Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי

Published: October 29, 2021 doi: 10.3791/62753
Automatic Translation
*1, *1,2, *1,3, 1,4,5
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה ופשוטה לייצור ליסאט חיידקי לביטוי גנים ללא תאים, באמצעות זן מהונדס של Escherichia coli ודורש ציוד מעבדה סטנדרטי בלבד.

Abstract

ביטוי גנים ללא תאים מציע את כוחה של הביולוגיה ללא סיבוכים של אורגניזם חי. למרות שקיימות מערכות ביטוי גנים רבות כאלה, רובן יקרות למדי לקנייה ו/או לדרוש ציוד מיוחד ומומחיות מושחזת דק כדי לייצר ביעילות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור ליסאט נטול תאים חיידקי התומך ברמות גבוהות של ביטוי גנים, תוך שימוש בציוד מעבדה סטנדרטי בלבד ודורש עיבוד מינימלי. השיטה משתמשת בזן קולי Escherichia המייצר אנדוליסין שאינו משפיע על הצמיחה, אך מייצר ביעילות גלולה של תאים שנקטפו לאחר מחזור פשוט של הפשרת הקפאה. העיבוד הנוסף היחיד הנדרש הוא דגירה קצרה ואחריה צנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת הסלולר. מעגלי גנים דינמיים יכולים להיות מושגים באמצעות ביטוי הטרולוגי של פרוטאז ClpX בתאים לפני הקציר. זן E. coli חסר הגן lacZ יכול לשמש עבור רגישות גבוהה, יישומי biosensing ללא תאים באמצעות קריאה צבעונית או פלואורסצנטית. הפרוטוקול כולו דורש מעט כמו 8-9 שעות, עם רק 1-2 שעות של עבודה מעשית מחיסון להשלמה. על ידי הפחתת העלות והזמן כדי לקבל lysate ללא תאים, שיטה זו צריכה להגדיל את המחיר הזול של ביטוי גנים ללא תאים עבור יישומים שונים.

Introduction

ביטוי גנים בליסאטים ללא תאים יש מספר יתרונות על פני שימוש בתאים חיים1,2,3,4. ליסאטים ניתן לשנות בקלות ביוכימית ולהשתמש בתנאים שיכולים להיות מזיקים או בלתי אפשרי להשיג בתאים חיים. מעגלי ביטוי גנים אינם צריכים להתמודד או להתחרות בתהליכים ביולוגיים מארחים, ובדיקת מעגלים גנטיים חדשים היא פשוטה כמו הוספת DNA. מסיבות אלה, ביטוי גנים ללא תאים מצא יישומים שונים, מ biosensors5,6 כדי במהירות טיפוס מעגלי גנים סינתטיים7,8 לפתח תאים מלאכותיים9. רוב ביטוי הגנים ללא תאים משתמש lysates הסלולר כי כבר מעובד מאוד, בדרך כלל דורש פרוטוקולים ארוכים ומורכבים, ציוד מיוחד, ו / או צעדים רגישים שיכולים להוביל וריאציה משמעותית בין משתמשים אצוות10,11.

מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לייצור ליסאט ללא תאים הדורש עיבוד ומומחיות מינימליים (איור 1A)12. השיטה מסתמכת על תאי E. coli כי הם מהונדסים lyse לאחר מחזור פשוט להפשיר הקפאה. התאים מבטאים אנדוליסין מפג' למדה שמשפיל את דופן התא. ככל שהתאים גדלים, אנדוליסין זה נשאר בציטופלסמה, מופרד מקיר התא. עם זאת, מחזור פשוט להפשרת הקפאה משבש את הממברנה הציטופלסמית, משחרר את האנדוליזין לתוך הפריפלסמה, שם הוא משפיל את דופן התא, וכתוצאה מכך תמוגה מהירה של התא. הפרוטוקול יכול להסתיים עם רק כמה שעות של עבודה מעשית ודורש רק מקפיא, צנטריפוגה המסוגלת 30,000 × גרם (לקבלת תוצאות אופטימליות; מהירויות נמוכות יותר ניתן להשתמש בזהירות רבה יותר לא להפריע לכדור), מערבל מערבולת, ופתרון חיץ פשוט. ליסאט פונקציונלי יכול אפילו להיות מיוצר על ידי ייבוש קפוא של התאים rehydrating אותם במקום. עם זאת, שיטה זו מייצרת lysates עם פעילות נמוכה יותר, ככל הנראה בשל פסולת התא הנותרת.

lysates פעילים מאוד עבור ביטוי גנים ללא תאים, והם יכולים להיות משופרים בדרכים שונות בהתאם לשימוש הסופי. ניתן להגדיל עוד יותר את קצב סינתזת החלבון על ידי ריכוז ה- lysate באמצעות רכזי ספין סטנדרטיים. ניתן להגן על דנ"א ליניארי מפני השפלה על ידי הוספת חלבון GamS מטוהר. השפלת חלבונים, הכרחית לדינמיקת מעגלים מורכבת יותר כגון תנודה, ניתן להשיג על ידי הבעת הקסאמר ClpX בזן13המייצר באופן אוטומטי . לבסוף, קריאות חזותיות מבוססות LacZ מופעלות באמצעות זן autolysate חסר lacZ. בסך הכל, שיטה זו מייצרת ליסאט פעיל מאוד ללא תאים המתאים למגוון רחב של יישומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכן מדיה ומאגרים.

  1. הכן 2xYTPG בינוני.
    1. יש לערבב 62 גרם אבקת 2xYT, 5.99 גרם אשלגן פוספט מונובאזי, 13.93 גרם אשלגן פוספט דיבסי ומים דה-יוניים ל-2 ליטר.
    2. Autoclave על מחזור נוזלי עם זמן חשיפה של 30 דקות14.
    3. ל-400 מ"ל של מדיה של 2xYTP מ-1.1.2, הוסיפו 7.2 גרם D-גלוקוז (דקסטרוז) וערבבו עד להמסה.
    4. עיקור מסנן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
  2. הכן מאגר S30A.
    1. ערבבו את Tris-HCl (pH 7.7, 50 מ"מ בריכוז סופי), אשלגן גלוטמט (60 מ"מ סופי) ומגנזיום גלוטמט (14 מ"ר סופי).
    2. כוונן את ה- pH ל- 7.7 באמצעות 10 M KOH.
  3. הכנת פתרון 1 (ראה טבלה 1).
    1. Resuspend 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1- חומצה פיפרזינתאנסולפונית (HEPES) ב 2 מ"ל של מים.
    2. כוונן את ה- pH ל- 8.0 באמצעות KOH.
    3. הוסף את כל הרכיבים האחרים מטבלה 1.
    4. כוונן את ה- pH ל- 7.6 באמצעות 10 M KOH. מסנן לעקר.
  4. הכן פתרון פרמיקס 2.5x (ראה טבלה 2).
    1. ערבבו את כל הרכיבים בטבלה 2.
    2. כוונן את ה- pH ל- 7.5 באמצעות KOH.
    3. עליקוט ולהקפיא ב -80 °C (50 °F).
      הערה: תגובה של 20 μL משתמשת ב- 8.9 μL של premix.

2. הכן תאים.

  1. פס התאים autolysate על לוחות אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם / mL אמפיצלין באמצעות לולאה מחסן לגדול ב 37 °C (ראה הערה 1).
  2. בחר מושבה אחת לתוך תרבות המתנע של מדיום LB / אמפיצלין באמצעות קצה צינור ולגדול ב 37 °C (50 °F) לילה.
  3. לחסן 400 מ"ל של 2xYTPG בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצ'ילין עם 400 μL של תרבות המתנע, ולגדול ב 37 °C (57 °C) בבקבוק 1 L Erlenmeyer, רועד ב 300 סל"ד.
  4. מדי פעם למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD600)באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לקרוא cuvette אופטי עם אורך נתיב 1 ס"מ. כאשר OD600 עולה על 1, להתחיל לדלל את התרבות פי 5 לפני מדידות כדי להבטיח כי המדידות יישארו בטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר מעבדה טיפוסי. המשך לגדל את התאים עד שתרבית הדילול פי 5 תגיע ל- OD600 של 0.3 (המקבילה לתרבות OD600 של 1.5).

3. הכן את הלסייט.

  1. הכן חוצץ S30A בתוספת 2 mM dithiothreitol (DTT). לערבב 3 מ"ל של חוצץ S30A עם 6 μL של פתרון מלאי DTT ב 1 M. מקום על קרח לשימוש בשלב 3.7.
  2. לקצור את התאים על ידי centrifuging ב 1800 × גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. להשליך את supernatant על ידי שפיכת אותו ושימוש בצינור כדי להסיר כל נוזל שנותר.
  4. resuspend הכדור ב 45 מ"ל של חיץ S30A קר (4-10 °C) באמצעות מערבל מערבולת.
  5. שקול צינור צנטריפוגה ריק 50 מ"ל, להעביר את התאים לתוכו, ולחזור על שלבים 3.2-3.3 לשטוף את התאים.
  6. שקול את הכדור, מפחית את המשקל של צינור ריק 50 מ"ל. הקפד לשאוף בזהירות כל supernatant שנותר כדי להבטיח מדידה מדויקת של משקל גלולה.
    הערה: תשואה טיפוסית היא ~ 1.3 גרם של גלולה תא מ 400 מ"ל של תרבות הייצור.
  7. הוסף 2 כרכים של חיץ S30A קר בתוספת 2 mM dithiothreitol, כלומר, 2 מ"ל של חוצץ עבור כל 1 גרם של גלולה התא, ו resuspend התאים על ידי ערבוב מערבולת נמרצת.
  8. תקפיא את התאים. מניחים את צינור 50 מ"ל המכיל את התאים במקפיא -20 °C (50 °F) או -80 °C (50 °F) עד שהכדור קפוא לחלוטין.
    הערה: שלב ההקפאה הוא נקודת עצירה טובה להיום.
  9. להפשיר את התאים באמבט מים בטמפרטורת החדר.
  10. מערבולת במרץ במשך 2-3 דקות.
  11. דגירה ב 37 °C (45 °F) במשך 45 דקות עם רועד ב 300 סל"ד.
  12. נקה את הדגימה של פסולת תאית כבדה על ידי צנטריפוגה בצינורות צנטריפוגות שקופים ב 30,000 × גרם במשך 45 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: אם צנטריפוגה המסוגלת 30,000 x g אינו זמין, צנטריפוגה במשך 45 דקות ב 21,000 × גרם, ולנקוט זהירות נוספת בשלב 3.13, כמו הכדור יהיה פחות קומפקטי.
  13. בזהירות להעביר את supernatant לצינור חדש עם צינור, הימנעות הפרעה הכדור ככל האפשר. אם supernatant מועבר מזוהם עם חומר מן הכדור, לחזור על השלב הקודם.
  14. העבר את supernatant ל 1.5 מ"ל צנטריפוגות צנטריפוגות צנטריפוגה פעם נוספת ב 21,000 × גרם (או המהירות המרבית של צנטריפוגה שולחן) במשך 5 דקות.
  15. Aliquot autolysate פינה לתוך הכרכים הרצויים, בזהירות הימנעות כל גלולה שנותרה, להקפיא ב -80 °C (80 °F) או להשתמש מיד.
    הערה: תגובה אחת של 20 μL משתמשת ב- 8 μL של autolysate.

4. ביטוי גנים ללא תאים

הערה: ה- Autolysate מוכן כעת לכל שימוש קצה רצוי. להלן פרוטוקול סטנדרטי לדוגמה לביטוי גנים ללא תאים.

  1. לתגובה של 20 μL, לערבב על קרח 8 μL של autolysate ו 8.9 μL של premix. ראה הערה בסוף סעיף הפרוטוקול לגבי אופטימיזציה של מגנזיום גלוטמט וריכוזים PEG 8000.
  2. הוסף DNA (למשל, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 לריכוז סופי של 8 ננומטרים), כל ריאגנטים אחרים, ומים ל 20 μL.
  3. מקם את התגובה במיקרו-לוחית בעלת 384 באר ומדוד את מסלול הזמן של הפלואורסצנטיות ו/או נקודות הקצה באמצעות קורא לוחות. עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), השתמש באורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר.

5. שינויים בפרוטוקול

הערה: השינויים הבאים של הפרוטוקול מאפשרים לו לשרת יישומים אחרים.

  1. ביטוי גנים ללא תאים באמצעות תבניות DNA ליניאריות
    1. בצע את השלבים בסעיף 4, שכשהם את התגובה עם 2.2 מיקרומטר חלבון GamS מטוהר (מבוטא ומטוהר כמתואר12) לפני הוספת ה- DNA הליניארי.
  2. ביטוי גנים ללא תאים המשלבים ירידה בחלבון
    1. בשלב 2.1, השתמש בתאים אוטומטיים המכילים את plasmid pACYC-FLAG-dN6-His (ראה טבלת החומרים). בכל מדיה צמיחה, בנוסף כוללים 34 מיקרוגרם / mL כלורמפניקול.
    2. בשלב 2.3, כלול איזופרופיל 40 מיקרומטר β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במדיום הצמיחה כדי לגרום לביטוי מהפלסטיד.
    3. חזור על שלבים 3.2-3.4 (כביסה) פעמיים נוספות (בסך הכל שלוש שטיפות) כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורמפניקול, שהוא מעכב תרגום. עבור שתי הכביסות הראשונות (שלב 3.4), החליפו את חיץ S30A עם תמיסת מלח עם פוספט (pH 7.4).
    4. בשלב 4.2, תוספת עם ATP נוסף של 3 מ"מ (נוסף מפתרון מלאי של 100 מ"מ ATP במים, pH 7.2) ו 4.5 mM מגנזיום גלוטמט (באמצעות פתרון מלאי 1 M במים) (ריכוזים סופיים) כדי לפצות על שימוש ATP גבוה על ידי ClpXP, כמו גם כלציה של מגנזיום על ידי ATP נוסף.
  3. ביטוי גנים ללא תאים באמצעות קריאות מבוססות LacZ (כולל colorimetric)
    1. בשלב 2.1, השתמש בתאים אוטומטיים שאינם מבטאים LacZ באופן מקורי (ראה טבלת החומרים).
  4. לחלופין, להכין את ליסאט ישירות מתאים מיובשים בהקפאה.
    1. בצע את כל השלבים מ- 1.1 עד 3.7.
    2. לערבב 8 μL של השעיית תא עם 8.9 μL של premix.
    3. הוסף DNA plasmid (אם תרצה), ריאגנטים מותאמים אישית אחרים, ומים כדי להגיע לנפח סופי של 20 μL.
    4. מעבירים את התגובה למיקרו-לוחית 384-באר ומייבשים אותה בהקפאה.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות מיובשות בהקפאה עד שבוע ואולי אף יותר.
    5. כדי להתחיל את התגובה, rehydrate אותו עם 18 μL של מים deionized בתוספת כל DNA הרצוי או ריאגנטים אחרים.
    6. עקוב אחר הדינמיקה פלואורסצנטית בקורא לוחות.

הערה 1: תאים אוטומטיים מתוכננים להתיז על מחזור הפשרת הקפאה, ולכן חשוב במיוחד להשתמש cryoprotectant בעת ביצוע מלאי קפוא. הקפאנו מניות ב 24% wt / vol גליצרל ואחסנו אותם ב -80 °C (80 °F).

הערה 2: יונים מגנזיום ו PEG 8000 הם קריטיים לביצועי ליסאט. הבסיס 2.5x premix, המבוסס על נתונים שפורסמו בעבר, מכיל 6 mM מגנזיום גלוטמט ו 4.8% wt / vol PEG 8000, אשר הופכים 2.4 mM ו 1.9%, בהתאמה, בתגובה הסופית. Autolysate מוכן עם הפרוטוקול כאן בדרך כלל מבצעים הטובים ביותר עם 5 מ"מ נוספים Mg-גלוטמט ו 1.5% PEG 8000 בתגובה הסופית. עם זאת, ניתן למטב זאת בטווח של גלוטמט Mg נוסף של 0-10 מ"מ ו-0-3% PEG 8000 נוספים (בהשוואה לפני הקדם הבסיסי). כדי להכין את premix עם מומלץ 5 מ"מ נוסף Mg-גלוטמט ו 1.5% PEG 8000 (ריכוזים סופיים), לערבב 380 μL של premix עם 4.75 μL של מגנזיום גלוטמט ב 1 M ו 36.1 μL של PEG 8000 ב 40% משקל / נפח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן לראות תוצאות מייצגות באמצעות autolysate כדי לבטא GFP מתוך פלסמיד מבטא באופן מרכיב, כאן pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, והקלטת קורס זמן של פלואורסצנטיות GFP בקורא לוחות(איור 1B). סדרת דילול של דנ"א פלסמיד מצאה ביטוי חזק אפילו בדנ"א של 1 ננומטר. בהשוואה ליסאט זמין מסחרית, autolysate יכול לייצר תשואה כוללת גדולה יותר והשיג שיעור ייצור מקסימלי גדול יותר, מחושב כנגזרת הזמן של קורס הזמן GFP (איור 1C,D). לקבלת תוצאות נוספות בשיטה זו, ראה דידוביק ואח '12. לפרוטוקול זה יש יחסית מעט נקודות כשל; עם זאת, ניתן להשיג תוצאות תת-אופטימליות אם האוטוליקט אינו נקי מספיק מפסולת תאים. תוצאות אופטימליות יכולות גם לדרוש אופטימיזציה של הריכוזים של PEG-8000 ו- Mg2+ עבור כל אצווה של ליסאט (ראה הערה 2).

Figure 1
איור 1: תוצאות מייצגות. (A)ייצוג חזותי של הפרוטוקול. (B)קורס זמן לדוגמה של ביטוי GFP מ- pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 בהפשרה אוטומטית. ייצור GFP מרבי (C) וקצב ייצור מרבי (D) של autolysate מוכן ב 2 מעבדות שונות על ידי 2 חוקרים שונים, באמצעות 30,000 x g צנטריפוגה (כחול וכתום) או 20,000 x גרם צנטריפוגה (סגול), לעומת ליסאט התייחסות מסחרית (כתום, MYtxtl-70-960M מ MYcroarray). כל קווי השגיאה הם שגיאה מוחלטת ממוצעת של שני עותקים משוכפלים טכניים. נתון זה שונה מ- 12. זכויות יוצרים 2017 האגודה האמריקנית לכימיה. קיצור: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פתרון 1: הוספת מים ל-4 מ"ל בסך הכל
שם משקל (מ"ג)
3-PGA 386.4
ATP 52
מחנה 13.8
קוה 11.2
CTP 28.4
חומצה פולינית 1.9
GTP 47.6
HEPES 667.2
NAD 12.3
זרעון 8.1
tRNAs 11.2
UTP 29.5

טבלה 1: פתרון 1. רכיבים של פתרון 1.

2.5x פרמיקס
מגיב אמצעי אחסון (μL)
תערובת חומצות אמינו המכילה 24 מ"ר כל אחת, למעט לאוצין שהוא ב 20 mM 2500
dithiothreitol (DTT) ב 100 mM 100
מגנזיום גלוטמט ב-1 מ' 25
PEG-8000 ב- 40% wt/vol 500
אשלגן גלוטמט ב 2 M 303
פתרון 1 (ראה טבלה 1) 714.3

טבלה 2: פרמיקס. רכיבים של פתרון premix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מניב ליסאט חיידקי פעיל מאוד לביטוי גנים ללא תאים. המפתח הוא להשתמש בתאים הנושאים את pAD-LyseR, המבטא את הלמבדה פאג' אנדוליסין בציטוזוליה. תאים אלה הם potentiated כדי lyse עצמם על permeabilization של הממברנה הפנימית, המאפשר את הגישה אנדוליסין לקיר התא, אשר השיטה משיגה באמצעות מחזור פשוט להפשיר הקפאה. מכיוון שהתאים למעשה מתמוססים, המוצר מכונה autolysate. לאחר שהתאים נרקמו, השלבים היחידים שנותרו הם דגירה וצנטריפוגה כדי לנקות את האוטוליקט של פסולת תאית.

בהשוואה לשיטות אחרות לייצור ליסאט חיידקי, גישה זו היא פשוטה ומהירה במיוחד, אך היא אינה מקריבה את איכות הלסת. הפרוטוקול יכול להסתיים ב 8-9 שעות לאחר חנק תרבות הייצור, עם רק 1-2 שעות של עבודה מעשית. הציוד המומלץ היחיד שאינו סטנדרטי לחלוטין למעבדות ביולוגיה מולקולרית הוא צנטריפוגה המסוגלת להשיג 30,000 × גרם. עם זאת, ניתן לייצר באופן אוטומטי באיכות דומה גם עם צנטריפוגה במהירות נמוכה יותר (איור 1C, D); המשתמש רק צריך להיות זהיר יותר הסרת lysate מן הכדור, אולי משאיר מאחור קצת יותר נוזל כדי להבטיח דגימות נקיות. פשטות זו אינה רק עניין של נוחות; פרוטוקולים פחות מסובכים נוטים להניב תוצאות רבות יותר לשחזור, עם פחות וריאציה כאשר מבוצעים בידיים שונות. השינוי המוצג בשלב 5.4, שבו תאים מיובשים בהקפאה יחד עם כל ריאגנטים אחרים, מציג פרוטוקול פשוט עוד יותר, אם כי עם תפוקת ייצור חלבון מופחתת. ראוי לציין, בשינוי זה, צעדי צנטריפוגה כדי לנקות את lysate של פסולת הסלולר מדלגים, אשר מפחית עוד יותר את עבודת העיבוד; עם זאת, שאר הפסולת מפחיתה את הביטוי מן lysate12.

בשנים האחרונות פורסמו גישות רבות לייצור ליסאט ללא תאים, סוכם לאחרונה על ידי קול ואח'15. מחקרים אלה בחנו אסטרטגיות שונות עבור סוג התא, תנאי גדילה, מתודולוגיות תמוגה, ולאחר עיבוד. רוב השיטות האחרות עבור תמוגה נדרשו ציוד מיוחד כגון עיתונות צרפתית, homogenizer, מקצף חרוזים, או sonicator. פוג'יווארה ודוי השמטו את הציוד הזה לטובת מחזור הפשרת הקפאה דומה לזה המתואר כאן, אלא שהם הפכו את התאים רגישים לתסיסה על ידי טיפול בהם בליזוזים במקום להביע אנדוליסין16. למרות שזה בערך פרוטוקול פשוט כמו זה המתואר כאן, התאים שטופלו בליזוז חייבים להיות שטופים בעודם במצבם השברירי מבלי לשבש אותם בטרם עת, מה שעלול לדרוש עידון ניסיוני ולהציג מקור של שונות.

בנוסף ליסאט, ביטוי גנים ללא תאים דורש פתרון premix המכיל מקורות אנרגיה, מונומרים RNA וחלבון, ומולקולות קטנות אחרות. מתכון premix תואר ואופטימיזציה בעבר17, עם כמה שינויים. premix בשימוש כאן הכיל כ 4 פעמים ריכוזים גבוהים יותר של חומצות אמינו, כמו גם מגנזיום גלוטמט נוסף ו PEG 8000 המקביל לריכוזים תגובה סופיים של 7.5 mM ו 3.5% משקל / נפח, בהתאמה. תוצאות אופטימליות עשויות לדרוש התאמת ריכוזי המגנזיום המשלים וריכוז PEG 8000 עבור כל אצווה חדשה של ליסאט, אם כי הריכוזים לעיל הניבו תוצאות טובות בעקביות (ראה הערה 2). יישומים ייחודיים עשויים לדרוש תקציר מחדש של ריכוזים אלה, לדוגמה, בעת שימוש בליסייט13בתוספת ClpX .

זן E. coli סטנדרטי לייצור ליסאט ללא תאים הוא BL21-Gold (DE3). נגזרת של תאים אלה המכילים את pAD-LyseR של autolysis הופקדה בזן ומאגר פלסמיד (ראה טבלת החומרים). כמו כן זמינים נגזרת חסר lacZ גנומי כדי להפחית באופן דרמטי את הרקע עבור מעגלים המשתמשים פלט מבוסס LacZ וביטוי plasmid pAD-GamS לשמש לטיהור של חלבון GamS שיכול להגן על DNA ליניארי מפני השפלה. זנים אלה של תאים ו plasmids צריך להיות שימושי עבור מגוון רחב של יישומים בביטוי גנים ללא תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.H. הוא מייסד שותף של GenCirq Inc, המתמקדים טיפולי סרטן. הוא חבר במועצת המנהלים ויש לו הון עצמי ב-GenCirq.

Acknowledgments

המחברים מודים לזאקרי סאן וריצ'רד מוריי (המכון הטכנולוגי של קליפורניה) על שסיפקו בחביבות את הפלסמיד P_araBAD-gamS, ואת Kaeko Kamei (המכון הטכנולוגי של קיוטו) על שסיפקו בחביבות צנטריפוגת קירור במהירות גבוהה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות ומתוכנית ARO MURI ונתמכה בחלקה על ידי היוזמה המובילה לחוקרים צעירים מצוינים, MEXT, יפן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2xYT media EMD Millipore 4.85008 or equivalent
3-PGA Sigma Aldrich P8877 or equivalent
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff Millipore Sigma UFC900308 optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated
ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G or carbenicillin, a more stable variant
ATP Sigma Aldrich A8937 or equivalent
cAMP Sigma Aldrich A9501 or equivalent
CoA Sigma Aldrich C4282 or equivalent
CTP United States Biosciences 14121 or equivalent
D-glucose (dextrose) Fisher Scientific AAA1749603 or equivalent
dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich D0632-1G or equivalent
E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR Addgene 99244
E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR Addgene 99245
Folinic acid Sigma Aldrich F7878 or equivalent
GTP United States Biosciences 16800 or equivalent
HEPES Sigma Aldrich H3375-25G or equivalent
LB media Fisher Scientific DF0446075 or equivalent
magnesium glutamate Sigma Aldrich 49605-250G or equivalent
NAD Sigma Aldrich N6522 or equivalent
potassium glutamate Sigma Aldrich G1501-100G or equivalent
potassium hydroxide (KOH) Sigma Aldrich 221473-25G for adjusting pH
potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-500 or equivalent
potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-500 or equivalent
Spermidine Sigma Aldrich 85558 or equivalent
Tris-HCl Fisher Scientific 9310500GM or equivalent
tRNA mix Roche 10109541001 or equivalent
UTP United States Biosciences 23160 or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 176
ייצור מהיר, זול ולא מסובך של ליסאט נטול תאים חיידקי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, … More

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate. J. Vis. Exp. (176), e62753, doi:10.3791/62753 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter