिस्टोपैथोलॉजिकल निष्कर्षों का आकलन हेमटॉक्सिलिन / ईओसिन (एचई), आवधिक एसिड शिफ और मैसन के ट्राइक्रोम दाग के साथ दाग वाले गुर्दे के 4% पैराफॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड पूरे मध्य-धनु वर्गों का उपयोग करके किया गया था। इस एकतरफा गुर्दे आईआरआई मॉडल द्वारा उत्पादित सबसे स्पष्ट परिवर्तन कॉर्टिको-मेडुलरी जंक्शन पर देखा जा सकता है, विशेष रूप से समीपस्थ नलिकाओं में, हेनले के लूप के मोटे आरोही अंगों और डिस्टल जटिल नलिकाओं के साथ-साथ ट्यूबलर इंटरस्टिटियम में ( चित्रा 3 के लिए किंवदंती देखें)। गुर्दे में आईआरआई के बाद सबसे विशिष्ट घावों को दिखाने वाली सूक्ष्म छवियों को चित्रा 3 में देखा जा सकता है। अनुक्रमिक हिस्टोपैथोलॉजिकल निष्कर्षों की एक सूची तालिका 1 में प्रदान की गई है।
समय के साथ क्षति को वर्गीकृत करने के लिए एक ट्यूबलर चोट स्कोरिंग प्रणाली विकसित की गई थी (चित्रा 4)। इसमें, तीन अलग-अलग मूल्यांकनकर्ताओं द्वारा पांच परिभाषित परिवर्तनों का मूल्यांकन किया गया था: 1) ट्यूबलर उपकला क्षीणन; 2) ब्रश सीमा हानि; 3) ट्यूबलर नेक्रोसिस; 4) ल्यूमिनल रुकावट; और 5) प्रोटीनयुक्त कास्ट की उपस्थिति। "1" का एक असाइनमेंट इंगित करता है कि परिवर्तन मौजूद है, "0" कि यह अनुपस्थित है।
चित्रा 1: माउस में प्रायोगिक गुर्दे आईआरआई मॉडल ( ए) प्रयोगों और हस्तक्षेपों के चरण (संज्ञाहरण प्रेरण, इस्किमिया, और पुनरावृत्ति) दिखाए जाते हैं। कृपया इस्किमिया (बी) के दौरान दाहिने गुर्दे के रंग में गहरे लाल रंग से रिपरफ्यूजन (सी) के दौरान गुलाबी रंग में परिवर्तन पर ध्यान दें। (डी) सर्जरी के 24 घंटे बाद एक ही जानवर के कॉन्ट्रालेटरल गैर-आईआरआई गुर्दे की तुलना में आईआरआई दाहिने गुर्दे (लाल तीर) की मैक्रोस्कोपिक उपस्थिति। (बी) में लाल तीर हेमोस्टैटिक क्लैंप की स्थिति को दर्शाता है। संक्षिप्त नाम: आईआरआई = इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: गुर्दे आईआरआई से पहले और बाद में चूहों के शरीर का वजन। व्यक्तिगत डेटा दिखाया जाता है। संक्षिप्त नाम: आईआरआई = इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट; एच = घंटे; डी = दिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रांतस्था और आईआर संचालित चूहों के कोर्टिको-मेडुलरी जंक्शन में देखे गए विशिष्ट सूक्ष्म घाव। शाम और अलग-अलग रिपरफ्यूजन समय दिखाए गए हैं (प्रत्येक चित्र के ऊपर इंगित किया गया है)। (ए) बरकरार संरचनाओं को शम (आवर्धन 40x; स्केल बार = 20 μm) में दिखाया गया है। आईआरआई 4 एच में तीर ट्यूबलर लुमेन (आवर्धन 40x; स्केल बार = 20 μm) में प्रोटीनयुक्त कास्ट की उपस्थिति का संकेत देते हैं। आईआरआई 8 एच में तीर ट्यूबलर फैलाव दिखाते हैं (आवर्धन 40x; स्केल बार = 50 μm)। आईआरआई 16 एच में काला तीर मेडुलरी सेगमेंट में ट्यूबलर कास्ट दिखाता है; सफेद तीर सेलुलर नेक्रोसिस (आवर्धन 40x; स्केल बार = 50 μm) के क्षेत्रों को दिखाते हैं। आईआरआई 1 डी में काले तीर ट्यूबलर फैलाव (आवर्धन 10x; स्केल बार = 100 μm) का संकेत देते हैं। आईआरआई 2 डी में काला तीर बढ़े हुए सेल नाभिक दिखाता है; सफेद तीर लिम्फोसाइट और मैक्रोफेज घुसपैठ (आवर्धन 40x; स्केल बार = 50 μm) के क्षेत्रों को दिखाते हैं। आईआरआई 4 डी में सफेद तीर माइटोटिक ट्यूबलर कोशिकाओं (आवर्धन 40x; स्केल बार = 50 μm) को इंगित करते हैं। आईआरआई 7 डी में काला तीर फोकल फाइब्रोसिस के क्षेत्र को दर्शाता है; सफेद तीर पुनर्जनन का एक क्षेत्र दिखाता है (आवर्धन 20x; स्केल बार = 100 μm)। (बी) पीएएस धुंधला प्रारंभिक पुनरावृत्ति (4 घंटे, 8 घंटे, और 16 घंटे) के दौरान चूहों के गुर्दे प्रांतस्था दिखा रहा है। ब्रश सीमा (तीर) के प्रगतिशील क्षीणन पर ध्यान दें। आवर्धन 40x; स्केल बार = 50 μm (सी) शम और आईआरआई 7 डी चूहों के मैसन ट्राइक्रोम धुंधला अंतरालीय फाइब्रोसिस (सफेद तीर) के क्षेत्रों को दर्शाता है। आवर्धन 40x; स्केल बार = 50 μm। संक्षिप्त नाम: आईआरआई = इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट; ग्लो = ग्लोमेरुलस; पीसीटी = समीपस्थ जटिल नलिका; डीसीटी = डिस्टल जटिल नलिका; सीडी = वाहिनी एकत्र करना; पीएएस = आवधिक एसिड शिफ; डी = दिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: शम- और आईआरआई संचालित चूहों के ट्यूबलर चोट स्कोर। ट्यूबलर उपकला क्षीणन के लिए स्कोरिंग सिस्टम स्केल 1 से 5; ब्रश सीमा हानि; ट्यूबलर नेक्रोसिस; ल्यूमिनल रुकावट; और प्रोटीनयुक्त कास्ट की उपस्थिति। "1" का एक असाइनमेंट इंगित करता है कि परिवर्तन मौजूद है, "0" कि यह अनुपस्थित है। व्यक्तिगत मूल्य दिखाए जाते हैं। सलाखों एसडी (एन = 4) ± मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षिप्त नाम: आईआरआई = इस्किमिया-रिपरफ्यूजन चोट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| आईआरआई के बाद का समय | सबसे महत्वपूर्ण रोग संबंधी परिवर्तन |
| 4 घंटे | ट्यूबलर रुकावट |
| लुमेन में डाला गया प्रोटीन | |
| 8 घंटे | ट्यूबलर फैलाव |
| प्रारंभिक परिगलन | |
| उपकला का क्षीणन | |
| 16 घंटे | सेलुलर परिगलन |
| ट्यूबलर कास्ट | |
| न्यूट्रोफिल घुसपैठ | |
| 1 दिन | परिगलन |
| ट्यूबलर फैलाव | |
| न्यूट्रोफिल घुसपैठ | |
| 2 दिन | ट्यूबलर फैलाव |
| लिम्फोसाइट और मैक्रोफेज घुसपैठ | |
| बढ़े हुए सेल नाभिक | |
| 4 दिन | नलिका कोशिकाओं में प्रमुख माइटोटिक गतिविधि |
| 7 दिन | फोकल फाइब्रोसिस |
| उत्थान के क्षेत्र |
तालिका 1: समय के साथ सबसे महत्वपूर्ण रोग संबंधी परिवर्तन। प्रति समूह 4-6 जानवरों की सूक्ष्म परीक्षा के आधार पर निदान किया गया।
Discussion
माउस गुर्दे आईआरआई मॉडल उनकी अपेक्षाकृत कम परिचालन लागत और विविध ट्रांसजेनिक मॉडल की उपलब्धता के कारण जैव चिकित्सा अनुसंधान में लोकप्रिय हैं12. यहां प्रस्तुत एकतरफा गुर्दे आईआरआई मॉडल मानव गुर्दे आईआरआई में देखे गए विशिष्ट रोग संबंधी परिवर्तनों की नकल करता है जैसे ट्यूबलर फैलाव, परिगलन और फाइब्रोसिस13. ये परिणाम अलग-अलग पुनरावृत्ति समय पर आधारित हैं।
इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में निरंतर शरीर के तापमान का रखरखाव और गुर्दे के पेडिकल में संवहनी क्लैंप का सही प्लेसमेंट शामिल है। शरीर का तापमान जानवर के चयापचय को प्रभावित करता है14, शारीरिक और सेलुलर दोनों स्तरों पर प्रयोगात्मकपरिणामों को बदलना 15. इस मॉडल में, गुदा और पैड सेंसर जांच का उपयोग करके सर्जरी से पहले शरीर के तापमान को स्थिर किया गया था। इसके अलावा, पूरी सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान शरीर के तापमान की निरंतर निगरानी की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, खासकर इस्किमिया को प्रेरित करने के लिए संवहनी क्लैंप रखने से पहले।
गुर्दे का जोखिम और संवहनी क्लैंप का उचित स्थान भी प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। सर्जिकल चीरा के माध्यम से गुर्दे के संपर्क के दौरान संदंश के अनुचित हैंडलिंग द्वारा गुर्दे कैप्सूल को नुकसान पेरिरेनल रक्तस्राव और सूजन में परिणाम होगा। संवहनी क्लैंप मूत्रवाहिनी और सुपररेनल धमनियों को प्रभावित किए बिना गुर्दे की धमनी और गुर्दे की नस को रोकने वाले गुर्दे के पेडिकल पर रखा जाना चाहिए। इस कदम के लिए महत्वपूर्ण गुर्दे हिलम14,16 के आसपास वसा ऊतक का सावधानीपूर्वक विच्छेदन है।
यह मॉडल लागत और समय प्रभावी है। प्रति माउस संवेदनाहारी खपत 156.47 ± 37.88 μL (एसडी, एन = 17 ± मतलब) एक पूर्वनिर्धारित केटामाइन / ज़ाइलाज़िन कॉकटेल (1: 10 केटामाइन, 1: 50 ज़ाइलाज़िन, खारा में; स्टॉक समाधान एकाग्रता, 100 मिलीग्राम / एमएल दोनों) थी। सर्जरी अपेक्षाकृत कम अवधि में की जा सकती है। माउस प्रति कुल सर्जरी का समय 53 ± 5.23 मिनट था (एसडी, एन = 17 ± मतलब)। प्रशिक्षित कर्मियों के साथ, एक ही समय में कई सर्जरी की जा सकती हैं। हमारे समूह में, एक अनुभवी शोधकर्ता ने गुर्दे के पेडिकल से क्लैंप जारी होने तक सर्जरी की, जबकि एक दूसरे ने माउस की वसूली तक घाव बंद होने से पदभार संभाला। इस दृष्टिकोण के साथ, हम एक ही दिन में उच्च संख्या में सर्जरी करने में सक्षम थे। इस मॉडल में, हमने डोरसोलेटरल दृष्टिकोण का उपयोग किया, जिसके परिणामस्वरूप मिडलाइन दृष्टिकोण16 की तुलना में पेट की गुहा से कम आघात और कम तरल पदार्थ और गर्मी का नुकसान होता है।
पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल चूहों17,18,19 में तीव्र गुर्दे की चोट को प्रेरित करने के लिए गुर्दे पेडिकल क्लैंपिंग तकनीक का वर्णन किया है। हालांकि, उन अध्ययनों में, एकतरफा आईआरआई के अलावा 15 से 26 मिनट तक के इस्केमिक समय के साथ एक कॉन्ट्रालेटरल नेफ्रेक्टॉमी का प्रदर्शन किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, हमने कॉन्ट्रालेटरल किडनी को संरक्षित करते हुए 30 मिनट के लिए एकतरफा इस्किमिया को प्रेरित किया। इसके परिणामस्वरूप 100% की जीवित रहने की दर थी। हालांकि, यह मॉडल आंशिक रूप से गैर-शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप वाले कॉन्ट्रालेटरल किडनी द्वारा लगाए गए प्रतिपूरक प्रभाव के कारण एज़ोटेमिक गुर्दे की क्षति को प्रेरित करने के लिए उपयुक्त नहीं है। हालांकि, एक ही जानवर में एक गुर्दे को अप्रभावित रखने से उच्च जीवित रहने की दर के साथ लंबे समय तक इस्किमिया समय का उपयोग करने का लाभ मिलता है। इसके अलावा, कॉन्ट्रालेटरल किडनी का उपयोग प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान लागू परीक्षण दवाओं या उपचारों के संभावित दुष्प्रभावों का आकलन करने और गुर्दे-गुर्दे के क्रॉसस्टॉक प्रभाव20,21 का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह मॉडल आईआरआई और कॉन्ट्रालेटरल, गैर-शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप गुर्दे 11 दोनों में सेलुलर स्तर पर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों-प्रेरितपरिवर्तनों को दिखाने में उपयोगी रहा है।
इस मॉडल में एकतरफा गुर्दे की क्षति, गुर्दे के क्रॉसस्टॉक प्रभाव, पोस्ट-गुर्दे आईआरआई-प्रेरित हेमोडायनामिक परिवर्तनों और गुर्दे आईआरआई में उपयोग किए जाने वाले दवा उम्मीदवारों के संभावित नेफ्रोटॉक्सिक प्रभावों के मार्करों की पहचान करने और चिह्नित करने के उद्देश्य से अध्ययन में एक संभावित अनुप्रयोग है। मुख्य रोग संबंधी परिवर्तनों का यह विस्तृत विवरण विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त समय का चयन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य करता है, सूजन और परिगलन (4 घंटे से 2 दिन) से पुनर्जनन (4 दिन) और फाइब्रोसिस (7 दिन और बाद में)।
Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि इस लेख के बारे में हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस लेख में दिखाए गए काम का एक हिस्सा रॉस यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ वेटरनरी मेडिसिन (आरयूएसवीएम), सेंट किट्स एंड नेविस के सेंटर ऑफ इंटीग्रेटिव स्तनधारी रिसर्च द्वारा स्थापित किया गया था। लॉन्ग आइलैंड यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ वेटरनरी मेडिसिन के पशु चिकित्सा जैव चिकित्सा विज्ञान विभाग द्वारा प्रदान की गई वित्तीय सहायता की बहुत सराहना की जाती है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole hydrochloride | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | PVS8700 | 5 mg/mL |
| Buprenorphine | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | PRMBURPEN22 | 0.3 mg/mL |
| Commercial euthanasia solution | various suppliers | na | e.g., Euthasol Virbac (sodium pentobarbital 390 mg/mL + sodium phenytoin 50 mg/mL) |
| Eye ointment Puralube | Dechra Veterinary Products, KS, USA | na | 3.5 g (1/8 oz) |
| Heating pad RightTempJr | Kent Scientific, CT, USA | RT-JR-20 | Consider the one with two temperature probes |
| Ketamine hydrochloride | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | VED1220 | 100 mg/ml |
| S&T Vascular clamp | Fine Science Tools, Inc., Germany | 00398-02 | Jaw dimensions: 5.5 x 1.5 mm; length: 11 mm |
| Sterile Disposable Towel Drapes | Kent Scientific, CT, USA | SURGI-5023-3 | Disposable, individualy packed |
| Surgical instruments (Graefe forceps, Halsted-Mosquito hemostat, scissors, etc) | Fine Science Tools, Inc., Germany | Various | Consider the extra fine straight scissor and the angled Graefe forceps |
| Vicryl suture | Ethicon US, LLC | J493G | Size 5-0 |
| Xylazine hydrochloride | Penn Veterinary Supply, Inc., PA, USA | VAM4821 | 100 mg/mL |
References
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