Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إنتاج سريع وبأسعار معقولة وغير معقد من ليسات خالية من الخلايا البكتيرية

Published: October 29, 2021 doi: 10.3791/62753
Automatic Translation
*1, *1,2, *1,3, 1,4,5
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لإنتاج اليزحات البكتيرية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، وذلك باستخدام سلالة هندسية من الإشريكية القولونية وتتطلب معدات مختبرية قياسية فقط.

Abstract

التعبير الجيني الخالي من الخلايا يوفر قوة البيولوجيا دون مضاعفات الكائن الحي. على الرغم من وجود العديد من أنظمة التعبير الجيني هذه ، فإن معظمها مكلف للغاية لشراء و / أو تتطلب معدات خاصة وخبرة شحذ بدقة لإنتاج فعال. يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج ليسات خالية من الخلايا البكتيرية تدعم مستويات عالية من التعبير الجيني ، وذلك باستخدام معدات المختبر القياسية فقط وتتطلب الحد الأدنى من المعالجة. تستخدم الطريقة سلالة الإشريكية القولونية التي تنتج الإندوريسين الذي لا يؤثر على النمو ، ولكنه يقوم بكفاءة بفرز بيليه الخلية المحصودة بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. والمعالجة الإضافية الوحيدة المطلوبة هي حضانة قصيرة يتبعها الطرد المركزي لتطهير الخلايا من الحطام الخلوي. يمكن تحقيق الدوائر الجينية الديناميكية من خلال التعبير عن heterologous من protease ClpX في الخلايا قبل الحصاد. يمكن استخدام سلالة الإشريكية القولونية التي تفتقر إلى جين lacZ لتطبيقات الاستشعار الحيوي عالية الحساسية والخالية من الخلايا باستخدام قراءات ملونة أو فلورية. يتطلب البروتوكول بأكمله ما لا يزيد عن 8-9 ساعات ، مع 1-2 ساعة فقط من العمل العملي من التطعيم إلى الانتهاء. ومن خلال خفض التكلفة والوقت للحصول على ليسات خالية من الخلايا، ينبغي أن تزيد هذه الطريقة من القدرة على تحمل تكاليف التعبير الجيني الخالي من الخلايا لمختلف التطبيقات.

Introduction

التعبير الجيني في الخلايا الخالية من الخلايا lysates له العديد من المزايا على استخدام الخلاياالحية1،2،3،4. يمكن تعديل اللسات بسهولة كيميائيا حيوية واستخدامها في ظروف يمكن أن تكون ضارة أو مستحيلة التحقيق في الخلايا الحية. لا يتعين على دوائر التعبير الجيني أن تتنافس أو تتنافس مع العمليات البيولوجية المضيفة، واختبار الدوائر الجينية الجديدة بسيط مثل إضافة الحمض النووي. لهذه الأسباب، وجدت التعبير الجيني الخالي من الخلايا تطبيقات مختلفة، من أجهزة الاستشعارالحيوية 5،6 إلى النماذج الأولية بسرعة دوائر الجينات الاصطناعية7،8 لتطوير الخلايا الاصطناعية9. معظم التعبير الجيني الخالي من الخلايا يستخدم الخلايا الlysates التي تم تجهيزها بشكل كبير، تتطلب عموما بروتوكولات طويلة ومعقدة، والمعدات المتخصصة، و / أو الخطوات الحساسة التي يمكن أن تؤدي إلى اختلاف كبير بين المستخدمين والدفعات10،11.

تصف هذه الورقة طريقة بسيطة وفعالة لإنتاج lysate خالية من الخلايا التي تتطلب الحد الأدنى من المعالجة والخبرة (الشكل 1A)12. تعتمد الطريقة على خلايا الإشريكية القولونية التي تم تصميمها للليس بعد دورة تجميد ذوبان بسيطة. الخلايا تعبر عن انداليسين من لامبدا phage التي تتحلل جدار الخلية. كما تنمو الخلايا, هذا الإندولاسين لا يزال في السيتوبلازم, عزل من جدار الخلية. ومع ذلك ، فإن دورة التجميد والذوبان البسيطة تعطل الغشاء السيتوبلازمي ، وتطلق الإندوريسين في periplasm ، حيث تتحلل جدار الخلية ، مما يؤدي إلى تحلل سريع للخلية. يمكن الانتهاء من البروتوكول مع بضع ساعات فقط من العمل العملي ويتطلب فقط ثلاجة، جهاز طرد مركزي قادر على 30،000 × غرام (للحصول على نتائج مثالية؛ يمكن استخدام سرعات أقل مع مزيد من الرعاية لعدم إزعاج بيليه)، خلاط دوامة، ومحلول عازل بسيط. يمكن حتى أن تنتج lysate وظيفية عن طريق تجميد تجفيف الخلايا وإعادة ترطيب لهم في الموقع. ومع ذلك، تنتج هذه الطريقة lysates مع نشاط أقل، ويفترض أن يرجع ذلك إلى حطام الخلية المتبقية.

الlysates نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا ، ويمكن تعزيزها بطرق مختلفة اعتمادا على الاستخدام النهائي. يمكن زيادة معدل تخليق البروتين عن طريق تركيز اليزيت باستخدام المكثفات الدورانية القياسية. يمكن حماية الحمض النووي الخطي من التدهور عن طريق إضافة بروتين GamS المنقى. يمكن تحقيق تدهور البروتين ، الضروري لديناميكيات الدوائر الأكثر تعقيدا مثل التذبذب ، من خلال التعبير المشترك عن سداسي ClpX في سلالة إنتاج التحلل التلقائي13. وأخيرا، يتم تمكين قراءات البصرية المستندة إلى LacZ باستخدام سلالة autolysate تفتقر إلى lacZ. بشكل عام، ينتج هذا الأسلوب lysate الخالية من الخلايا النشطة للغاية التي تناسب مجموعة واسعة من التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الوسائط والمخازن المؤقتة.

  1. إعداد المتوسطة 2xYTPG.
    1. مزيج 62 غ 2xYT مسحوق، 5.99 غرام فوسفات البوتاسيوم أحادية، 13.93 غرام فوسفات البوتاسيوم ديباسيك، والمياه deionized إلى 2 L.
    2. الأوتوكلاف على دورة السائل مع وقت التعرض من 30 دقيقة14.
    3. إلى 400 مل من وسائط 2xYTP من 1.1.2، أضف 7.2 غرام من الجلوكوز D (دكستروز) واخلط حتى يذوب.
    4. تصفية تعقيم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  2. إعداد المخزن المؤقت S30A.
    1. مزيج تريس-HCl (pH 7.7, 50 mM التركيز النهائي), الغلوتامات البوتاسيوم (60 mM النهائي), وجلوتامات المغنيسيوم (14 mM النهائي).
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.7 باستخدام 10 M KOH.
  3. إعداد الحل 1 (انظر الجدول 1).
    1. ريسوسبند 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1- حمض بيبرازينيثانسولفونيك (HEPES) في 2 مل من الماء.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 باستخدام KOH.
    3. إضافة كافة المكونات الأخرى من الجدول 1.
    4. ضبط درجة الحموضة إلى 7.6 باستخدام 10 M KOH. تصفية التعقيم.
  4. إعداد حل بريميكس 2.5x (انظر الجدول 2).
    1. خلط جميع المكونات في الجدول 2.
    2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام KOH.
    3. Aliquot وتجميد عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يستخدم رد فعل 20 ميكرولتر 8.9 ميكرولتر من بريميكس.

2. إعداد الخلايا.

  1. الصق الخلايا المهدرجة تلقائيا على لوحات أجار LB التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل أمبيسلين باستخدام حلقة تلقيح وتنمو عند 37 درجة مئوية (انظر الملاحظة 1).
  2. اختيار مستعمرة واحدة في ثقافة بداية من LB / ampicillin المتوسطة باستخدام طرف pipet وتنمو في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تلقيح 400 مل من 2xYTPG المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسلين مع 400 ميكرولتر من ثقافة المبتدئين، وتنمو عند 37 درجة مئوية في قارورة 1 L Erlenmeyer، تهتز في 300 دورة في الدقيقة.
  4. قياس الكثافة البصرية للثقافة بشكل دوري عند 600 نانومتر (OD600)باستخدام مطياف لقراءة cuvette بصري بطول مسار 1 سم. عندما يتجاوز OD600 1، ابدأ في تمييع الثقافة 5 أضعاف قبل القياسات لضمان بقاء القياسات ضمن النطاق الخطي لمطياف مختبر نموذجي. مواصلة نمو الخلايا حتى الثقافة المخففة 5 أضعاف تصل إلى OD600 من 0.3 (المقابلة لثقافة OD600 من 1.5).

3. إعداد الياء.

  1. إعداد المخزن المؤقت S30A تكملها مع 2 م dithiothreitol (DTT). مزيج 3 مل من المخزن المؤقت S30A مع 6 ميكرولتر من محلول مخزون DTT في 1 M. مكان على الجليد للاستخدام في الخطوة 3.7.
  2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1800 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تجاهل supernatant عن طريق صب تشغيله واستخدام ماصة لإزالة أي السائل المتبقية.
  4. Resuspend بيليه في 45 مل من البرد (4-10 درجة مئوية) S30A العازلة باستخدام خلاط دوامة.
  5. وزن أنبوب طرد مركزي فارغ 50 مل، ونقل الخلايا إليه، وتكرار الخطوات 3.2-3.3 لغسل الخلايا.
  6. وزن بيليه، طرح وزن أنبوب فارغ 50 مل. تأكد من تنشق بعناية أي supernatant المتبقية لضمان قياس دقيق للوزن بيليه.
    ملاحظة: العائد النموذجي هو ~ 1.3 غرام من بيليه الخلية من 400 مل من ثقافة الإنتاج.
  7. إضافة 2 وحدات التخزين المؤقت S30A الباردة تكملها مع 2 م dithiothreitol، أي 2 مل من العازلة لكل 1 غرام من بيليه الخلية، وإعادة إنفاق الخلايا عن طريق خلط دوامة بقوة.
  8. تجميد الخلايا. ضع أنبوب 50 مل الذي يحتوي على الخلايا في ثلاجة -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى يتم تجميد الكريات تماما.
    ملاحظة: خطوة التجميد نقطة توقف جيدة لهذا اليوم.
  9. إذابة الخلايا في حمام مياه درجة حرارة الغرفة.
  10. دوامة بقوة لمدة 2-3 دقائق.
  11. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز في 300 دورة في الدقيقة.
  12. مسح عينة الحطام الخلوي الثقيل عن طريق الطرد المركزي في أنابيب الطرد المركزي الشفافة عند 30,000 × غرام لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: إذا لم يتوفر جهاز طرد مركزي قادر على 30000 x g، فإن جهاز الطرد المركزي لمدة 45 دقيقة عند 21000 × غرام،واستخدم المزيد من الحذر في الخطوة 3.13، حيث ستكون الكريات أقل إحكاما.
  13. نقل بعناية supernatant إلى أنبوب جديد مع pipet، وتجنب إزعاج بيليه قدر الإمكان. إذا كان المتسخ المنقول ملوثا بمواد من الكريات ، كرر الخطوة السابقة.
  14. نقل الناطور الفائق إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 21000 × غرام (أو السرعة القصوى لأجهزة الطرد المركزي الطاولة) لمدة 5 دقائق.
  15. Aliquot مسح autolysate في وحدات التخزين المطلوبة، وتجنب بعناية أي بيليه المتبقية، وتجميد في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.
    ملاحظة: يستخدم رد فعل واحد 20 ميكرولتر 8 ميكرولتر من التولير التلقائي.

4. التعبير الجيني الخالي من الخلايا

ملاحظة: autolysate الآن جاهزة لأية نهاية الاستخدام المطلوب. فيما يلي مثال بروتوكول قياسي للتعبير الجيني الخالي من الخلايا.

  1. لتفاعل 20 ميكرولتر، اخلط على الجليد 8 ميكرولتر من التوليت التلقائي و8.9 ميكرولتر من بريميكس. انظر ملاحظة في نهاية قسم البروتوكول فيما يتعلق بتحسين الغلوتامات المغنيسيوم وتركيزات PEG 8000.
  2. أضف الحمض النووي (على سبيل المثال، pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 إلى تركيز نهائي قدره 8 nM)، وأية كاشفات أخرى، والماء إلى 20 ميكرولتر.
  3. ضع التفاعل في لوحة صغيرة 384 جيدا ويقيس مسار وقت الفلورسينس و/ أو نقاط النهاية باستخدام قارئ لوحة. بالنسبة للبروتين الفلوري الأخضر (GFP)، استخدم طول موجي مثير قدره 485 نانومتر وطول موجي للانبعاثات قدره 520 نانومتر.

5. تعديلات البروتوكول

ملاحظة: التعديلات التالية من البروتوكول تمكينه من خدمة التطبيقات الأخرى.

  1. التعبير الجيني الخالي من الخلايا باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية
    1. تنفيذ الخطوات في القسم 4، واستكمال رد الفعل مع 2.2 ميكرومتر بروتين GamS المنقى (أعرب وتنقيتها كما هو موضح12)قبل إضافة الحمض النووي الخطي.
  2. التعبير الجيني الخالي من الخلايا الذي يتضمن تدهور البروتين
    1. في الخطوة 2.1، استخدم خلايا التشحيح التلقائي التي تحتوي على pACYC-FLAG-dN6-His (انظر جدول المواد). في جميع وسائل الإعلام النمو، بالإضافة إلى ذلك تشمل 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول.
    2. في الخطوة 2.3، وتشمل 40 ميكرومتر ايزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيارانوسيد (IPTG) في المتوسط النمو للحث على التعبير من البلازميد.
    3. كرر الخطوات 3.2-3.4 (الغسيل) مرتين إضافيتين (لما مجموعه ثلاثة يغسل) لضمان إزالة كاملة من الكلورامفينيكول، وهو مثبط الترجمة. بالنسبة للغسيلين الأولين (الخطوة 3.4)، استبدل المخزن المؤقت S30A بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.4).
    4. في الخطوة 4.2, تكملة مع ATP 3M إضافية (يضاف من محلول الأسهم من ATP 100 mM في الماء, درجة الحموضة 7.2) و 4.5 mM الغلوتامات المغنيسيوم (باستخدام محلول الأسهم 1 M في الماء) (التركيزات النهائية) للتعويض عن استخدام ATP عالية من قبل ClpXP, فضلا عنchelation المغنيسيوم من قبل ATP إضافية.
  3. التعبير الجيني الخالي من الخلايا باستخدام قراءات تستند إلى LacZ (بما في ذلك colorimetric)
    1. في الخطوة 2.1، استخدم خلايا الملبد التلقائي التي لا تعبر عن LacZ (راجع جدول المواد).
  4. بدلا من ذلك، قم بإعداد اللحواف مباشرة من الخلايا المجففة بالتجميد.
    1. تنفيذ كافة الخطوات من 1.1 إلى 3.7.
    2. مزيج 8 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 8.9 ميكرولتر من بريميكس.
    3. إضافة الحمض النووي البلازميد (إذا رغبت في ذلك)، والكواشف المخصصة الأخرى، والماء للوصول إلى حجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    4. نقل رد الفعل إلى لوحة صغيرة 384 جيدا وتجميد الجافة.
      ملاحظة: يمكن تخزين عينات مجففة بالتجميد لمدة تصل إلى أسبوع وربما لفترة أطول.
    5. لبدء رد الفعل، إعادة ترطيبه مع 18 ميكرولتر من الماء deionized تكملها مع أي الحمض النووي المطلوب أو الكواشف الأخرى.
    6. اتبع ديناميات الفلورسينس في قارئ لوحة.

ملاحظة 1: تم تصميم الخلايا التلقائية للليس على دورة تجميد ذوبان الجليد، لذلك من المهم بشكل خاص لاستخدام cryoprotectant عند صنع المخزونات المجمدة. نحن جمدت الأسهم في 24٪ wt/vol glycerol وتخزينها في -80 درجة مئوية.

ملاحظة 2: أيونات المغنيسيوم و PEG 8000 حاسمة لأداء lysate. قاعدة 2.5x بريميكس، استنادا إلى البيانات المنشورة سابقا، يحتوي على 6 مليمتر الغلوتامات المغنيسيوم و 4.8٪ wt/vol PEG 8000، والتي تصبح 2.4 mM و 1.9٪، على التوالي، في رد الفعل النهائي. ال تحليل تلقائي أعدت مع البروتوكول هنا عادة ما يؤدي أفضل مع إضافية 5 مللي متر ملغ الغلوتامات و 1.5٪ PEG 8000 في رد الفعل النهائي. ومع ذلك، يمكن تحسين هذا في نطاق إضافية 0-10 مللي متر ملغ الغلوتامات وإضافية 0-3٪ PEG 8000 (مقارنة مع premix قاعدة). لإعداد بريميكس مع الموصى بها إضافية 5 مللي متر ملغ الغلوتامات و 1.5٪ PEG 8000 (التركيزات النهائية)، مزيج 380 ميكرولتر من بريميكس مع 4.75 ميكرولتر من الغلوتامات المغنيسيوم في 1 M و 36.1 ميكرولتر من PEG 8000 في 40٪ الوزن / الحجم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويمكن ملاحظة النتائج التمثيلية باستخدام autolysate للتعبير عن GFP من البلازميد التعبير التأسيسي، وهنا pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500، وتسجيل مسار زمني من مضان GFP في قارئ لوحة(الشكل 1B). وجدت سلسلة تمييع الحمض النووي البلازميد تعبيرا قويا حتى في الحمض النووي 1 nM. بالمقارنة مع lysate المتاحة تجاريا، يمكن أن تنتج autolysate عائد إجمالي أكبر وحققت معدل إنتاج أكبر الحد الأقصى، محسوبة كمشتق الوقت من الدورة الزمنية GFP(الشكل 1C،D). للحصول على نتائج إضافية باستخدام هذه الطريقة، راجع Didovykوآخرون. يحتوي هذا البروتوكول نقاط فشل قليلة نسبيا; ومع ذلك، يمكن الحصول على نتائج دون المستوى الأمثل إذا لم يتم مسح autolysate بما فيه الكفاية من حطام الخلية. يمكن أن تتطلب النتائج المثلى أيضا تحسين تركيزات PEG-8000 و Mg2+ لكل دفعة من اليزات (انظر الملاحظة 2).

Figure 1
الشكل 1: النتائج التمثيلية. (أ) التمثيل المرئي للبروتوكول. (ب)مثال على ذلك دورة الوقت للتعبير GFP من pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 في إعادة الذوبان التلقائي التجميد. الحد الأقصى لإنتاج GFP(C)والحد الأقصى لمعدل الإنتاج(D)من التوليف الذاتي المعد في مختبرين مختلفين من قبل باحثين مختلفين ، باستخدام جهاز طرد مركزي 30000 × ز (أزرق وبرتقالي) أو جهاز طرد مركزي 20000 × ز (أرجواني) ، مقارنة بالليات المرجعية التجارية (البرتقالي ، MYtxtl-70-960M من MYcroarray). كافة أشرطة الخطأ يعني خطأ مطلق من اثنين من النسخ المتماثلة التقنية. وقد تم تعديل هذا الرقم من 12. حقوق الطبع والنشر 2017 الجمعية الكيميائية الأمريكية. اختصار: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الحل 1: إضافة الماء إلى إجمالي 4 مل
اسم الوزن (ملغ)
3-PGA 386.4
ATP 52
معسكر 13.8
CoA 11.2
CTP 28.4
حمض الفولينيك 1.9
GTP 47.6
هيبس 667.2
NAD 12.3
الحيوانات المنوية 8.1
tRNAs 11.2
UTP 29.5

الجدول 1: الحل 1- الحلول التي يمكن أن تتراوح بين 1 و 1000 1 مكونات الحل 1.

2.5x بريميكس
الكاشف حجم الصوت (ميكرولتر)
مزيج من الأحماض الأمينية يحتوي على 24 مليون متر لكل منهما، باستثناء الليوسين الذي هو في 20 mM 2500
ديثيوثيريتول (DTT) عند 100 متر م 100
الغلوتامات المغنيسيوم في 1 M 25
PEG-8000 في 40٪ wt/vol 500
الغلوتامات البوتاسيوم في 2 M 303
الحل 1 (انظر الجدول 1) 714.3

الجدول 2: بريميكس. مكونات الحل premix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا ينتج lysate البكتيرية نشطة للغاية للتعبير الجيني الخالي من الخلايا. المفتاح هو استخدام الخلايا التي تحمل pAD-LyseR البلازميد، الذي يعبر عن لامبدا فاج إندوليسين سيوليكالي. هذه الخلايا هي قوية لlyse أنفسهم عند permeabilization من الغشاء الداخلي، مما يسمح للاندوريسين الوصول إلى جدار الخلية، والتي تحقق هذه الطريقة من خلال دورة تجميد ذوبان بسيطة. لأن الخلايا lyse نفسها بشكل فعال، ويشار إلى المنتج كما autolysate. بعد أن يتم مسح الخلايا ، فإن الخطوات الوحيدة المتبقية هي الحضانة والطرد المركزي لمسح التخلص التلقائي من الحطام الخلوي.

بالمقارنة مع غيرها من الطرق لإنتاج اليزيت البكتيري ، فإن هذا النهج بسيط وسريع بشكل ملحوظ ، ومع ذلك فإنه لا يضحي بجودة ال ليسات. يمكن الانتهاء من البروتوكول في 8-9 ساعة بعد تلقيح ثقافة الإنتاج ، مع 1-2 ساعة فقط من العمل العملي. قطعة من المعدات الموصى بها الوحيدة التي ليست قياسية تماما لمختبرات البيولوجيا الجزيئية هو جهاز طرد مركزي قادر على تحقيق 30،000 × ز. ومع ذلك، يمكن إنتاج الخفض التلقائي للجودة المماثلة حتى مع جهاز طرد مركزي أقلسرعة (الشكل 1C، D)؛ المستخدم سيكون فقط أن يكون أكثر حذرا إزالة lysate من بيليه، وربما ترك وراءه أكثر قليلا السائل لضمان عينات نظيفة. وهذه البساطة ليست مجرد مسألة راحة، بل هي مسألة أهمية. البروتوكولات أقل تعقيدا تميل إلى تحقيق نتائج أكثر استنساخا، مع اختلاف أقل عند تنفيذها بأيدي مختلفة. التعديل المعروض في الخطوة 5.4، حيث يتم تجميد الخلايا المجففة جنبا إلى جنب مع جميع الكواشف الأخرى، ويقدم بروتوكول أبسط من ذلك، على الرغم من انخفاض إنتاج البروتين الغلة. وتجدر الإشارة إلى أنه في هذا التعديل، يتم تخطي خطوات الطرد المركزي لمسح نسبة الحطام الخلوي، مما يقلل من عمالة المعالجة؛ ومع ذلك، فإن الحطام المتبقي يقلل من التعبير من lysate12.

في السنوات الأخيرة، تم نشر العديد من النهج لإنتاج ليسات خالية من الخلايا، لخص مؤخرا من قبل كولوآخرون. وقد استكشفت هذه الدراسات استراتيجيات مختلفة لنوع الخلية، وظروف النمو، ومنهجيات التحلل، وما بعد المعالجة. وقد تطلبت معظم الطرق الأخرى للتحلل معدات متخصصة مثل الصحافة الفرنسية ، والتجانس ، والخرز الخافق ، أو sonicator. حذف فوجيوارا ودوي هذه المعدات لصالح دورة تجميد ذوبان مماثلة لتلك الموصوفة هنا، إلا أنها جعلت الخلايا عرضة للتحلل عن طريق التعامل معها مع lysozyme بدلا من التعبير عن اندليسين16. على الرغم من أن هذا هو تقريبا بروتوكول بسيط مثل واحد كما هو موضح هنا، يجب غسل الخلايا المعالجة lysozyme بينما في حالتها الهشة دون تعطيلها قبل الأوان، والتي يمكن أن تتطلب براعة التجريبية وإدخال مصدر للتغير.

بالإضافة إلى اليزات، يتطلب التعبير الجيني الخالي من الخلايا محلولا مسبقا يحتوي على مصادر الطاقة والحمضي الريبي ومونومير البروتين، والجزيئات الصغيرة الأخرى. وصفة بريميكس وصفت وتحسينها سابقا17، مع بعض التعديلات. يحتوي بريميكس المستخدم هنا على تركيزات أعلى بنحو 4 مرات من الأحماض الأمينية ، بالإضافة إلى غلوتامات المغنيسيوم الإضافية و PEG 8000 المقابلة لتركيزات التفاعل النهائية من 7.5 mM و 3.5٪ وزن / حجم ، على التوالي. قد تتطلب النتائج المثلى ضبط الغلوتامات المغنيسيوم التكميلية وتركيزات PEG 8000 لكل دفعة جديدة من اليزالات ، على الرغم من أن التركيزات المذكورة أعلاه حققت نتائج جيدة باستمرار (انظر الملاحظة 2). تطبيقات فريدة من نوعها قد تتطلب إعادة تحفيز هذه التركيزات, على سبيل المثال, عند استخدام CLPX تكملها lysate13.

سلالة الإشريكية القولونية القياسية لإنتاج اللحواف الخالية من الخلايا هي BL21-Gold (DE3). وقد أودعت مشتقة من هذه الخلايا التي تحتوي على التحلل الذاتي pAD-LyseR في مستودع سلالة وبلازميد (انظر جدول المواد). تتوفر أيضا مشتقة تفتقر إلى lacZ الجينومية لتقليل خلفية الدوائر التي تستخدم الإخراج القائم على LacZ وتعبير plasmid pAD-GamS لاستخدامه لتنقية بروتين GamS الذي يمكن أن يحمي الحمض النووي الخطي من التدهور. وينبغي أن تكون هذه السلالات الخلوية وplasmids مفيدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات في التعبير الجيني الخالي من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.H. هو المؤسس المشارك لشركة GenCirq Inc، التي تركز على علاجات السرطان. وهو عضو في مجلس الإدارة ولديه أسهم في GenCirq.

Acknowledgments

يشكر المؤلفان زاكاري صن وريتشارد موراي (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا) على التكرم بتوفير جهاز P_araBAD-gamS، وكيكو كامي (معهد كيوتو للتكنولوجيا) لتكرمهم بتوفير جهاز طرد مركزي عالي السرعة للتبريد. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة ومن برنامج ARO MURI، وتم دعمه جزئيا من قبل المبادرة الرائدة للباحثين الشباب الممتازين، MEXT، اليابان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2xYT media EMD Millipore 4.85008 or equivalent
3-PGA Sigma Aldrich P8877 or equivalent
Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff Millipore Sigma UFC900308 optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated
ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G or carbenicillin, a more stable variant
ATP Sigma Aldrich A8937 or equivalent
cAMP Sigma Aldrich A9501 or equivalent
CoA Sigma Aldrich C4282 or equivalent
CTP United States Biosciences 14121 or equivalent
D-glucose (dextrose) Fisher Scientific AAA1749603 or equivalent
dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich D0632-1G or equivalent
E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR Addgene 99244
E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR Addgene 99245
Folinic acid Sigma Aldrich F7878 or equivalent
GTP United States Biosciences 16800 or equivalent
HEPES Sigma Aldrich H3375-25G or equivalent
LB media Fisher Scientific DF0446075 or equivalent
magnesium glutamate Sigma Aldrich 49605-250G or equivalent
NAD Sigma Aldrich N6522 or equivalent
potassium glutamate Sigma Aldrich G1501-100G or equivalent
potassium hydroxide (KOH) Sigma Aldrich 221473-25G for adjusting pH
potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-500 or equivalent
potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-500 or equivalent
Spermidine Sigma Aldrich 85558 or equivalent
Tris-HCl Fisher Scientific 9310500GM or equivalent
tRNA mix Roche 10109541001 or equivalent
UTP United States Biosciences 23160 or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).

Tags

علم الأحياء، العدد 176،
إنتاج سريع وبأسعار معقولة وغير معقد من ليسات خالية من الخلايا البكتيرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, … More

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate. J. Vis. Exp. (176), e62753, doi:10.3791/62753 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter