Summary
このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌 の設計された株を使用し、標準的な実験装置のみを必要とする、無細胞遺伝子発現のための細菌リセートを生成するための迅速かつ簡単な方法を記述する。
Abstract
無細胞遺伝子発現は、生物の合併症を伴わない生物学の力を提供する。このような遺伝子発現システムの多くは存在しますが、ほとんどは購入に非常に高価であり、また/または、効果的に生産するために特別な機器と細かく磨かれた専門知識を必要とします。このプロトコルは、標準的な実験室装置のみを使用し、最小限の処理を必要とする高レベルの遺伝子発現をサポートする細菌無細胞ライセートを生成する方法を記述する。この方法は、成長に影響を与えないが、簡単な凍結融解サイクルに続いて収穫された細胞ペレットを効率的に融解する内生リンジンを産生する大腸菌株を使用する。必要な唯一のさらなる処理は、細胞の破片の自己起質をクリアするために遠心分離に続く短いインキュベーションです。動的遺伝子回路は、収穫前に細胞内のClpXプロテアーゼの異種発現によって達成することができる。lacZ遺伝子を欠いた大腸菌株は、着色または蛍光読み出しを使用して高感度、無細胞バイオセンシングアプリケーションに使用できます。プロトコル全体は8-9時間しか必要としませんが、接種から完了までの実習作業は1〜2時間です。無細胞のライセートを得るためのコストと時間を削減することによって、この方法は、様々なアプリケーションのための無細胞遺伝子発現の手頃な価格を高める必要があります。
Introduction
無細胞ライセートにおける遺伝子発現は、生細胞1、2、3、4を使用する上で、いくつかの利点がある。ライセートは生化学的に簡単に改変でき、生細胞で達成することが有害または不可能な条件で使用することができます。遺伝子発現回路は、ホスト生物学的プロセスと競合したり、競合したりする必要は一つではなく、新しい遺伝子回路のテストはDNAを追加するのと同じくらい簡単です。これらの理由から、無細胞遺伝子発現は、バイオセンサー5、6から合成遺伝子回路7、8の迅速なプロトタイピング、人工細胞9の開発まで、様々な応用を見つけた。ほとんどの無細胞遺伝子発現は、高度に処理された細胞ライセートを利用し、一般的に長く複雑なプロトコル、特殊な装置、および/または感受性の高いステップを必要とし、ユーザとバッチ10,11の間で大きな変動を引き起こす可能性がある。
この論文では、最小限の処理と専門知識を必要とする無細胞ライセートを製造するためのシンプルで効率的な方法について説明します(図1A)12。この方法は、単純な凍結融解サイクルに従ってライスするように設計された大腸菌細胞に依存する。細胞は、細胞壁を分解するファージラムダから内層分解物を発現する。細胞が成長するにつれて、この内層は細胞質に残り、細胞壁から隔離される。しかし、単純な凍結融解サイクルは細胞質膜を破壊し、子宮内膜を細胞壁を分解する周辺に放出し、細胞の分解を引き起こし、細胞の分解を迅速に生じる。このプロトコルは、わずか数時間の実践的な作業で完了することができ、冷凍庫、30,000×g(最適な結果のために;ペレットを乱さないより注意して低速を使用できる)、渦ミキサー、および簡単なバッファソリューションのみを必要とします。機能性ライセートは、細胞を凍結乾燥させてその現場で再水和することによっても生成することができる。しかし、この方法は、おそらく残りの細胞の破片のために、より低い活性を有するライセートを生成する。
ライゼートは無細胞遺伝子発現に対して非常に活性であり、最終的な使用に応じて様々な方法で増強することができる。タンパク質合成の速度は、標準的なスピン濃縮器を使用してライセートを濃縮することによってさらに増加させることができる。リニアDNAは、精製GamSタンパク質を添加することで分解から保護することができます。タンパク質分解は、振動などのより複雑な回路ダイナミクスに必要であり、自動分解物生成株13においてClpXヘキサマーを共発現させることによって達成できる。最後に、LacZ ベースのビジュアル読み出しは 、lacZを欠いている自動分解歪みを使用して有効になります。全体的に、この方法は、幅広い用途に適した高活性細胞フリーのライセートを生成する。
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Protocol
1. メディアとバッファを準備します。
- 2xYTPG培地を準備します。
- 62g 2xYT粉末、5.99gリン酸カリウム一塩基、13.93gのリン酸カリウム二塩基、および2Lに脱イオン水を混合する。
- 30分14の露出時間を持つ液体サイクル上のオートクレーブ。
- 1.1.2から2xYTP培地の400mLに、7.2 gのD-グルコース(デキストロース)を加え、溶解するまで混ぜます。
- 0.2 μmフィルターを通してフィルター滅菌します。
- S30A バッファを準備します。
- トリス-HCl(pH 7.7、50 mM最終濃度)、グルタミン酸カリウム(60mM最終)、グルタミン酸マグネシウム(14mM最終)を混合します。
- 10 M KOH を使用して pH を 7.7 に調整します。
- ソリューション 1 の準備 ( 表 1を参照)。
- 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)を2mLの水で再懸濁します。
- KOH を使用して pH を 8.0 に調整します。
- 表 1から他のすべてのコンポーネントを追加します。
- 10 M KOH を使用して pH を 7.6 に調整します。フィルター滅菌。
- 2.5x プレミックス ソリューションを準備します ( 表 2を参照)。
- 表 2のすべてのコンポーネントを混合します。
- KOH を使用して pH を 7.5 に調整します。
- アリコートと -80 °Cで凍結します。
注意:20 μLの反応は8.9 μLのプレミックスを使用します。
2. 細胞を準備します。
- 50 μg/mL アンピシリンを含むLB寒天プレートに自動調整セルをストリークし、37 °Cで成長します(注1参照)。
- ピペットチップを使用してLB/アンピシリン培地のスターター培養に単一コロニーを選び、一晩で37°Cで成長します。
- 50 μg/mL アンピシリンを含む2xYTPG培地400mLを400μLのスターター培養で接種し、1Lエルレンマイヤーフラスコで37°Cで成長し、300rpmで振る。
- 分光光度計を用いて、1cmのパス長を持つ光学キュベットを読み取り、600nm(OD600)で培養物の光学密度を定期的に測定します。OD600が1を超えると、測定前に培養物を5倍希釈し始め、測定が典型的な実験室分光光度計の線形範囲内に留まることを確認します。5倍希釈培養が0.3のOD600(1.5の培養OD600に相当する)に達するまで細胞を増殖し続ける。
3. ライセートを準備します。
- 2 mMジチオトレイトール(DTT)を補ったS30Aバッファーを準備します。ステップ3.7で使用するために氷の上に置くDTTストック溶液の6 μLとS30Aバッファーの3 mLを混合します。
- 室温で15分間1800×gで遠心分離機で細胞を収穫します。
- 上清を流し、ピペットを使って残りの液体を取り除いて捨てます。
- ボルテックスミキサーを使用して、ペレットを45 mLの冷たい(4-10°C)S30Aバッファーに再懸濁します。
- 空の50 mL遠心分離チューブの重量を量り、細胞を中に移し、ステップ3.2~3.3を繰り返して細胞を洗浄します。
- ペレットの重量を量り、空の50 mLチューブの重量を差し引く。ペレット重量の正確な測定を確実にするために、残りの上清を慎重に吸引してください。
注:典型的な収量は、生産培養の400 mLから細胞ペレットの〜1.3 gです。 - 2 mMジチオトライトールを補った2量の冷たいS30Aバッファ、すなわち、細胞ペレットの1gごとに2mLのバッファーを加え、激しく渦混合することによって細胞を再懸濁する。
- セルを固定します。ペレットが完全に凍結されるまで、細胞を含む50 mLチューブを-20°Cまたは-80°Cの冷凍庫に入れ、
注:凍結ステップは、その日の良い停止点です。 - 室温の水浴で細胞を解凍します。
- 2-3分間激しく渦を出す。
- 300rpmで振りながら37°Cで45分間インキュベートします。
- 4°Cで45分間、透明遠心管を30,000×gで遠心分離して重い細胞の破片のサンプルをクリアします。
注:30,000 x gの対応する遠心分離機が利用できない場合は、21,000×gで45分間遠心分離機を使用し、ペレットのコンパクト化が少なくてすむため、ステップ3.13で追加の注意を払ってください。 - 慎重にピペットで新しいチューブに上清を移し、ペレットをできるだけ邪魔しないようにします。移された上清がペレットからの材料で汚染されている場合は、前のステップを繰り返します。
- 上清を1.5mL遠心管と遠心分離機に21,000×g(または卓上遠心分離機の最高速度)でもう一度5分間移します。
- アリコートは、クリアした自動で所望のボリュームに自動化し、残りのペレットを慎重に避け、-80°Cで凍結するか、すぐに使用する。
注:単一の20 μLの反応は8 μLの自動調整を使用します。
4. 無細胞遺伝子発現
注: 自動調整は、必要なエンドユースの準備が整いました。以下は、無細胞遺伝子発現の標準プロトコルの例である。
- 20 μL 反応の場合は、氷の上で 8 μL の自動調整液と 8.9 μL のプレミックスを混合します。グルタミン酸マグネシウムおよびPEG 8000濃度の最適化に関するプロトコルセクションの最後にあるNOTEを参照してください。
- DNA(例えば、pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500)を最終濃度の8 nMに加え、他の試薬、水を20μLに加えます。
- 反応を384ウェルマイクロプレートに入れ、プレートリーダーを使用して蛍光時間の経過および/またはエンドポイントを測定します。緑色蛍光タンパク質(GFP)の場合、励起波長485nm、発光波長520nmを使用してください。
5. プロトコルの変更
注: プロトコルの次の変更により、他のアプリケーションにサービスを提供できます。
- 線形DNAテンプレートを用いた無細胞遺伝子発現
- セクション4のステップを実行し、線形DNAを添加する前に、2.2 μM精製GamSタンパク質(発現および精製12)で反応を補う。
- タンパク質分解を取り入れた無細胞遺伝子発現
- ステップ2.1では、プラスミドpACYC-FLAG-dN6-Hisを含む細胞を自動調整して使用します( 材料表を参照)。すべての成長媒体に、34 μg/mLクロラムフェニコールが含まれる。
- ステップ2.3では、プラスミドから発現を誘導する成長培地中に40μMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含む。
- ステップ 3.2~3.4 (洗浄) を 2 回繰り返し(合計 3 回の洗浄で)、翻訳阻害剤であるクロラムフェニコールを完全に除去します。最初の2回のスケ(ステップ3.4)については、リン酸緩衝食塩(pH 7.4)でS30Aバッファーを置換する。
- ステップ4.2では、追加の3 mM ATP(水中100mM ATP、pH 7.2)および4.5mMマグネシウムグルタミン酸マグネシウム(水中1Mストック溶液を使用)(最終濃度)を加えて、ClpXPによる高いATP使用を補い、追加のATPによるマグネシウムのキレートを補います。
- LacZベースの読出しを用いた無細胞遺伝子発現(測色を含む)
- 手順 2.1 では、LacZ をネイティブに発現しない自動分解セルを使用します ( 材料表を参照)。
- あるいは、凍結乾燥した細胞から直接、ライセートを調製する。
- 1.1 から 3.7 までのすべてのステップを実行します。
- プレミックスの8.9 μLとセル懸濁液の8 μLを混合します。
- プラスミドDNA(必要に応じて)、他のカスタム試薬、水を加え、最終容積20μLに到達します。
- 反応を384ウェルマイクロプレートに移し、凍結乾燥させます。
注:凍結乾燥サンプルは、最大1週間、場合によっては長く保存することができます。 - 反応を開始するには、所望のDNAまたは他の試薬で補われた18μLの脱イオン水で再水和します。
- プレートリーダーの蛍光ダイナミクスに従ってください。
注1:細胞を自動調整することは凍結融解サイクルでの凍結を起用するように設計されているので、冷凍ストックを作るときには凍結保護剤を使用することが特に重要です。24%の質量/体積グリセロールで在庫を凍結し、-80°Cで保存しました。
注2:マグネシウムイオンとPEG 8000は、ライセート性能に不可欠です。塩基2.5xプレミックスは、以前に公開されたデータに基づいて、6 mMのグルタミン酸マグネシウムおよび4.8%のwt/vol PEG 8000を含み、最終的な反応でそれぞれ2.4mMおよび1.9%になる。ここでプロトコルで調製された自動調整物は、通常、最終反応で追加の5 mM Mg-グルタミン酸および1.5%PEG 8000で最高のパフォーマンスを発揮する。しかし、これは、追加の0-10 mM Mgグルタミン酸および追加の0〜3%PEG 8000(ベースプレミックスと比較して)の範囲で最適化することができる。推奨される追加の5 mM Mg-グルタミン酸と1.5%のPEG 8000(最終濃度)を用いてプレミックスを調製するには、1 Mで4.75 μLのグルタミン酸マグネシウムと40%の重量/体積で36.1 μLのプレミックスを混合します。
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Representative Results
代表的な結果は、構成的に発現するプラスミドからGFPを発現するために自己分解物を用いることによって観察され得る、ここでpBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500、およびGFP蛍光の時間経過をプレートリーダーに記録する(図1B)。プラスミドDNAの希釈系列は、1nM DNAでも強い発現を発見した。市販のライセートと比較して、オートリセートは、GFP時間経過の時間誘導体として計算された、より大きな総収率を生成し、より大きな最大生産率を達成することができる(図1C、D)。この方法を使用したその他の結果については、Didovykら12を参照してください。このプロトコルの障害ポイントは比較的少ないです。しかし、自己増殖物が細胞デブリを十分にクリアしないと、最適でない結果が得られる。最適な結果は、LYSATの各バッチに対してPEG-8000およびMg2+の濃度を最適化する必要があります(注2参照)。
図1: 代表的な結果( A) プロトコルの視覚的表現(B) 凍結融解オートマゼートにおけるpBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500からのGFP発現の時間経過例McroYarrayからの市販の参照ライセート(オレンジ、MYtxtl-70-96MMarray)と比較して、2人の異なる研究者によって2つの異なる実験室で調製された自動調整物の最大GFP産生(C)および最大生産率(D)を30,000 x g遠心分離機(青とオレンジ)または20,000 x g遠心分離機(紫)を使用した。すべての誤差範囲は、2 つの技術的な反復の絶対誤差です。この図は 12から変更されています。著作権 2017 アメリカ化学会.略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決策1:合計4 mLに水を加える | |
| 名前 | 重量 (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| キャンプ | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| フォリン酸 | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| ヘペス | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| スペルミジン | 8.1 |
| tRNA | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
表 1: ソリューション 1.ソリューション 1 のコンポーネント。
| 2.5x プレミックス | |
| 試薬 | ボリューム(μL) |
| 20mMのロイシンを除く24mMをそれぞれ含むアミノ酸ミックス | 2500 |
| 100 mM のジチオスレイトール (DTT) | 100 |
| 1 Mでグルタミン酸マグネシウム | 25 |
| 40%の重量/volでPEG-8000 | 500 |
| 2 Mのグルタミン酸カリウム | 303 |
| ソリューション 1 (表 1 を参照) | 714.3 |
表2:プレミックス。プレミックスソリューションのコンポーネント。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、無細胞遺伝子発現に対して非常に活性な細菌ライセートを生み出す。鍵は、細胞内に内反するラムダファージを発現するプラスミドpAD-LyseRを運ぶ細胞を使用することです。これらの細胞は、内膜の透過化時に自分自身を溶分解するように増強され、単純な凍結融解サイクルを通じて得られた細胞壁への内層リンアクセスを可能にする。細胞は効果的に自分自身をライスするので、製品は自動調整と呼ばれます。細胞がリジングされた後、残りの唯一のステップは、細胞の破片の自己起量をクリアするためにインキュベーションと遠心分離です。
細菌のライセートを製造するための他の方法と比較して、このアプローチは、特に単純かつ迅速であるが、それは、まだそれは、ライセートの品質を犠牲にしません。このプロトコルは、生産文化を接種した後、わずか1〜2時間の実習で完了することができます。分子生物学の実験室のための完全に標準ではない装置の唯一の推奨部分は30,000×gを達成することができる遠心分離機 である。しかし、同等の品質の自動調整は、低速遠心分離機(図1C、D)でも製造することができます。ユーザーはペレットからライセートを取り除くことにもっと注意する必要があり、おそらくより多くの液体を残してきれいなサンプルを確保する必要があります。このシンプルさは単なる便宜上の問題ではありません。あまり複雑でないプロトコルは、異なる手で実行すると、より少ない変動で、より再現性の高い結果をもたらす傾向があります。ステップ5.4で提示された改変は、細胞が他のすべての試薬と共に凍結乾燥され、タンパク質産生収率を低下させるが、さらに単純なプロトコルを提示する。特に、この改変では、細胞デブリのリセートを取り除く遠心分離ステップがスキップされ、処理作業がさらに減少します。しかし、残りの破片は、ライセート12からの発現を減少させる。
近年、無細胞ライセートを製造するための多くのアプローチが発表されている、最近、Coleらら15によって要約されている。これらの研究は、細胞の種類、成長条件、リシス方法論、および後処理のための様々な戦略を探求してきた。リシスの他のほとんどの方法は、フランスのプレス、ホモジナイザー、ビーズビーター、または超音波処理器などの特殊な機器を必要としました。藤原と上井は、ここで説明したような凍結融解サイクルを支持してこの装置を省略したが、細胞を内合酵素16を発現させるのではなく、リゾチームで処理してリゾーシスの影響を受けやすい細胞をレンダリングした。これはここで説明したものとほぼ同じくらい単純なプロトコルですが、リソチーム処理細胞は、早期にそれらを破壊することなく、壊れやすい状態で洗浄する必要があり、実験的な繊細さを必要とし、変動の源を導入する可能性があります。
溶解物に加えて、無細胞遺伝子発現には、エネルギー源、RNAおよびタンパク質モノマー、および他の小分子を含むプレミックス溶液が必要です。プレミックスのレシピは、いくつかの変更で、以前に17を説明し、最適化されました。ここで使用したプレミックスには、アミノ酸の約4倍の濃度、および7.5mMと3.5%の重量/体積の最終的な反応濃度に対応する追加のグルタミン酸およびPEG 8000が含まれていました。最適な結果は、上記の濃度は一貫して良い結果を生み出したが、新しいリセートのバッチごとに補足的なグルタミン酸マグネシウムおよびPEG 8000濃度を調整する必要がある(注2参照)。独自のアプリケーションでは、例えば、ClpX補充のライセート13を使用する場合など、これらの濃度を再最適化する必要があります。
無細胞のライセートを製造するための標準的な 大腸菌 株はBL21-Gold(DE3)である。自己起性プラスミドpAD-LyseRを含むこれらの細胞の誘導体は、株およびプラスミドリポジトリに堆積している( 材料表を参照)。また、ゲノム lacZ を欠いた誘導体は、LacZベースの出力を使用する回路のバックグラウンドを劇的に低減し、線型DNAを分解から保護できるGamSタンパク質の精製に使用するプラスミドpAD-GamSを発現させます。これらの細胞株およびプラスミドは、無細胞遺伝子発現における様々な用途に有用であるべきである。
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Disclosures
J.H.は、がん治療薬に焦点を当てたGenCirq Inc.の共同創設者です。彼は取締役会に在り、GenCirqに株式を持っています。
Acknowledgments
著者らは、ザカリー・サンとリチャード・マレー(カリフォルニア工科大学)がプラスミドP_araBADガムを提供してくれたこと、亀井佳子(京都工業大学)が高速冷却遠心分離機を親切に提供してくれたことに感謝する。この研究は、国立衛生研究所とARO MURIプログラムからの助成金によって支えられ、一部は優秀な若い研究者のためのリーディングイニシアチブ、MEXT、日本によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
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