Summary
Un protocole est prévu pour la mise en place d’un microscope confocal à balayage laser standard pour les mesures in vivo de transfert d’énergie par résonance de Förster, suivies d’une évaluation des données.
Abstract
Les expériences de transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET) basées sur des émissions sensibilisées sont faciles à réaliser, mais dépendent de la configuration microscopique. Les microscopes confocaux à balayage laser sont devenus un cheval de bataille pour les biologistes. Les systèmes commerciaux offrent une grande flexibilité dans le réglage de la puissance laser et la sensibilité du détecteur et combinent souvent différents détecteurs pour obtenir l’image parfaite. Cependant, la comparaison des données basées sur l’intensité de différentes expériences et configurations est souvent impossible en raison de cette flexibilité. Les procédures conviviales pour les biologistes sont avantageuses et permettent un réglage simple et fiable des réglages du laser et du détecteur.
De plus, comme les expériences FRET dans des cellules vivantes sont affectées par la variabilité de l’expression des protéines et des rapports donneur-accepteur, les niveaux d’expression des protéines doivent être pris en compte pour l’évaluation des données. Décrit ici est un protocole simple pour des mesures FRET fiables et reproductibles, y compris des routines pour l’estimation de l’expression des protéines et l’ajustement de l’intensité laser et des paramètres du détecteur. L’évaluation des données sera effectuée par étalonnage avec une fusion de fluorophores de l’efficacité FRET connue. Pour améliorer la simplicité, des facteurs de correction ont été comparés qui ont été obtenus dans les cellules et en mesurant des protéines fluorescentes recombinantes.
Introduction
Le transfert d’énergie de résonance de Förster ((F)RET) est généralement observé par spectroscopie de fluorescence, bien que le processus lui-même ne se limite pas à se produire entre les fluorophores. Le couplage dipôle-dipôle sous-jacent nécessite simplement une molécule donneuse émettant de la lumière et un accepteur absorbant la lumière. Ceci est dérivé de l’intégrale de chevauchement spectral requise J des spectres normalisés d’émission du donneur et d’absorbance de l’accepteur1. Cependant, comme le RET est en concurrence avec la fluorescence, le transfert d’énergie devient mesurable par des altérations de l’émission de fluorescence : le RET induit la trempe du donneur et l’émission d’accepteur sensibilisé.
Le RET à base de fluorophore a été appelé transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET) pour le séparer du transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET). Le RET dépend fortement de la distance entre le donneur et l’accepteur, qui est largement comprise entre 0,5 et 10 nm2 et donc dans la même gamme que les dimensions des protéines et de leurs complexes. Deuxièmement, RET dépend de l’orientation dipôle-dipôle kappa au carré. Combiné au fait que la liberté de rotation des fluorophores liés aux protéines peut être négligée en raison du poids moléculaire et de la relaxation rotationnelle lente, RET permet l’analyse des altérations conformationnelles3.
Le rayon de Förster est basé sur l’intégrale du chevauchement spectral et la gamme de longueurs d’onde du chevauchement, de sorte que les chromophores absorbant la lumière rouge entraînent des rayons de Förster plus longs que les colorants absorbant la lumière bleue. Comme la plage dynamique des mesures FRET est limitée de 0,5 × R0 et de 1,5 × R0, la paire FRET ECFP-EYFP a une plage dynamique de 2,5 à 7,3 nm en raison de son R0 de 4,9 nm4.
La luminosité d’un fluorophore est donnée par le produit de son coefficient d’extinction molaire et de son rendement quantique. Pour les mesures FRET, il est avantageux de choisir des fluorophores de luminosité presque similaire. Cela améliore la détection de la trempe du donneur et de l’émission d’accepteurs sensibilisés. Il favorise également l’étalonnage du système de microscopie. En regardant les paires FRET fréquemment utilisées de protéines cyan et fluorescentes, la luminosité plus faible des protéines fluorescentes cyan devient évidente (Figure 1A).
Cependant, la durée de vie de l’accepteur doit être inférieure à la durée de vie du donneur, ce qui garantit la disponibilité de l’accepteur pour le transfert d’énergie. Si la durée de vie de l’accepteur dépasse la durée de vie du donneur, l’accepteur peut encore être dans l’état excité lorsque le donneur est à nouveau excité. Les protéines fluorescentes cyan avancées telles que mTurquoise montrent une durée de vie prolongée et contribuent ainsi à une probabilité accrue de FRET (Figure1B). La probabilité de FRET dépend également du coefficient d’extinction molaire de l’accepteur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE: Pour le protocole suivant, une transfection transitoire des protoplastes a été effectuée, comme décrit précédemment12. Une brève description est donnée ci-dessous.
1. Transfection transitoire des protoplastes
- Couper ~4 g de feuilles saines de l’écotype Columbia d’Arabidopsis thaliana en tranches de 1 mm et les transférer dans 20 mL de solution enzymatique (1,5 % de cellulase ; 0,4 % de macérozyme ; 0,1 % d’albumine sérique bovine Fraction V ; 0,4 M de mannitol ; 20 mM de KCl ; 20 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES), pH 5,7 ; 10 mM de CaCl2).
- Infiltrer sous vide les tranches de feuilles suivie d’une incubation avec agitation pendant 2 h à température ambiante. Récolter les cellules par centrifugation pendant 3 min à 100 × g.
- Laver les protoplastes avec une solution de W5 (154 mM naCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 2 mM MES, pH 5,7) et les remettre en suspension dans une solution MMG (0,4 M mannitol; 15 mM MgCl2; 4 mM MES, pH 5,7).
- Effectuer la transfection dans une lame de 8 puits par choc osmotique en présence de polyéthylèneglycol (PEG) 4000. Mélanger 20 μL de la suspension de protoplaste avec 5 μL d’ADN plasmidique (5 μg/μL) et 25 μL de solution de PEG (0,2 M de mannitol, 0,1 M caCl2, 40 % de PEG 4000).
- Inverser le choc osmotique par un réajustement en douceur des conditions osmotiques.
REMARQUE: Outre l’échantillon d’intérêt, l’expression du donneur seul et de l’accepteur seul est nécessaire pour déterminer le saignement spectral du donneur et de l’accepteur, respectivement. Une protéine de fusion du donneur et de l’accepteur doit également être exprimée à des fins d’étalonnage. L’expression de la protéine fluorescente était sous le contrôle d’un promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (pCaMV35S). Pour toutes les mesures, deux microscopes confocaux à balayage laser (LSM1 et LSM2) ont été utilisés. LSM1 dispose de deux types de détecteurs : pour les mesures FRET, le signal donneur a été détecté par un détecteur GaAsP, tandis que FRET et l’émission d’accepteur ont été enregistrés avec un photomultiplicateur. LSM2 a deux photomultiplicateurs, qui ont été utilisés pour la détection du donneur, FRET, et l’émission de l’accepteur.
2. Réglage au laser
REMARQUE: Ici, des lignes de 458 nm et 514 nm d’un laser argon-ion ont été appliquées pour l’analyse FRET entre les protéines fluorescentes cyan améliorées (ECFP) et les protéines fluorescentes jaunes améliorées (EYFP). Pour l’acquisition de données reproductibles, les deux lignes ont été ajustées à une intensité similaire. Ceci a été réalisé soit par un photomultiplicateur de transmission, soit par le mode de réflexion.
- Réglage laser avec un photomultiplicateur de transmission
- Utilisez un puits vide pour l’ajustement.
- Choisissez le mode de balayage linéaire et la vue histogramme.
- Diminuez l’intensité du laser au minimum et ajustez le gain du détecteur au bruit de fond détectable.
- Augmentez l’intensité du laser par pas de 0,5% et enregistrez le signal correspondant.
- Appliquez la routine pour les deux lignes laser.
- Réglage laser avec mode réflexion
- Utilisez un puits vide pour l’ajustement.
- Appliquez un filtre de réflexion, activez le mode de réflexion, le cas échéant.
- Assurez-vous que la gamme de longueurs d’onde du détecteur couvre la longueur d’onde du laser.
- Choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme.
- Diminuez l’intensité du laser au minimum et ajustez le gain du détecteur au bruit de fond détectable.
- Déplacez l’objectif à la position la plus basse.
- Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que le reflet du couvercle soit visible.
- Augmentez l’intensité du laser par pas de 0,5% et enregistrez le signal correspondant.
- Appliquez la routine pour les deux lignes laser.
- Évaluation des données
- Tabulez les données et triez les données par intensité de signal.
- Tracez les intensités du signal par rapport à la puissance laser relative.
- Choisissez des intensités laser qui se traduisent par une intensité de signal similaire.
3. Réglage des photomultiplicateurs
REMARQUE: Après ajustement laser, les photomultiplicateurs ont été ajustés aux gains individuels pour obtenir une sensibilité similaire. Cet étalonnage a été effectué avec la ligne laser 514 nm, qui se trouve au centre de la gamme de longueurs d’onde d’intérêt.
- Utilisez un puits vide pour l’ajustement.
- Appliquez un filtre de réflexion et passez en mode de réflexion si disponible.
- Assurez-vous que la gamme de longueurs d’onde du détecteur couvre la longueur d’onde du laser (514 nm).
- Choisissez le mode de balayage de ligne et la vue d’histogramme.
- Réduisez le gain du détecteur à la moitié du maximum et ajustez l’intensité du laser au bruit de fond détectable.
- Déplacez l’objectif à la position la plus basse.
- Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que le reflet du couvercle soit visible.
- Augmentez le gain du détecteur par pas de 50 à 100 V et enregistrez le signal correspondant.
- Appliquez les étapes 3.1 à 3.8 pour les deux détecteurs.
- Évaluation des données
- Tracez l’intensité par rapport au gain du détecteur pour chaque détecteur.
- Choisissez les gains individuels du détecteur pour obtenir une sensibilité similaire.
4. Acquisition d’images FRET
REMARQUE: Commencez par l’échantillon d’intérêt pour la configuration de l’acquisition d’images.
- Choisissez les filtres/miroirs dichroïques appropriés, par exemple, un miroir double dichroïque MBS 458/514 pour la paire FRET ECFP/EYFP. Utilisez le même miroir dichroïque pour tous les canaux afin de permettre le balayage ligne par ligne. Sélectionnez un objectif d’immersion dans l’eau pour l’imagerie des cellules vivantes. Choisissez une analyse 12 bits ou 16 bits et une vitesse d’analyse modérée.
- Définir la plage de détection, de préférence 470-510 nm pour la détection du donneur et 530-600 nm pour la détection accepteur/FRET dans le cas de l’ECFP/EYFP. Lorsque vous utilisez un laser à diode de 445 nm ou 440 nm, utilisez 450 à 510 nm comme plage de détection. Dans le cas d’un séparateur de faisceau acousto-optique (AOBS), définissez la détection du donneur dans la plage de 450 à 500 nm pour éviter la détection d’accepteurs indésirables.
- Appliquer le réglage du détecteur conformément à la section 3.10.2.
- Appliquez le réglage laser conformément à la section 2.3.2. Révisez l’intensité du laser en fonction de la table de puissance laser obtenue, si nécessaire. Assurez-vous que le rapport signal/bruit couvre toute la plage dynamique des détecteurs (intensité allant de 0 à 4095 pour un balayage 12 bits).
- Maintenez les intensités laser et les gains du détecteur constants. Utilisez le diamètre du sténopé pour affiner le réglage.
REMARQUE: Gardez à l’esprit que les changements dans le diamètre du sténopé affectent la résolution spatiale. - Effectuez les mesures (prenez des images d’au moins 20 cellules).
5. Détermination des corrections de diaphonie
REMARQUE : Les cellules exprimant uniquement le donneur ou l’accepteur sont nécessaires pour déterminer le saignement spectral du donneur (DSBT) et le saignement spectral de l’accepteur (ASBT), respectivement. Conservez les mêmes paramètres que ceux décrits à la section 4.
- Effectuer des mesures FRET avec des cellules exprimant le fluorophore donneur.
- Effectuer des mesures FRET avec des cellules exprimant le fluorophore accepteur.
6. Étalonnage des mesures selon Beemiller et al.13
REMARQUE: Les cellules exprimant une fusion donneur-accepteur de l’efficacité FRET connue sont nécessaires. Ici, une fusion ECFP-5 aa-EYFP avec un rendement FRET de 0,46 a été utilisée4. Conservez les mêmes paramètres que ceux décrits à la section 4.
- Effectuer des mesures FRET avec des cellules exprimant la fusion donneur-accepteur
7. Évaluation des données
- Obtenez des profils de ligne des cellules, en vous assurant que chaque profil ne contient pas plus d’une cellule. Enregistrez les profils sous forme de fichiers texte.
- Importez les fichiers texte dans une feuille de calcul à l’aide de l’option d’importation de fichier texte de la section Données .
- Lisez les valeurs maximales en appliquant la fonction Max .
- Énumérez les valeurs obtenues dans un tableau, ayez chacune une colonne pour l’ID d’émission du donneur, l’IF d’émission FRET, l’IA d’émission de l’accepteur et au moins quatre ensembles de données : donneur seulement, accepteur uniquement, fusion donneur-accepteur et mesure.
REMARQUE: L’excitation du donneur entraîne également une excitation directe de l’accepteur et provoque une ASBT décrite par la valeur α. - Calculez les valeurs de α ASBT avec le jeu de données accepteur uniquement à l’aide de l’équation (1).
(1)
Remarque : Utilisez la médiane de toutes les valeurs α dans les équations suivantes. Le donneur présente un large spectre d’émission qui se traduit par une diaphonie d’émission avec l’émission sensibilisée de l’accepteur. Cette DSBT est donnée par la valeur β. - Calculez les valeurs de β de fond perdu spectral du donneur avec l’ensemble de données du donneur uniquement à l’aide de l’équation (2).
(2)
Remarque : Utilisez la médiane de toutes les valeurs β dans les équations suivantes. Le facteur d’étalonnage ξ décrit la relation linéaire entre la trempe du donneur dérivée de FRET et l’émission sensibilisée de l’accepteur. Utilisez les médianes de 7,5 et 7,6 dans les équations suivantes. - Calculer les facteurs d’étalonnage ξ avec l’ensemble de données de fusion donneur-accepteur et son efficacité FRET E (0,46) à l’aide de l’équation (3).
(3)
REMARQUE : Utilisez la médiane de toutes les valeurs ξ dans les équations suivantes. - Calculer les rendements FRET de la paire de protéines d’intérêt à l’aide des équations (4) et (5).
(4)
(5) - Estimer les effets de la force d’expression et/ou du rapport donneur-accepteur : tracer la somme des ID, IF et IA par rapport aux efficacités FRET. Effectuer une régression linéaire ; Notez que plus le graphique est raide et plus R2 est élevé, plus l’impact du niveau d’expression est élevé ou plus la différence d’abondance entre donneur et accepteur est grande.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Réglage du microscope confocal à balayage laser
Le réglage laser a révélé une augmentation linéaire de l’émission avec une augmentation de l’intensité du laser (figure 2 et tableau 1). Comme prévu pour les lasers argon-ion, l’émission de la ligne de 514 nm était beaucoup plus élevée que l’émission de la ligne de 458 nm, comme en témoigne une pente plus raide. Pour les expériences ultérieures, une puissance laser de 4,5% et 6,5% a été choisie pour la ligne 514 nm et la ligne 458 nm, respectivement. Il en est résulté une intensité d’émission presque égale de 1123 (514 nm) et 1141 (458 nm).
La variation des gains du détecteur à puissance laser constante a révélé un comportement exponentiel pour les deux détecteurs analysés. Des intensités d’émission similaires ont été obtenues pour un gain de 700 V (figure 3). Bien que l’ajustement des lignes laser ait bénéficié du comportement linéaire, le réglage des détecteurs est probablement affecté par le comportement exponentiel, ce qui entraîne des différences marquées avec des changements mineurs dans le gain à des tensions plus élevées. Malheureusement, cette plage plus élevée est intéressante pour les mesures dans les cellules vivantes, car l’augmentation de la puissance du laser est cytotoxique et favorise le photoblanchiment.
Détermination du fond perdu spectral
Dans un premier temps, le saignement spectral du donneur et de l’accepteur a été analysé avec de l’ECFP et de l’EYFP purifiés recombinants; DSBT β = 0,498 et ASBT α = 0,100. La même chose a été faite avec les cellules exprimant soit l’ECFP, soit l’EYFP. Avec le LSM 2, la DSBT estimée était β = 1,602 ± 0,207 (moyenne ± SD) et l’ASBT était α = 0,119 ± 0,018. Les valeurs médianes étaient β = 1,506 et α = 0,120. Cet écart entre les données obtenues dans les cellules vivantes et les données obtenues avec la protéine recombinante démontre qu’il est impossible d’omettre la détermination du saignement spectral dans les cellules vivantes. Ceci est probablement causé par les pigments cellulaires.
Les images révèlent la luminosité plus élevée de l’EYFP par rapport à l’ECFP (Figure 4 et Tableau 2). Compenser les différences de luminosité par différents réglages laser améliore la plage dynamique du donneur et du canal FRET. Fournir la sortie relative en mesurant les intensités laser, comme cela est fait pour l’ajustement, augmente encore la reproductibilité des mesures.
Pour le LSM 1, β = 0,171 ± 0,044, α = 0,094 ± 0,031 avec des médianes de α = 0,084 et β = 0,180. La détermination de l’ASBT dépend du réglage laser et d’un seul détecteur, et donc, la détermination de l’ASBT a bien fonctionné. La DBST implique deux détecteurs, ce qui donne des résultats très différents pour les deux microscopes. Il convient de rappeler que le LSM 2 est équipé de deux photomultiplicateurs, tandis que le LSM 1 utilise un détecteur GaAsP et un photomultiplicateur, deux types différents de détecteurs aux propriétés spectrales et à sensibilité différentes. En conséquence, le réglage fonctionne mieux avec deux détecteurs identiques.
Étalonnage de la mesure
Pour l’étalonnage, les valeurs médianes de α et β ont été appliquées, et une fusion de l’ECFP et de l’EYFP a été utilisée comme norme d’efficacité FRET connue (E = 0,46). L’étalonnage de l’ECFP-EYFP recombinant et purifié a donné une valeur ξ de 13,44, tandis que les mesures in vivo ont révélé une valeur ξ de 1,525 ± 1,844. La médiane était de 0,798, révélant des valeurs aberrantes extrêmes ainsi que l’écart-type élevé. Pour le LSM 1, les valeurs étaient ξ = 1,978 ± 0,807 avec une médiane de ξ = 1,883. Pour le LSM 2 et le LSM 1, les ensembles de données obtenus pour le calcul de ξ (tableau 3) étaient statistiquement identiques, comme le prouve le test t de Student (p > 0,2).
Mesure FRET
Comme preuve de concept, la mesure FRET a été répétée avec la fusion donneur-accepteur. L’efficacité FRET mesurée était de 0,47 ± 0,07 pour la protéine purifiée et de 0,47 ± 0,06 dans les cellules vivantes avec LSM 2 (tableau 4). La médiane des mesures dans les cellules vivantes était E = 0,45. Pour le LSM 1, l’efficacité FRET était de 0,46 ± 0,09 avec une médiane de E = 0,45 (tableau 4). Ces données démontrent l’étalonnage efficace avec une construction FRET de l’efficacité FRET connue.
Effets du niveau d’expression et du rapport donneur-accepteur
Pour l’ensemble de données analysées, les efficiences FRET n’ont pas été influencées par le niveau d’expression. En raison de la fusion du donneur et de l’accepteur, le ratio était également constant. L’inclusion de jeux de données précédents a révélé une dépendance au niveau d’expression dans un cas (Figure 5). L’efficacité FRET entre les sous-unités ATPase vacuolaires marquées (V-ATPase), VHA-A-ECFP et VHA-a-EYFP, a diminué avec l’augmentation de l’intensité du signal. En revanche, l’interaction entre VHA-E1-ECFP et VHA-C-EYFP était indépendante de l’intensité du signal. Dans le cas de VHA-A et VHA-a, les trois copies de VHA-A sont de plus en plus remplacées par VHA-A-ECFP, ce qui entraîne un excès de donneur par rapport à la copie unique de VHA-a dans le complexe. Bien que VHA-E1 puisse être présent sous la forme de trois copies, la solubilité élevée de VHA-C pourrait abolir cet effet dans cet exemple. Ici, les rendements fret ont été comparativement faibles. Cette approche simple permet de tester les artefacts d’expression et de ratio.
Figure 1 : Vue d’ensemble des paires fret de protéines fluorescentes avec des donneurs émetteurs de cyan. (A) Les rayons de Förster des paires et la luminosité du donneur et de l’accepteur sont donnés pour les paires FRET bien caractérisées. B) Comparaison des durées de vie des donneurs et des accepteurs. Les astérisques gris indiquent une désintégration multiexponentielle. Abréviations : FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster ; CFP = protéine fluorescente cyan; GFP = protéine fluorescente verte; YFP = protéine fluorescente jaune; mX = X monomère; EX = X amélioré; SX = super X. Veuillez cliquer ici pour l’agrandir.
Figure 2 : Réglage laser. L’émission des lasers a été enregistrée par la réflexion du couvercle et tracée par rapport à l’intensité relative du laser telle que modulée par le filtre accordable acousto-optique du LSM. L’émission de la ligne de 458 nm (A) et de la ligne de 514 nm (B) d’un laser argon-ion est montrée. Abréviations: LSM = microscope à balayage laser; r.u. = unités relatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Gain du détecteur et intensité d’émission. Les intensités d’émission résultantes ont été enregistrées en mode réflexion pour des gains de détecteur allant de 300 à 750 V et de 300 à 750 V pour le détecteur 1 (A) et le détecteur 2 (B), respectivement. Abréviation = r.u. = unités relatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Purge spectrale. Les images ont été obtenues dans les canaux donneur, FRET et accepteur. (A) Images obtenues avec des protéines fluorescentes purifiées; barres d’échelle = 100 μm; B) des images correspondantes pour les cellules exprimant les protéines fluorescentes; barres d’échelle = 10 μm. (C) Graphiques des valeurs SBT obtenues; moyenne ± SD est donnée. Abréviations : FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster ; SBT = saignement spectral; ECFP = protéine fluorescente cyan améliorée; EYFP = protéine fluorescente jaune améliorée; LSM = microscope à balayage laser; ASBT = SBT accepteur; DSBT = SBT donneur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effets du niveau d’expression et/ou du rapport donneur-accepteur. La somme des émissions dans les canaux donneur, FRET et accepteur a été calculée par rapport à l’efficacité FRET. Cela a été fait pour VHA-E1-ECFP et VHA-C-EYFP (A), VHA-A-ECFP et VHA-a-EYFP (B), et la fusion ECFP-EYFP (C). Une régression linéaire a été effectuée; l’équation et R2 sont donnés. Abréviations : FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster ; ECFP = protéine fluorescente cyan améliorée; EYFP = protéine fluorescente jaune améliorée; VHA = sous-unité VACUOLAIRE ATPase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Saignement du donneur et de l’accepteur de l’ECFP et de l’EYFP. Les spectres des protéines fluorescentes ont été obtenus à partir de la base de données FP14. (A) Au cours des expériences d’émission sensibilisées, les vastes portions du donneur et de l’accepteur sont détectées par des photomultiplicateurs individuels, nommés PMT1 et PMT2, respectivement. L’émission ECFP est également détectable par le détecteur d’accepteur lors de l’excitation à 458 nm. Le saignement spectral du donneur calculé dans PMT2 représente 40,6 % de l’émission détectée par PMT1. (B) Le spectre d’émission de l’EYFP démontre que l’EYFP montre une excitation directe à 458 nm, ce qui est fréquemment appliqué pour l’excitation des donneurs de cyan. L’efficacité d’excitation attendue est de 9,6% de l’excitation à 514 nm. Abréviations : FP = protéine fluorescente; ECFP = protéine fluorescente cyan améliorée; EYFP = protéine fluorescente jaune améliorée; PMT = photomultiplicateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Puissance du laser et intensité du signal. Les intensités de signal de la ligne de 458 nm sont données en bleu, les intensités de signal de la ligne de 514 nm en vert. Les intensités appliquées pour l’expérience sont surlignées en gris. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Intensités des signaux pour la détermination des SBT. Les maxima enregistrés et les valeurs calculées α et β sont donnés. Abréviations : SBT = saignement spectral; LSM = microscope à balayage laser; FRET = transfert d’énergie par résonance de Förster; ASBT = SBT accepteur; DSBT = SBT donneur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Intensités du signal pour l’étalonnage. Les maxima enregistrés et les valeurs ξ calculées sont donnés. Les valeurs corrigées correspondent aux intensités du signal FRET moins SBT. Abréviations : SBT = saignement spectral; LSM = microscope à balayage laser; FRET = Transfert d’énergie de résonance de Förster. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Intensités du signal pour les mesures FRET. Les maxima enregistrés et les valeurs E sont donnés. Les valeurs corrigées correspondent aux intensités du signal FRET moins SBT. Les valeurs E étalonnées ont été calculées avec étalonnage par ξ. Abréviations : SBT = saignement spectral; LSM = microscope à balayage laser; FRET = transfert d’énergie par résonance de Förster; cal. = calibré. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La trempe du donneur et l’émission d’accepteur sensibilisée sont caractérisées par une relation linéaire qui permet le calcul du FRET basé sur le donneur ou l’accepteur. Les facteurs de linéarité correspondants sont appelés facteur G (donneur à accepteur) ou xi (accepteur à donneur), qui sont des valeurs réciproques4. La mesure de FRET entre les protéines fluorescentes par microscopie à fluorescence nécessite souvent des corrections pour le DSBT et l’ASBT en raison des larges spectres d’absorption et d’émission des protéines fluorescentes. Cependant, de nombreuses corrections dépendent d’un ASBT mesurable, qui est un facteur dans le dénominateur des équations de la section 7 du protocole, et une α = 0 donne des équations non définies5,6.
Un ajustement des intensités laser est recommandé pour éviter de tels effets. Cela permet d’utiliser des calculs basés sur l’accepteur et de détecter facilement les ratios donneur-accepteur inappropriés. Dans ce protocole, l’équation de Beemiller et de ses collègues a été appliquée, ce qui présente l’avantage d’un étalonnage simple par une seule construction de référence d’efficacité FRET connue. Le réglage des détecteurs est essentiel, en particulier lorsque deux types de détecteurs différents sont appliqués. Les données antérieures obtenues avec deux photomultiplicateurs identiques et des gains identiques ont abouti à une constante β = 0,61 pour plusieurs expériences au fil des ans7,8,9 et démontrent que l’ajustement du détecteur est avantageux pour la reproductibilité. Si les détecteurs ne permettent pas un réglage fiable, un balayage séquentiel avec un seul détecteur en mode image par image peut être une option pour éviter les biais des propriétés du détecteur.
Les mesures dans les cellules végétales sont affectées par de nombreux pigments, ce qui entraîne une absorption de la lumière d’excitation et une autofluorescence de fond. Les pigments cellulaires sont principalement excités par la lumière dans la gamme UV à bleu4,10. Cela explique l’écart entre les mesures dans les cellules et celles avec des protéines purifiées. Les protéines purifiées pourraient servir de preuve d’ajustement, car les valeurs attendues pour l’ASBT α et la DSBT β peuvent être dérivées du spectre d’absorption de l’accepteur et du spectre d’émission du donneur, respectivement (figure 6). Les valeurs de l’ASBT sont similaires dans les cellules (α = 0,094) et avec les fluorophores purifiés (α = 0,114) et proches de la valeur attendue de 0,096 en raison de la faible absorption cellulaire à 514 nm. La DSBT de β = 0,498 avec des protéines purifiées est également proche de la valeur attendue de 0,406. Le saignement spectral dépend en outre de la configuration; Les lasers à diodes de 445 ou 440 nm réduisent l’excitation directe de l’EYFP et réduisent ainsi l’ASBT. Les AOBS se caractérisent par un écart de transmission plus petit que les miroirs dichroïques. Ainsi, la détection de l’EYFP est améliorée dans la plage de 500 à 510 nm et pourrait entraîner un ASBT supplémentaire dans le canal donneur. Cependant, les propriétés spectrales de l’EYFP indiquent moins de 1% d’émission du pic maximal, compte tenu à la fois d’une excitation moins efficace et d’une faible intensité d’émission. L’écart du filtre est beaucoup plus large avec les miroirs dichroïques, ce qui entraîne une suppression supplémentaire de cette diaphonie accepteur.
L’utilisation des valeurs des protéines purifiées ne reflète pas la situation dans la cellule. Il en va de même pour l’étalonnage par le facteur ξ. Bien que le facteur d’étalonnage ait été similaire pour les deux LSM, il était beaucoup plus élevé dans les mesures avec la protéine recombinante, révélant l’impact des pigments cellulaires. Il convient de mentionner que dans ces mesures, le bruit de fond était négligeable mais détectable et n’affectait pas les intensités observées. Contrairement aux mesures de la durée de vie du donneur, les expériences d’émission sensibilisées sont sensibles au rapport donneur-accepteur, de sorte qu’un excès de donneur entraîne une diminution de l’efficacité fret.
Cependant, l’expression de la protéine a été sous le contrôle du promoteur CaMV35S dans les expériences actuelles. Ce promoteur est fréquemment utilisé pour la surexpression des protéines dans les plantes et peut entraîner des quantités non physiologiquement élevées de protéines13. Dans de telles conditions, la probabilité d’interaction augmente et des résultats faussement positifs peuvent se produire avec des concentrations de protéines plus élevées. Le traçage des intensités d’émission par rapport à l’efficacité FRET permet ensuite d’augmenter l’efficacité FRET avec une intensité d’émission croissante et permet d’évaluer les données FRET par rapport au niveau d’expression.
Il est recommandé de séparer les expériences de colocalisation à haute résolution des mesures FRET. Pour la colocalisation, des réglages optimaux sont choisis pour chaque fluorophore, tandis que pour l’enregistrement FRET, les intensités d’émission et le réglage fin par le diamètre du sténopé interfèrent avec les conditions d’image optimales. Néanmoins, la séparation des organites et les informations sur les structures subcellulaires sont toujours incluses dans les mesures FRET.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous nous assurons que tous les auteurs ont divulgué tous les conflits d’intérêts et n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les expériences ont été réalisées à la plate-forme technologique de microscopie optique (LiMiTec) de la Faculté de biologie de l’Université de Bielefeld. Ce travail a été financé par l’Université de Bielefeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well slides | Ibidi | 80821 | |
| Immersion oil Immersol W2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | refraction index of water |
| LSM 1: AxioObserver with LSM 780 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LSM 2: AxioObserver with LSM 5 scan head, confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescent Spectroscopy. Third Edition. , Springer. New York, NY. (2006).
- Clegg, R. M. Förster resonance energy transfer- FRET what it is, why do it, and how it's done. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. 33, 1-57 (2009).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., vander Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS ONE. 7, 49593 (2012).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 413 (2013).
- Gadella, T. W. J., vander Krogt, G. N., Bisseling, T. GFP-based FRET-microscopy in living plant cells. Trends in Plant Science. 4, 287-291 (1999).
- Van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86, 2517-2529 (2004).
- Seidel, T., Golldack, D., Dietz, K. J. Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Letters. 579, 4374-4382 (2005).
- Seidel, T., Schnitzer, D., Golldack, D., Sauer, M., Dietz, K. J. Organelle-specific iso-enzymes of plant V-ATPase as revealed by in vivo-FRET. BMC Cell Biology. 9, 28 (2008).
- Schnitzer, D., Seidel, T., Sander, T., Golldack, D., Dietz, K. J. The cellular energization state affects peripheral stalk stability of plant vacuolar H+-ATPase and impairs vacuolar acidification. Plant Cell Physiology. 52, 946-956 (2011).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 124672 (2012).
- Holtorf, S., Apel, K., Bohlmann, H. Comparison of different constitutive and inducible promoters for the overexpression of transgenes in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 29, 637-646 (1995).
- Seidel, T., et al. Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. Journal of Biotechnology. 112 (1-2), 165-175 (2004).
- Beemiller, P., Hoppe, A. D., Swanson, J. A. A phosphatidylinositol-3-kinase-dependent signal transition regulates ARF1 and ARF6 during FCγ receptor-mediated phagocytosis. PLoS Biology. 4, 162 (2006).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16, 277-278 (2019).
