Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

دراسات التفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام المتجانسة حبة القائم على المقايسة

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62762
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنية للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين باستخدام حبات المانحين المرتبطة بالجلوتاثيون مع مرافقين مشاركين من TPR-motif من GST وخرزات مقبولة إلى جانب ببتيد مشتق من Hsp90. لقد استخدمنا هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

Abstract

استهداف بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) - التفاعلات cochaperone يوفر إمكانية لتنظيم العمليات على وجه التحديد Hsp90 تعتمد داخل الخلايا. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية التريتريكبتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين. بروتين FK506 ملزمة (FKBP) 51 و FKBP52 هما مماثلة TPR عزر المرافقين المشاركين المشاركين في الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد مع وظائف مختلفة. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 يوفر إمكانات علاجية واعدة للعديد من الأمراض البشرية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتضخيم القرب الإنارة المقايسة متجانسة للتحقيق التفاعلات بين Hsp90 وشريكها المرافقين FKBP51 و FKBP52. أولا، قمنا بتنقية البروتينات المحتوية على TPR FKBP51 و FKBP52 في شكل الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسومة. باستخدام حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون مع البروتينات TPR-عزر GST تنصهر والخرز مقبول إلى جانب 10 مير C-محطة الببتيد من Hsp90, لقد بحثت التفاعلات البروتين البروتين في بيئة متجانسة. لقد استخدمنا هذا المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

Introduction

المرافقين الجزيئية تسهم في التوازن البروتين، بما في ذلك طي البروتين، والنقل، والتدهور. وهي تنظم العديد من العمليات الخلوية وترتبط بالعديد من الأمراض مثل السرطان والأمراض العصبية1. بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هي واحدة من أهم المرافقين الذين تعتمد وظيفتهم على التغيرات تشكيلية مدفوعة تحليل هيدروليسيس ATP وملزمة مع البروتينات العميل بوساطة المرافقين المشاركين2. على الرغم من الإمكانات الواضحة ل Hsp90 كهدف علاجي ، فإن ضبط وظيفته يمثل تحديا كبيرا. هناك العديد من مثبطات Hsp90 التي تستهدف منطقة ربط ATP N-terminal ، والتي تم تقييمها في التجارب السريرية ، ولكن لم تتم الموافقة على أي منها للتسويق3. نظرا لعدم وجود جيب ملزم ليغاند محددة جيدا4، واستهداف منطقة C-محطة Hsp90 كان نجاحا محدودا4. في الآونة الأخيرة ، تم التحقيق في تعطيل تفاعلات Hsp90-cochaperone بواسطة جزيئات صغيرة كاستراتيجية بديلة5. استهداف التفاعلات Hsp90-cochaperone لن تثير استجابة الإجهاد الخلية العامة ويوفر إمكانية لتنظيم العمليات داخل الخلايا على وجه التحديد. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية الترغيببتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين6. من 736 TPR البروتينات التي تحتوي على عزر المشروح في قاعدة بيانات البروتين البشري، ~ 20 البروتينات المختلفة تتفاعل مع Hsp90 عبر هذا الببتيد7. الجزيئات المتنافسة على MEEVD الببتيد ملزمة من شأنه أن يعطل التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين التي تحتوي على مجال TPR. يحتوي موقع ربط الببتيد على بنية ثالثة مماثلة ولكن التماثل العام بين نطاقات عزر TPR المختلفة منخفض نسبيا7، مما يوفر فرصة لتحديد الجزيئات القادرة على منع التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين في TPR-motif. من بين هذه TPR عزر المرافقين المشاركين, FK506 ملزمة البروتين (FKBP) 51 و FKBP52 هي المنظمين لمستقبلات هرمون الستيرويد (SHR) الإشارات والمشاركة في العديد من الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد بما في ذلك السرطان, الأمراض المرتبطة بالإجهاد, أمراض التمثيل الغذائي, ومرض الزهايمر8. على الرغم من أن FKBP51 و FKBP52 يشتركان > تشابه تسلسلي بنسبة 80٪، إلا أن وظائفهما تختلف: FKBP52 هو منظم إيجابي لنشاط SHR، في حين أن FKBP51 هو منظم سلبي في معظم الحالات8. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات ، على وجه التحديد منع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 ، يوفر إمكانات علاجية واعدة للأمراض ذات الصلة.

تمتطوير Luminescent Proximity Homogenous A ssay(AlphaScreen) لأول مرة في عام 1994 من قبل أولمان EF وآخرون. الآن يتم استخدامه على نطاق واسع للكشف عن أنواع مختلفة من التفاعلات البيولوجية، مثل الببتيد10،البروتين11،الحمض النووي12،RNA13،والسكر14. في هذه التقنية، هناك نوعان من الخرز (قطرها 200 نانومتر)، واحد هو حبة المانحة والآخر هو حبة المقبول. يتم شل الجزيئات الحيوية على هذه الخرز؛ تفاعلاتها البيولوجية تجلب الخرز المانحة والمقبل في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. لأن الأكسجين المفرد له عمر قصير ، فإنه يمكن أن ينتشر فقط حتى 200 نانومتر. إذا كان حبة المقبول على مقربة، مشتق ثيوكسيني يتفاعل مع الأكسجين المفرد توليد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها ضوء في 520-620 نانومتر15. إذا تعطلت التفاعلات البيولوجية ، لا يمكن أن تصل حبة المقبول وخرزة المتبرع إلى القرب ، مما يؤدي إلى تسوس الأكسجين المفرد والإشارة المنخفضة المنتجة.

هنا نحن نصف بروتوكول باستخدام هذه التقنية لفحص جزيئات صغيرة تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR المرافقين المشاركين، وخاصة FKBP51 و FKBP52. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لHsp90 المدقع C-terminus إلى حبات acceptor. يتفاعل المرافقون المشاركون في TPR الموسومون ب GST المنقى مع حبات المتبرعين المرتبطة بالجلوتاثيون. عندما التفاعل بين الببتيدات Hsp90 المشتقة وتي بي آر عزر المرافقين المشارك يجمع الخرز معا، يتم إنتاج إشارة مكبرة(الشكل 1A). إذا كانت الجزيئات الصغيرة التي تم فحصها يمكن أن تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين، سيتم تقليل هذه الإشارة مكبرة(الشكل 1B). ويمكن حساب IC50 من خلال القياس الكمي. يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل أي مرافق - تفاعلات مرافق مشارك في TPR-motif ذات أهمية كبيرة في تطوير جزيئات جديدة ، مما يمنع على وجه التحديد التفاعل بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52.

Figure 1
الشكل 1:المبدأ الأساسي لهذا المقايسة. (أ) تنقية GST-FKBP51 يتفاعل مع حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لC-terminus المتطرفة من Hsp90 إلى حبات acceptor. التفاعل بين الببتيدات المشتقة من Hsp90 ومجال TPR من FKBP51 يجعل المتبرع والخرز المقبول في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. مشتق الثيوكسيني على حبة المقبول يتفاعل مع الأكسجين المفرد ويولد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها الضوء في 520-620 نانومتر. (ب)عندما تمنع الجزيئات الصغيرة التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 ، لا يمكن للخرز المانح والمقبل الوصول إلى القرب. ثم الأكسجين المفرد مع تسوس العمر القصير ، ولا يتم إنتاج إشارة يمكن اكتشافها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة حول هذا البروتوكول في الشكل 2.

1. التعبير وتنقية GST-FKBP51 وGST-FKBP52 (الشكل 2A)

  1. البلازميدات
    ملاحظة: الحصول على استنساخ cDNA لFKBP51 الإنسان (معرف استنساخ: 5723416) وFKBP52 الإنسان (استنساخ معرف: 7474554) من اتحاد IMAGE.
    1. تضخيم الحمض النووي FKBP51 الإنسان من قبل PCR مع التمهيديات (إلى الأمام؛ 5'GGATCCATGACTACTGAGGT-3'، عكس؛ 5'-CTCGAGCTATGCCTCTCTCTCCAC-3') التي تحتوي على بامهي وXhoI يتدلى واستنساخ في ناقلات pGEX6-1 في مواقع تقييد BamHI / XhoI.
    2. تضخيم الحمض النووي FKBP52 الإنسان من قبل PCR مع التمهيديات (إلى الأمام؛ 5'-GAATTCATGAGCCGAGAGGG-3'، عكس؛ 5'CTCGAGCTATGCCTCTCTCCAC-3') التي تحتوي على EcoRI وXhoI يتدلى واستنساخ في ناقلات pGEX6-2 في مواقع تقييد EcoRI / XhoI.
      ملاحظة: إعداد رد فعل PCR وتظهر الشروط في الجدول 1 والجدول 2.
    3. تحقق من التسلسل المدرج وتحويل البلازميدات إلى الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا وفقا لبروتوكول التصنيع.
  2. التعبير عن البروتين وتنقية
    1. إضافة 25 غرام من مرق لوريا (LB) قاعدة في 1 لتر من الماء المقطر لجعل الحل LB. الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد التبريد، أضف 50 ميكروغرام/مل أمبيسلين.
    2. خذ مستعمرة من البكتيريا التي تعبر عن GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 واخلطها مع 500 ميكرولتر من محلول LB في أنبوب 1.5 مل. دوار.
    3. إضافة خليط من "1.2.2" إلى 1 لتر من حل LB في قارورة Erlenmeyer مغطاة رقائق الألومنيوم. احتضان قارورة Erlenmeyer في شاكر بين عشية وضحاها في 37 °C.
    4. حث تعبير البروتين بإضافة 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) إلى قارورة إرلينماير ومواصلة الحضانة لمدة 2 ساعة أخرى.
    5. للحصول على الكريات الخلية، والطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 15 دقيقة. أزل الناتنات الفائق.
      ملاحظة: يمكن تخزين الكريات الخلية في -20 درجة مئوية.
    6. Resuspend الكريات الخلية في 40 مل من برنامج تلفزيوني و sonicate 3 × 20 ق على الجليد. إضافة 1 mM PMSF, 1 mM EDTA, و كوكتيل مثبطات بروتيز (1 قرص) لمنع انحلال البروتين.
    7. الطرد المركزي تعليق لمدة 30 دقيقة 50،000 × ز لإزالة حطام الخلية وتطبيق supernatant على 5 مل GST فخ العمود.
    8. بعد غسل العمود مع 30 مل برنامج تلفزيوني، elute GST-FKBP51 وGST-FKBP52 مع 5 مل من الجلوتاثيون 10 mM في برنامج تلفزيوني.
    9. تركيز البروتينات على وحدة الطرد المركزي 15 مل 10.000 MWCO. لإزالة الجلوتاثيون الحر، يمر المركزات من خلال عمود PD-10 متساوية مع برنامج تلفزيوني 0.5x والتركيز مرة أخرى على جهاز الطرد المركزي مرشح.
    10. جمع الكسور المحتوية على البروتين. تحقق من البروتينات في SDS-PAGE وضبط تركيزات البروتين إلى 1 ملغم / مل.
      ملاحظة: العائد البروتين النموذجي هو 2-5 ملغم / لتر الثقافة. يمكن تخزين البروتين عند -20 درجة مئوية.

2. اقتران Hsp90 C-محطة الببتيد إلى حبات المقبول (الشكل 2B)

  1. Hsp90 إعداد الببتيد
    1. توليف عشرة حمض أميني الببتيد NH2-EDASRMEEVD-COOH المقابلة للأحماض الأمينية 714-724 من الإنسان Hsp90 بيتا isoform (UniProt معرف: P08238) من قبل خدمة توليف الببتيد.
    2. تمييع الببتيد Hsp90 في برنامج تلفزيوني إلى 1 ملغ / مل التركيز.
  2. إعداد حبات المقبول
    1. تمييع حبات المقبول غير المترافقة في PBS إلى تركيز 1 ملغم / مل ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل.
    2. قم بإجراء الغسيل عن طريق الطرد المركزي على 16,000 × ز لمدة 15 دقيقة. إزالة بعناية فائقة.
  3. الاقتران
    1. تعيين النسبة بين الخرز والببتيد كما 10:1. في أنبوب 1.5 مل يحتوي على 1 ملغ من بيليه حبة المقبول (أعدت على النحو المبين أعلاه)، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4)، 0.1 ملغ من الببتيد المخفف، 1.25 ميكرولتر من توين-20، 10 ميكرولتر من محلول 400 مللي متر من الصوديوم سيانوبوروهيدريد (NaBH3CN) في الماء.
      تنبيه: NaBH3CN سامة. استخدام غطاء الدخان والقفازات. وينبغي إعداد NaBH3CN الحل حديثا.
    2. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع نهاية الإفراط في نهاية التحريض (10-20 دورة في الدقيقة) على شاكر دوارة.
  4. رد فعل إخماد وغسل الخرز
    1. إضافة 20 ميكرولتر من محلول 1 M Tris-HCl (pH 8.0) إلى رد الفعل لمنع المواقع غير المتفاعلة. حضانة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
    2. جهاز طرد مركزي بسرعة 16,000 × غرام (أو السرعة القصوى) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه حبة في 1 مل من الحل تريس-HCl (100 mM, pH 8.0).
    3. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
    4. بعد الطرد المركزي الأخير، إعادة إنفاق الخرز في 1 ملغم/ مل في المخزن المؤقت (1 مل من 0.5 × برنامج تلفزيوني مع 0.01٪ من أزيد الصوديوم كمادة حافظة). تخزين حل حبة المقبول المترافق في ضوء 4 درجة مئوية محمية.
      تنبيه: أزيد الصوديوم سام. استخدام غطاء الدخان والقفازات.

3. الفحص التحقيق في التفاعل بين GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 وHsp90 C-محطة الببتيد، وتثبيط مع المركبات الصغيرة الكتلة الجزيئية (الشكل 2C)

  1. البروتينات الموسومة ب GST التي تتفاعل مع حبات المتبرعين بالجلوتاثيون
    1. إعداد ردود الفعل في لوحات 384 بئر.
    2. إعداد الحل الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من حبات المانحة الجلوتاثيون في برنامج تلفزيوني 0.5x، درجة الحموضة 7.4.
      ملاحظة: بعد التخزين لفترات طويلة، والخرز يستقر وتحتاج إلى دوامة.
    3. إضافة GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام/مل.
    4. احتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، سوف تتفاعل البروتينات الموسومة ب GST مع الجلوتاثيون المرفق بالخرز. لكل بئر، سيتم استخدام 22.5 ميكرولتر من هذا الخليط. ويجب تحديد تركيز الشركاء الملزمين تجريبيا. Titrate GST-FKBP51 و GST-FKBP52 واختيار التركيز الذي يعطي أفضل إشارة.
  2. إضافة مركبة
    1. جعل التخفيفات التسلسلية من مركبات الاختبار في DMSO.
      ملاحظة: عادة ما تكون التركيزات المستخدمة 10 و30 و100 و300 و1000 و3000 ميكرومتر.
    2. إضافة 0.25 ميكرولتر من DMSO (التحكم السلبي) أو Hsp90 C-محطة الببتيد (التحكم الإيجابي، 30 ميكرومتر) أو مركبات في DMSO إلى زاوية كل بئر من لوحة. استخدام ثلاثية لكل تركيز مركب.
    3. إضافة 22.5 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على حبات المانحة الجلوتاثيون مع البروتينات GST الموسومة إلى كل بئر.
    4. يهز لوحة بلطف مع اليد ولكن بدقة. احتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: خلال هذا الوقت، سوف تتفاعل المركبات مع مجال TPR في موقع ربط الببتيد C-terminal Hsp90.
  3. إضافة حبات مقبولة
    1. تمييع الخرز المقبول مع الببتيد Hsp90 C-terminal المرفقة إلى 100 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني 0.5x.
    2. إضافة 2.25 ميكرولتر من حبات المقبول المخفف إلى كل بئر.
    3. تخلط بلطف ولكن بدقة. احتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم إحضارها من قبل المانحين والخرز المقبول في القرب من التفاعلات البروتين الببتيد. الحجم النهائي لخليط التفاعل هو 25 ميكرولتر. لذلك، تتراوح التركيزات النهائية للمركبات من 0.1 إلى 30 ميكرومتر.
  4. قراءة اللوحة
    ملاحظة: قراءة لوحة باستخدام قارئ لوحة تعيين في الوضع ذي الصلة.
    1. تشغيل الأداة وفتح البرنامج
    2. اختر البروتوكول ذي الصلة.
    3. انقر فوق تحرير خريطة اللوحة وحدد البئر المستخدم في اللوحة للقياس.
    4. انقر فوق التالي للمتابعة وتشغيل البروتوكول المحدد.
    5. بعد القياس، انقر فوق إظهار النتائج لعرض النتائج.
    6. تصدير البيانات.

4. تحليل البيانات

  1. Z' عامل و إشارة إلى خلفية (S / B) نسبة
    1. حساب عامل Z ونسبة S/B للمقاايسة باستخدام المعادلة التالية:
      Z'=1-(3σpos+3σneg)/ستينيμpos-μ negستيني عشر
      S/B=μneg/μpos
      حيث σ μ تمثل الانحرافات المعيارية والوسائل الإيجابية (Hsp90 C-محطة الببتيد، 30 ميكرومتر) والسلبية (DMSO) الضوابط، على التوالي. عامل Z > 0.5 سيضمن أن المقايسة قوية بما يكفي للفحص. لمراقبة حساسية المقايسة، تم حساب نسبة S/B أيضا.
  2. منحنى الاستجابة الجرعة وIC 50
    ملاحظة: استخدم تحليل الانحدار غير الخطي لاحتواء بيانات مثبطات مؤشر أسعار المنتجين Hsp90-cochaperones حسب البرامج.
    1. إنشاء جدول بيانات XY في الحوار الترحيب وحدد X أرقامو Y Enter 3 (إذا ثلاثية) نسخ القيم في أعمدة جنبا إلى جنب.
    2. تطبيع بيانات إشارة العينات إلى مجموعة التحكم السلبية. استيراد قيم التركيز إلى العمود X وقيم الإشارة إلى العمود ص.
    3. انقر على تحليل واختيار تحويل التركيز (X) ضمن تحويل | تطبيع. اختر تحويل إلى لوغاريتمات.
      ملاحظة: هذا سيتم تحويل التركيز إلى مقياس سجل. إذا كان تركيز البداية صفرا، قم بتعيينه إلى رقم صغير جدا يكون صفرا فعليا (على سبيل المثال، 0.1 nM) بحيث لا يفقد تلك القيم نظرا لعدم تعريف لوغارتم الصفر.
    4. انقر فوق تحليل واختيار الانحدار غير الخطي (منحنى تناسب) تحت التحليلات XY، افتح الجرعة - الاستجابة - تثبيط واختيار سجل (المانع) مقابل الاستجابة -- المنحدر المتغير.
    5. انقر فوق موافق لعرض النتائج (التي تحتوي على قيمةIC 50) والرسوم البيانية.

Figure 2
الشكل 2: تخطيطي لهذا البروتوكول. (أ) التعبير وتنقية من GST-FKBP51 وGST-FKBP52. (ب) اقتران Hsp90 C-محطة الببتيد إلى الخرز مقبول. (ج)الفحص الذي يتحرى التفاعل بين GST-FKBP51 أو GST-FKBP52 وHsp90 C-terminal الببتيد. تثبيط مع مركبات الكتلة الجزيئية الصغيرة. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في المقايسة لدينا، عامل Z ونسبة S/ B هي 0.82 و 13.35، على التوالي(الشكل 3A)،مما يدل على أن لدينا المقايسة قوية وموثوق بها لفحص عالية الإنتاجية. ثم استخدمناه لفحص المركبات الجزيئية الصغيرة. الشكل 3B يقدم تثبيط تعتمد على الجرعة من التفاعلات المرافقين-cochaperone مع جزيء صغير مختارة (D10). يتم إنشاء منحنيات الجرعة والاستجابة ل D10 من خلال تحليل الانحدار غير الخطي ، والذي يتم على أساسه حساب قيم IC50. D10 يظهر تثبيط تعتمد على الجرعة على حد سواء على Hsp90 - GST-FKBP51 وHsp90 - GST-FKBP52 PPIs. ولكن قيم IC50 مختلفة:تفاعلات IC 50 ل Hsp90 - GST-FKBP51 هي 65 nM ، في حين أنه بالنسبة لتفاعلات Hsp90 - GST-FKBP52 ، لم يتحقق التثبيط الكامل مع أعلى تركيز مركب (100 ميكرومتر) ، ويقدر أن IC50 > 30 ميكرومتر. تقدم هذه النتائج أدلة على أنه يمكن تحقيق تثبيط انتقائي ل Hsp90-HKBP51 أو Hsp90-FKBP52 PPIs مع جزيئات صغيرة (نطاقات TPR من FKBP51 و FKBP52 لها هوية تسلسل 60٪ > تشابه تسلسل 80٪)، ويمكن تطبيق هذا المقايسة لهذا الفحص.

Figure 3
الشكل 3: تحليل الفحص والنتائج. (A) Z ' عامل ونسبة الإشارة إلى الخلفية (S / B) من هذا المقايسة. وتمثل البيانات إشارات للتحكم الإيجابي (Hsp90 C-terminal الببتيد، 30 ميكرومتر) و(●) التحكم السلبي (DMSO) من 48 بئرا. تم حساب قيمة Z 0.82 ونسبة S/B 13.35 من هاتين المجموعتين من البيانات. (ب)تثبيط مركب مختار (D10) على تفاعلات Hsp90 مع FKBP51 (●) أو FKBP52 (○) في هذا المقايسة. D10 يمنع Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 تعتمد على الجرعة. في IC50 هو 65 nM للتفاعل Hsp90-FKBP51 ولكن فوق 30 ميكرومتر للتفاعل Hsp90-FKBP52. يتم تطبيع البيانات إلى مجموعة التحكم ويتم التعبير عنها كوسيلة ± SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكون رد الفعل حجم الصوت (ميكرولتر)
PCR العازلة (5 × التركيز) 4
التمهيدي الأمامي 1
التمهيدي العكسي 1
بلازميد 0.5
مزيج dNTP (10 mM لكل منهما) 0.5
فوسيون دي إن أي بوليمراز 0.5
المياه (درجة الحمض النووي) 12.5
مجموع 20

الجدول 1: تفاعل PCR الذي تم إعداده لتضخيم الحمض النووي FKBP51 و FKBP52 البشري.

مرحلة درجة الحرارة (°C) الوقت دورات
التشبع الأولي 94 3 دقائق 1
التشبع 94 30 ثانية 35
الصلب 56 30 ثانية
امتداد 72 دقيقة واحدة
التمديد النهائي 72 5 دقائق 1
ملاحظة: درجة حرارة الغطاء 105 °C .

الجدول 2: ظروف الترموسيكلر لتضخيم الحمض النووي البشري FKBP51 و FKBP52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نصف بروتوكول باستخدام المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين ، وخاصة FKBP51 و FKBP52. درجة Z العالية (>0.8) توضح متانة وموثوقية تنسيق عالي الإنتاجية. يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، وهناك حاجة إلى كميات صغيرة من الخرز والبروتين والمركبات. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل أي تفاعلات ذات أهمية مشتركة بين Hsp90/Hsp70 و TPR-motif. وقد تورط العديد من المرافقين TPR عزر المشارك من Hsp90 في مختلف الاضطرابات البشرية التي تتراوح بين مرض الزهايمر لأمراض المناعة الذاتية والسرطان، الخ. يوفر البروتوكول الموصوف هنا فحصا قويا وغير مكلف في المختبر لفحص عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين المرافق والكوتشبيروني ذات الأهمية الطبية العالية.

وبالإضافة إلى ذلك، يجب تقييم الأدوية التي تستهدف مجالات TPR وتثبيط التفاعل مع Hsp90 ليس فقط لانجذابها نحو الهدف ولكن أيضا لاختيارها تجاه البروتينات الأخرى التي تحمل شعار TPR. يقوم الجينوم البشري بترميز > 20 بروتينا من بروتينات عزر TPR قادرة على التفاعل مع الببتيد Hsp90 C-terminal. هذا المقايسة باستخدام حبات الجلوتاثيون والبروتينات الموسومة GST يسمح بتقييم تأثير الدواء على شركاء TPR ملزمة متعددة. مختبرنا يمتلك مكتبة من 20 البروتينات TPR الإنسان في شكلها GST الموسومة ويمكن الحصول على ملامح التقارب والانتقائية لكل جزيء صغير اختبارها.

وقد ثبت سابقا أن PPI بين Hsp90 و TPR المرافقين المشتركين بوساطة الببتيد C-المحطة الطرفية من Hsp90; حذف Hsp90 C-terminus يلغي تماما الربط من TPR-عزر المرافقينالمشاركين 6. لقد وجدنا أن المركبات الفعالة في المقايسة لدينا حيث تم استخدام الببتيد Hsp90 C-المحطة الطرفية كانت أيضا قادرة على منع التفاعل بين Hsp90 كامل الطول مع GST-FKBP51/52 في المقايسة المنسدلة باستخدام حبات الجلوتاثيون سيفاروز (البيانات غير مبينة). كما تظهر بعض المركبات المختارة التقارب الملزم مع FKBP51 بواسطة تقنية الرنين السطحي البلازمون ، ويجري حاليا التحقيق في مواقع الربط المحددة التي تحددها التبلور المشترك.

وخطوة حاسمة في بروتوكولنا هي ترتيب الإضافة؛ وأهمية الأهمية التي يمكن أن تتواءم مع الأهمية التي يمكن أن تتواءم مع الأهمية التي يمكن نحن أول تشكيل مجمع بين جزيء صغير وهدفه TPR. إذا تم بالفعل تشكيل مجمعات بين FKBP51 وHsp90 C-محطة الببتيد، ويلزم أوقات حضانة أطول وتركيزات مركبات المخدرات أعلى لكسر PPIs. ويرجع ذلك في الغالب إلى العائق النتن للخرزة التي تحد من وصول الجزيئات إلى موقع التفاعل.

فمن الممكن أن الزوجين بشكل متناقض بروتينات TPR والببتيدات Hsp90 C-المحطة إلى الخرز المانحة والمقببولة، على التوالي، والتحقيق مباشرة PPIs. ومع ذلك ، لا ينصح بإرفاق كلا الشريكين الملزمين بالخرز بسبب انخفاض حركة الجزيئات في المحلول الذي يؤثر على حركية التفاعلات. وهذا يزيد أيضا من خطر العوائق steric بسبب حجم حبة. لذلك ، نختار حبات المقبولين إلى جانب الببتيد Hsp90 C-terminal والخرز المانح الجلوتاثيون التي تتفاعل مع البروتينات الموسومة ب GST في مقايستنا ، حيث يمكن تقييم العديد من شركاء TPR.

في هذا المقايسة، من المحتمل أن تكون بعض المركبات المحددة إيجابية زائفة بسبب تداخلها مع تقنية الفحص، مثل إخماد الأكسجين المفرد، وإرواء الضوء، وتناثر الضوء. يمكن أيضا أن تكون النتائج الإيجابية الكاذبة عن طريق تعطيل ربط علامة GST مع حبات المانحة الجلوتاثيون. يمكن تجنب هذه النتائج الإيجابية الكاذبة عند فحص جزيئات كل من Hsp90-FKBP51 و Hsp90-FKBP52 PPIs لتحديد مثبطات انتقائية. وينبغي أيضا تطبيق طرق أخرى للكشف عن مؤشرات أسعار المنتجين للتحقق من المثبطات المحددة.

الحد من المقايسة لدينا هو أنه لا يمكن استخدامها للكشف عن التفاعل بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين في العينات البيولوجية الخام، مثل lysates الخلية. بعد الفحص عالي الإنتاجية ، يجب التحقق من موانع مركبات مختارة على Hsp90 - TPR-motif المشارك في مرافق PPI في العينات البيولوجية بطرق أخرى ، مثل التواء المناعة المشتركة وتقييس ربط القرب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من مجلس البحوث السويدي (2018-02843) ومؤسسة الدماغ (Fo 2019-0140) ومؤسسة أمراض الشيخوخة في معهد كارولينسكا ومؤسسة غونفور وجوزيف أنيرز ومؤسسة ماغنوس بيرغفالس ومؤسسة غون وبيرتيل ستونيس ومؤسسة توري نيلسون للأبحاث الطبية ومؤسسة مارغريتا إيه أوغلاس ومؤسسة الخدم القدامى.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 173، AlphaScreen، تفاعلات البروتين البروتين، المرافق الجزيئي، Hsp90، FKBP51، FKBP52، بروتينات TPR، فحص المركب
دراسات التفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام المتجانسة حبة القائم على المقايسة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R.,… More

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter