Summary
이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.
Abstract
단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 고해상도 구조 측정을 위해 전자를 사용한 이미징 생물학적 표본은 관심있는 생체 분자를 포함하는 유리체 얼음의 얇은 층을 필요로한다. 구조 생물학의 최전선에 단일 입자 극저온을 추진 한 최근 몇 년 동안 수많은 기술 진보에도 불구하고, 표본이 고해상도 이미징을 위해 유리화되는 방법은 종종 속도 제한 단계로 남아 있습니다. 최근 수많은 노력이 새로운 샘플 지원 및 혁신적인 유리화 계측의 개발을 포함하여 표본 병보 시 자주 발생하는 장애물을 극복하는 수단을 제공했지만, 기존의 수동으로 작동하는 플런서는 구매 비용과 운영 편의성으로 인해 냉동 EM 커뮤니티의 필수품으로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 단일 입자 극저온에 의한 고해상도 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동을 위해 표준, 기로틴 스타일의 수동으로 작동하는 블롯 및 플런지 장치를 사용하기위한 상세한 방법을 제공합니다. 또한 표준 준비가 적합한 시편을 산출하지 못하는 경우 일반적으로 발생하는 문제와 문제 해결 권장 사항도 설명되어 있습니다.
Introduction
단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)은 동적 생물학적 표본의 구조를 거의 원자 분해능1,2,3,4로 해결하는 데 사용할 수 있는 강력한 구조 기술입니다. 실제로, 최근 직전자 검출기 기술의 발전4,5,6,7,8,9,10, 전자 소스의 개선4,11,12,13,14, 전자기 렌즈 안정성15, 데이터 수집의 지속적인 개발과 함께 16,17 및 분석 소프트웨어 패키지18,19, 연구원은 지금 정기적으로 3 Å 해상도 또는 더 나은 에 잘 행동 표본의 구조를 결정할 수 있습니다4,11,13,14,20,21,22,23 . 이러한 향상된 이미징 및 데이터 처리 기능에도 불구하고 cryoEM 그리드 준비는 성공적인 고해상도 구조 측정을 위한 가장 큰 장애물로 남아 있으며 EM 워크플로224,25,26,27에서 상당한 병목 현상역할을 합니다.
CryoEM은 기본 생화학 상태를 보존하는 "유리와 같은" 얼음의 박막을 형성하기 위해 동결된 수성 용액에서 생물학적 시료의 이미징에 의존합니다. 극저온에 대한 생물학적 시료의 진동은 40년 이상 거슬러 올라가며, 이 공정을 위해 개발된 많은 기술과 장비는 원래 상세한 블롯 및 플런지 방법에 의존하여 31,32,33,34,35에 의존합니다. , 이에 의하면 소량의 샘플(예를 들어, 1-5 μL)이 전문화된 EM 그리드에 적용되어 초과 용액이 블로팅 페이퍼와 그리드의 물리적 상호 작용을 이용하여 제거된다. 이 과정의 타이밍은 일반적으로 각 시편에 대해 실증적으로 결정되며, 동결 시료의 중요한 성분은 유리체 얼음 필름의 두께입니다 - 얼음이 너무 두꺼워지면 너무 얇은 얼음이 너무 얇아단백질 배향을 제한하고/또는 그리드 호일 홀의 중심에서 입자를 배제할 수 있는 동안 이미징 품질이 급격히 저하됩니다36 . 단일 입자 극저온에 대한 완벽한 얼음 두께에 대한 이러한 의존은 로봇 공학 37,38, 미세 유체 42, 초음파 또는 살 포 장치 27,39,40,41,42,43,44 를 포함하여 샘플을 동결 할 수있는 다양한 기술과 장비를 주도하고있다 . 최근 몇 년 동안 가장 인기있는 샘플 준비 장치 중 일부는 블롯 및 플런지 기술을 사용하여 샘플의 자동 동결을 위한 로봇 공학의 사용에 의존합니다45. 이러한 장치는 이미징에 적합한 얼음 두께를 재현적으로 생성하도록 설계되었지만 개별 실험실에서 구매 및 작동하기에는 비용이 너무 많이 들며 일반적으로 사용량을 위해 시간당 가격으로 극저온EM 시설에서 발견됩니다. 최근 몇 년 동안, 원래 수동 블롯 및 플런지 기술은 증가 사용으로 돌아왔다3,47,48,49,50,51,52. 실제로 수동으로 작동하는 블롯 앤 플런지 장치는 로봇 대응 비용의 일부만으로 고품질 극저온엠 그리드를 달성할 수 있습니다. 또한 수동 블로팅은 연구원이 블로팅 유형(즉, 그리드의 백 블로팅, 그리드의 전면 블로팅 등)을 조정할 수 있으며 각 개별 샘플 및 연구 질문에 따라 시간을 낭비할 수 있기 때문에 더 많은 사용자가 블로팅에 대한 제어력을 제공합니다.
이 문서에서는 맞춤형 드워 플랫폼53과 결합된 기존의 수동 블롯 및 플런지 진동 장치를 사용하여 생물학적 샘플을 효과적으로 동결하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 극저온, 그리드 처리, 샘플 응용 프로그램 및 블로팅 을 포함한 모범 사례뿐만 아니라 이러한 장애물을 극복하는 방법에 대한 일반적인 함정 및 권장 사항이 제공됩니다. 그리드 제제 간의 얼음 두께 재현성을 높이는 방법과 생물학적 표본 유형에 따라 샘플 블로팅을 수정하는 방법에 대한 조언이 논의됩니다. 이 원고에 설명된 수동 플런저의 구매 및 작동과 관련된 저렴한 비용을 감안할 때, 전 세계 실험실은 비용 효율적이고 재현 가능한 방식으로 극저온에 대한 생물학적 표본을 준비할 수 있습니다.
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Protocol
1. 수동 급락 환경 준비
참고: 예상 작동 시간: 5-30분
- 가습기가 공동 배치될 수 있는 4°C 콜드룸에서 수동 플런저를 찾아 100% 상대 습도(RH) (도 1A)에 가깝게 방을 유지한다.
주의: 수동 플런저 및 권장 작업의 안전한 위치에 대한 기관의 환경 보건 및 안전 지침에 문의하십시오. - 그리드 준비 에 앞서, 차가운 방의 RH가 95 %≥ 보장하기 위해 차가운 방에서 가습기를 켭니다.
참고: 습도가 낮은 그리드 준비는 박막의 탈수, 증발로 인한 완충 부품의 변경, 그리드-그리드-그리드 재현성의 감소를 초래할 수 있습니다. <80 % RH에서 그리드를 동결하지 않는 것이 좋습니다. - 차가운 방의 온도가 4 °C에 있는지 확인하십시오.
- 그리드 근처의 난기류 및/또는 차가운 표면에 눈에 띄는 얼음 축적으로 이어질 수 있는 강력한 공기 전류(예: 에어컨 장치 통풍구에서 멀리 떨어진)에서 수동 플런저를 찾습니다.
2. 급락 재료 및 액세서리를 준비
참고: 예상 작동 시간: 1-5분
- 깨끗한 가위를 사용하여 얼룩진 종이 원을 너비 1-1.5cm및 ~9cm 길이 스트립으로 자른다. 얼룩진 용지의 중앙을 만지지 말고 작은 끝 조각을 버리십시오. 얼룩진 종이 스트립이 건조하고 깨끗하며 오염 물질이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 스트립을 분리하고 100mm 페트리 접시에 넣습니다.
- 22x22 mm 사각 유리 커버 슬립을 별도의 60mm 유리 페트리 접시에 넣습니다. 커버슬립이 함유된 유리 페트리 접시는 그리드를 저장, 전송 및 광발 배출 그리드에 사용합니다.
참고: 그리드를 추가하기 전에 슬라이드에서 눈에 보이는 이물질을 제거하기 위해 공기 더스터 캔을 사용하는 것이 좋습니다. 정전기 방지 총을 사용하여 축적되는 정전기를 제거할 수도 있습니다. - 그리드 스토리지 박스를 조립하고 레이블을 지정합니다.
- 4~6개의 깨끗하고 건조한 클램핑 핀셋을 획득하여 수동 플런저에 배치합니다. 각 트위저(tweezer)가 급락하기 전에 각 트위저를 검사하여 손상되지 않고 오염물질이 없는지 확인합니다.
3. 극저온 드워프 및 수동 플런저를 준비
참고: 예상 작동 시간: 5-15분
- 급락 하는 dewar의 하단에 플랫폼 베이스를 설치 합니다. 에탄 용기의 탈전을 플랫폼 베이스 위에 놓고 황동 에탄 용기를 추가한 다음 회전 그리드 저장 플랫폼을 설치합니다.
- 액체 질소(LN2)가 급락하는 데워에 추가되면 플랫폼 베이스의 높이를 더 이상 조정할 수 없습니다. 그리드 베이스가 제대로 설치되고 부적절한 플런저 높이로 인해 그리드 및/또는 트위저 손상을 제한하는 레벨이 있는지 확인합니다.
- 동결하기 전에 수동 플런저 및 모든 보조 장비를 확인하여 샘플 및/또는 그리드 손실을 제한하기 위해 제대로 작동하는지 확인합니다.
- 각 동결 세션 에 앞서 핀셋을 고정하는 데 사용되는 수동 플런저 암의 테이프를 교체합니다. 방의 습도가 높으므로 테이프 접착제가 악화되고 테이프가 핀셋을 보유할 수 있는 능력을 감소시켜 트위저 손상 및/또는 그리드 손실 가능성을 높일 수 있습니다.
- 수동 플런저 근처에서 램프를 조정하여 샘플 사양을 모니터링하고 그리드 손상 및/또는 손실을 방지하기 위해 그리드 전송이 쉽게 시각화되도록 합니다(3.7단계 참조). 플런저 바로 뒤에 있는 링 램프를 사용하여 액체 움직임을 시각화하고 데워 근처의 유연한 암 작업 라이트를 사용하여 냉동 그리드를 비춥춥춥습니다.
- 발 페달 텐션을 조정하여 전후 플런징 암이 올려진 위치에 있는 동안 제자리에 단단히 고정되고 페달이 우울할 때 완전히 해제되도록 합니다. 플런서가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 샘플 응용 프로그램 전에 여러 "건조"실행을 수행합니다.
참고: 발 페달 장력의 부적절한 조정은 급락하는 팔(즉, 장력이 너무 낮게 설정)과 그리드 손실 또는 그리드의 불완전한 급락을 에탄 용기로 조기에 방출하게 됩니다(즉, 장력이 너무 높게 설정됩니다). - 급락하는 데워를 수동 플런저 의 바닥에 놓고 급락하는 팔 바로 아래에 고정하십시오. 첨부 된 테이프를 사용하여 플런징 암에 핀셋 한 쌍을 부착합니다. 수동 급락 팔을 들고있는 동안, 조심스럽게 급락 팔을 낮추고 그리드가 에탄 선박의 중간 내에서 위치 할 수 있도록 급락 팔의 이동을 조정하기 위해 발 페달을 누르고.
- 플런징 암 의 상단에 범프 정지를 사용하여 발 페달이 완전히 우울 할 때 급락 팔의 최종 위치를 결정합니다 (그림 1B). 급락하는 암의 범프 정지 높이를 조정하여 에탄 용기의 그리드 위치를 조정합니다(도 1C).
참고: 급락하는 팔 높이를 부적절하게 설정하면 그리드 및/또는 트위저 손상(예: 급락팔 높이가 너무 낮게 설정) 또는 부적절한 진동(예: 급락팔 높이가 너무 높게 설정)으로 이어질 수 있습니다. - 차가운 방 밖에서 탈파를 찾아 액체 에탄 (4 단계)을 준비합니다.
4. 저온질 준비
참고: 예상 작동 시간: 10-30분
- 손상 의 흔적에 대한 에탄 탱크, 레귤레이터, 튜브 및 에탄 분배 팁을 평가합니다. 진행하기 전에 즉시 보고하고 손상의 흔적을 수정합니다.
주의: 압축 된 에탄 및 에탄 가스 혼합은 인화성이며 부적절하게 처리될 경우 생명 및 / 또는 부상을 초래할 수 있습니다. 압축 가스 탱크를 작동하거나 처리하는 방법을 잘 모르는 경우 전문가에게 문의하십시오. 인화성 압축 가스를 취급할 때 는 기관의 환경 보건 및 안전 지침을 참조하십시오. 또한 액화 에탄은 제대로 처리되지 않으면 생명 및 / 또는 부상에 심각한 위협이 될 수있는 강력한 극저온입니다. 냉동물질 취급 시 기관의 환경 보건 및 안전 지침을 참조하십시오. - 적절한 LN2 처리 드워에서 충분한 LN2를 획득하십시오(즉, 3-4 L은 그리드 준비 및 저장에 일반적입니다).
주의: LN2 는 제대로 처리되지 않으면 생명 및/또는 부상에 심각한 위협이 될 수 있는 극저온입니다.- 부상 위험을 최소화하기 위해 모든 개인 보호 장비를 활용해야 합니다. LN2 의 증기는 질식이며 통풍이 잘 되는 지역에서 처리되어야 합니다. 극저온 선박과 극저온을 어떻게 조작하거나 처리하는지 확실하지 않은 경우 전문가에게 문의하십시오. 냉동물질 취급 시 기관의 환경 보건 및 안전 지침을 참조하십시오. 차가운 방에서 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 시원하고 통풍이 잘 되는 공간에서 동결을 하는 것이 좋습니다.
- 차가운 방 밖에서 액체 질소 수준이 에탄 용기의 상단에 도달 할 때까지 황동 에탄 용기에 LN2 를 직접 부어 급락 데워를 식히십시오 (즉, 플랫폼 바로 위에). 필요에 따라 에탄 선박 외부의 LN2 를 위로 합니다. LN2 가 격렬하게 버블링을 중지할 때 다음 단계로 진행하십시오(약 5분).
- 에탄 가스를 응축하기 전에 선박을 충분히 냉각시키기 위해 황동 에탄 용기에 LN2 를 직접 추가합니다. 황동 에탄 용기를 제대로 식히지 못하면 에탄을 응축하는 데 걸리는 시간이 크게 증가합니다.
- 과열이 LN2 온도에 도달하면 LN2 가 에탄 용기로 유출되는 것과 같은 분해를 과도하게 채우는 것을 피하십시오.
- 에단은 압축 가스로 제공되며 사용하기 위해 액화해야합니다. 에탄 탱크는 고순도 이중 단계 레귤레이터를 사용하여 가스 흐름을 제어합니다. 튜브를 레귤레이터 콘센트 밸브에 연결하고 끝에 연결된 14 게이지 플랫 금속 디스펜싱 팁을 사용하여 에탄을 분배합니다.
- 에탄 주 탱크 밸브를 열기 전에 노브와 콘센트 밸브를 조정하는 압력이 끝까지 닫혀 있는지 확인하십시오. 메인 탱크 밸브를 완전히 열고 콘센트 밸브를 ~50%로 엽니다. 느린 가스 흐름이 관찰될 때까지 압력 조정 노브를 천천히 엽니다. 출구 밸브를 사용하여 가스 흐름을 미세 조정합니다.
주의: 밸브를 열거나 가스 흐름을 조정할 때 금속 분배 팁을 항상 자체에서 가리킵니다. - 에탄 가스 라인의 끝을 탈온화 물의 작은 비커에 삽입하여 가스 흐름을 천천히 시작하고 유량을 평가합니다. 유량이 물을 적당히 방해할 때까지 가스 흐름을 조정합니다.
- 적절한 에탄 응축이 발생하는지 확인하기 위해 가스 유량을 조정 - 유량이 너무 느려서 에탄 가스가 디스펜싱 팁에서 고화되고 유량이 너무 빠면 강렬한 버블링이 발생하고 동결을 방지합니다.
- 황동 에탄 용기에 에탄 가스 라인의 끝을 삽입하기 전에, 깨끗한 깨끗한 물을 제거하기 위해 섬세한 작업 물티슈로 디스펜싱 팁을 닦아.
- 부드럽고 빠른 움직임으로 황동 에탄 용기 의 바닥에 가스 분배 팁을 찾아 에탄 용기의 바닥 주위의 느린 원에서 분배 팁을 이동하기 시작합니다. 고체 에탄은 즉시 형성되지만 더 많은 에탄 가스가 추가 / 응축됨에 따라 신속하게 액화됩니다.
- 고체 에탄을 액화하기 위해 에탄 용기의 바닥에 금속 에탄 분배 팁을 계속 이동합니다. 에탄 용기를 액체 에탄으로 가득 3/4로 채웁니다 (상단에서 2-3 스레드). 황동 에탄 용기에서 금속 에탄 디스펜싱 팁을 조심스럽게 제거하고 출구 밸브를 닫아 에탄 가스 흐름을 중지합니다.
- LN2가 황동 에탄 용기에 LN2 를 추가하지 않도록 데워의 측면에 부드럽게 붓는 LN2와 함께 급락 하는 데워에서 상단, 액체 레벨그냥 황동 에탄 용기에 닿을 때까지. 에탄 응고를 용이하게하기 위해 급락 하는 데워에 거품 뚜껑을 놓습니다.
- LN2는 에탄의 고화에 도움이 황동 에탄 선박에 직접 문의해야합니다. 약 5분 후, 황동 용기 내의 에탄은 완전히 고체가 됩니다. 에탄 용기에 닿을 때까지 LN2를 더 추가하고 다음 단계로 진행합니다.
- 에탄이 고체로 얼지 않은 경우 황동 에탄 용기는 나머지 단계에 대해 충분히 춥지 않습니다. 에탄 용기에 닿을 때까지 LN2 를 더 추가하고 추가로 5분 간 기다립니다. 황동 용기 내의 에탄이 완전히 고체로 고정되어 있는지 확인합니다.
- 가스 배출구 밸브를 열어 4.6 단계에서 결정된 것과 유사한 속도로 에탄 가스 흐름을 생성합니다. 금속 에탄 분배 팁을 고체 에탄에 수직으로 배치하고 고체 에탄을 녹이기 위해 원형 동작으로 에탄 분배 팁을 계속 이동합니다.
- 황동 에탄 용기의 상단과 레벨이 될 때까지 에탄을 계속 추가합니다. 에탄 용기에서 팁을 천천히 제거하고 에탄 탱크 출구 밸브를 닫습니다. 에탄이 황동 에탄 용기의 가장자리 주위에 고공하게 하려면 뚜껑으로 데워를 ~1-4분 간 덮습니다.
참고: 이상적인 에탄 용기는 중앙에 액체 에탄이 있는 황동 에탄 용기의 둘레에 2-3mm 대칭 고리가 있습니다(도 1D 및 도 2). - 생물학적 시편의 적절한 진동을 보장하기 위해 응고하지 않고 에탄이 가능한 한 추워야 합니다. 액체 에탄을 제대로 준비하지 못하면 시편의 부적절한 진동, 얼음 축적 및/또는 시편의 손실이 발생할 수 있으며, 각 시편은 이미징시 시편 품질의 저하에 기여할 수 있다.
- 2-3분 후에 단단한 에탄 링이 형성되지 않으면, 데워에 LN2 를 더 추가하고 2-5분 동안 덮습니다.
- 에탄이 너무 빨리 고화되는 경우, 깨끗한 핀셋의 큰 쌍을 사용하여 에탄 용기 및 / 또는 고체 에탄을 부드럽게 데워 완전한 에탄 고화를 방지합니다. 에탄과 LN2 가 안정되면 모든 에탄 탱크 밸브를 닫고 수동 플런저에 급락 하는 데워를 찾습니다. 수동 플런저에 급락 디워를 확보합니다.
주의: LN2 가 에탄 용기에 유출되어 액체 에탄을 고화시킬 수 있기 때문에 데워를 옮길 때 는 주의하십시오. 필요한 경우 깨끗한 핀셋 세트를 사용하여 혈관 한가운데에 있는 고체 에탄을 녹일 수 있습니다.
- 황동 에탄 용기의 상단과 레벨이 될 때까지 에탄을 계속 추가합니다. 에탄 용기에서 팁을 천천히 제거하고 에탄 탱크 출구 밸브를 닫습니다. 에탄이 황동 에탄 용기의 가장자리 주위에 고공하게 하려면 뚜껑으로 데워를 ~1-4분 간 덮습니다.
- 에탄 데워의 위치를 빈 핀셋으로 테스트하여 트위저 팁이 에탄 용기의 중앙에 위치하고 액체 에탄 내부의 그리드 및 트위저 팁에 충분한 공간이 있는지 확인합니다(그림 1D).
- 고체 에탄 링이 너무 두꺼워그리드 핸들링이 용이한 경우 실온을 사용하여 핀셋을 청소하여 고체 에탄을 녹이고 에탄 용기 의 중앙에 더 많은 동결 영역을 만듭니다.
5. EM 그리드 준비
참고: 예상 작동 시간: 1-5분
- 그리드 저장 상자(es)를 디워전에 추가하고 그리드 스토리지 박스 뚜껑을 풀고 각 뚜껑이 새 그리드 슬롯으로 자유롭게 회전할 수 있는지 확인합니다.
- 그리드 스토리지 박스에서 슬라이드 가장자리에서 그리드의 ~30-40%를 사용하여 사각형 유리 커버슬립가장자리로 그리드를 조심스럽게 전송합니다. 그리드 호일이 위면한지 확인합니다. 사용하지 않을 때그리드가 보장되는지 확인합니다. 사각형 유리 커버슬립의 가장자리에 그리드를 배치하면 그리드 처리가 용이하며 전송 중에 그리드가 구부러지거나 손상될 가능성이 줄어듭니다.
참고: 4-6 그리드는 일반적으로 한 번에 제조됩니다. - 글로우 방전기 또는 플라즈마 클리너를 사용하여 전력망을 친성적으로 렌더링합니다.
참고: 글로우 방전기/플라즈마 클리너 제조업체에서 제공하는 그리드 청소에 권장되는 지침을 참조하십시오.- 그리드가 친수성을 잃고 그리드 대 그리드 재현성이 감소함에 따라 플라즈마 세척 후 10분 이내에 그리드를 사용합니다.
6. 급락 동결에 의해 냉동EM 표본을 준비
참고: 예상 작동 시간: >10분(그리드당 1~3분)
- 깨끗하고 건조한 클램핑 트위저를 사용하여 청소 된 그리드를 선택하고 플라스틱 클램프를 아래로 밀어 그리드를 고정하고 핀셋을 부드럽게 눌러 그리드가 제대로 고정되도록하십시오.
- 그리드 호일의 손상을 방지하기 위해 외부 링으로 그리드를 처리합니다.
- 그리드의 준비된 측면(예: 전면 또는 호일 측)에 1~5μL의 시료를 적용합니다.
참고: 최적의 볼륨 및 블로팅 시간은 샘플에 따라 다르며 각 샘플에 최적화해야 합니다. 더 큰 부적 및 점성 샘플은 더 긴 블로팅 시간이 필요합니다. - 트위저 손잡이 주위에 테이프를 래핑하여 트위저 그리드 샘플 어셈블리를 수동 플런징 암에 고정합니다.
- 기존의 전면 블로팅을 위해 샘플을 사용자를 향해 향합니다. 샘플에 백 블로팅이 필요한 경우 샘플을 사용자로부터 멀리 찾아보라고 합니다.
- 엄지와 각 손의 검지 손가락 사이에 깨끗하고 건조하고 잘라낸 종이 조각을 잡습니다.
- 가장자리에서 얼룩진 용지만 처리하고 손/장갑의 오일 및 기타 오염 물질이 그리드 품질을 변화시킬 수 있기 때문에 중앙을 만지지 마십시오.
- 안정된 위치를 확립하기 위해 급락 하는 데워의 가장자리에 손을 휴식. 그리드 표면에서 약 1cm 떨어진 그리드 표면에 평행하게 얼룩지를 찾습니다.
- 블로팅 용지의 중간 부분을 사용하여 완전한 유체 이동성과 그리드 표면을 가로질러 악수할 수 있습니다.
- 엄지손가락을 부드럽게 밀어내고 손가락을 서로 향하게 하여 블로팅 용지를 그리드쪽으로 구부리면 블로팅을 시작합니다. 전체 블로팅 공정 동안 블로팅 용지와 그리드 표면 간의 접촉을 유지합니다.
- 블로팅 용지를 그리드 표면에 직접 접촉하고 그리드 표면전반에 걸쳐 일관된 접촉을 유지합니다.
- 블로팅 용지를 부드럽게 구부리면 그리드의 굽힘 및/또는 그리드 표면의 손상이 감소하며 그리드 전체에서 보다 일관된 얼음이 생성됩니다(그림 3A).
- 이동식 액체 를 전면으로 관찰하고 블로팅 페이퍼로 진행을 중지하면 4 ~ 6 초 동안 계산하기 시작합니다.
참고: 블로팅 용지가 그리드 표면에 닿지만 그리드 간 재현성이 낮아지면 계산이 발생할 수 있습니다. 총 블롯 시간은 그리드 유형, 호일 유형, 샘플 농도 및 샘플 유형(예: 필라멘트 단백질 대 멤브레인 대 용해성)에 따라 달라집니다. 점성 시료의 경우 더 긴 블롯 시간(예: 5~7초)이 필요합니다.- 중요: 동결 과정에서 재현성을 크게 향상시키기 위해 안정적이고 일관된 계산 체계를 개발합니다.
- 왼쪽, 오른쪽 엄지 손가락 및 검지 손가락을 반대 방향으로 이동하여 그리드 표면에서 멀리 떨어진 "스냅 모션"에서 블로팅 용지를 제거합니다. 즉시 발 페달을 누르고 급락하는 팔을 방출하고 그리드를 액체 에탄으로 떨어 놓습니다.
- 동시에 블로팅 페이퍼를 제거하고 발 페달을 눌러 가능한 한 빨리 그리드를 에탄으로 떨어 뜨면 최상의 동결 결과를 제공합니다. 용지 제거와 급락 사이의 시간이 길수록 박막의 증발이 더 많이 발생하고 그리드 대 그리드 재현성이 감소합니다.
- 한 손으로 클램핑 핀셋을 안정시키고 핀셋 주위와 수동 플런징 팔 주위에서 테이프를 조심스럽게 풀어보겠습니다.
- 항상 트위저 그리드의 이동을 방지하고 고체 에탄에 대한 그리드를 노크에서 발생하는 그리드 손상을 제한하기 위해 트위저와의 접촉을 유지합니다.
- 핀셋을 클램핑하는 핀셋이 수동 플런징 암에서 자유로워지면, 플런징 드워 위에 놓여있는 한 손에 트위저를 유지하여 그리드가 액체 에탄에 남아 있는지 확인하십시오. 그리드를 전송할 수 있도록 플라스틱 클램프를 그리드에서 조심스럽게 밀어내십시오. 핀셋에 압력을 유지하여 그리드를 유지합니다.
- 하나의 신속한 움직임으로 에탄 용기에서 그리드를 LN2 저수지로 신속하게 전송합니다. 그리드 스토리지 상자에 그리드를 조심스럽게 배치합니다.
참고: 일부 에탄은 그리드 표면에 응고될 수 있습니다. 트위저를 약간 열면 에탄이 깨지고 그리드를 그리드 박스에 떨어뜨릴 수 있습니다.
- 하나의 신속한 움직임으로 에탄 용기에서 그리드를 LN2 저수지로 신속하게 전송합니다. 그리드 스토리지 상자에 그리드를 조심스럽게 배치합니다.
- 핀셋 의 끝을 섬세한 작업 닦아 서리 축적을 방지 합니다. 핀셋이 실온으로 돌아올 때까지 따로 둡니다.
- 사용 편의를 위해 4~6개의 핀셋을 손에 들고 있습니다. 각 트위저는 샘플 동결에 사용되며 후속 사용 전에 데워집니다.
- 각 그리드에 대해 6.1-6.11 단계를 반복합니다.
- 동결이 끝나면 그리드 박스를 안전하게 닫고 적절한 저장소 위치로 전송합니다.
- 액체 에탄과 LN2 를 조심스럽게 폐기하고 모든 재료를 건조한 위치에 보관하십시오.
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Representative Results
여기에 설명된 블롯 및 플런지 프로토콜의 성공적인 실행은 전자 현미경하에서 관찰될 수 있는 어떤 육각형 얼음, 오염 물질 및 큰 그라데이션이 없는 얇고 균일한 유리체 얼음층을 초래할 것이다(그림 3). 그리드 표면과 블로팅 용지의 일관되지 않은 접촉, 블로팅 용지를 조기에 제거하거나 그리드 접촉 중에 블로팅 용지를 이동하면 유리체 얼음의 품질을 저하시키고 EM 그리드 전체의 일관되지 않은 얼음 두께로 이어질 수 있습니다(그림 4)
그림 1: 표본 급락 실 및 필수 장비. A) 이 문서에 설명된 전통적인 블롯 앤 플런지 장치를 사용하여 생물학적 표본의 수동 동결을 위한 냉장실을 준비했습니다. 필요한 장비가 표시되고 그에 따라 레이블이 지정됩니다. B) 수동 플런서의 작동 높이를 조정하려면 수동 플런징 암을 위아래로 슬라이딩하고 나사를 조여 고정하여 범프 스톱을 조정합니다. C) 빈 황동 에탄 용기 내부의 클램핑 핀셋 및 그리드의 적절한 높이와 위치를 나타내기 위해 에탄 용기 및 회전 그리드 저장 플랫폼을 확대합니다. 핀셋과 그리드는 손상을 피하기 위해 황동 에탄의 측면이나 바닥에 접촉해서는 안됩니다. D) 액체 에탄의 클램핑 핀셋 및 그리드의 적절한 높이 와 위치. 핀셋과 그리드는 둘레의 고체 에탄과의 접촉을 피하면서 중앙에 있는 액체 에탄을 입력해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 준비된 액체 에탄. 시편 동결 전에 황동 에탄 용기에서 액체 에탄의 상태를 나타내는 급락 디워의 확대 보기. 황동 에탄 용기 내의 2-3mm 고체 에탄 링은 선명하게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 수동 블롯 및 플런지 기술을 사용하여 얻은 대표적인 아포페리틴 이미지. (A) 수동 블롯 및 플런지 기술을 사용하여 얻을 수 있는 그리드 사각형의 얼음 두께 와 품질을 나타내는 극저온엠 그리드의 대표 아틀라스. (B) 캘리포니아 대학, 샌디에고의 CryoEM 시설에서 직접 전자 검출기가 장착 된 200 kV 전송 전자 현미경을 사용하여 획득 한 유리마우스 아포페리틴의 모션 보정 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 그리드 를 가로지르는 일관되지 않은 얼음 두께, 수많은 깨진 사각형 및 얼음이 너무 두껍기 때문에 표본을 이미지화할 수 없는 영역을 보여주는 최적 극저온EM 그리드의 대표 아틀라스를 참조하십시오.
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Discussion
단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)에 의한 이미징을 위한 생물학적 표본의 진동은 성공적인 구조 결정에 매우 중요한 단계로 남아 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 수동 블롯 앤 플런지 방법은 극저온 이미징을 위한 유리체 얼음 의 박막에서 생물학적 샘플을 신속하게 동결하는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있으며 견고한 방법을 나타냅니다. 원고에 설명된 방법을 사용하여, 연구원은 수동 플런저를 조립및 작동시키고, 플래시 동결 생물학적 샘플에 적합한 극저온을 준비하고, 생물학적 표본을 포함하는 수동으로 얼룩 및 플런지 EM 그리드를 블롯 및 플런지 할 수 있습니다. 이 방법은 매우 견고하지만, 고해상도 이미징을 위한 최적의 얼음 두께와 품질을 얻기 위해 이 절차에서 중요한 단계에서 주의를 기울여야 합니다. 아래에서 이러한 몇 가지 중요한 단계를 설명하고 이러한 단계를 해결하는 방법에 대한 권장 사항을 제공합니다.
플런징 암은 플런지 후 황동 용기 내의 액체 에탄의 중앙에 그리드가 위치하도록 하는 것이 필수적입니다. 플런징 암의 부적절한 높이 또는 위치 및/또는 핀셋을 제대로 고정하지 않을 경우 클램핑 핀셋, EM 그리드 및 수동 플런저가 손상될 수 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 우리는 EM 그리드가 성공적으로 급락 한 후 황동 에탄 용기의 중심으로 위치할 지 확인하기 위해 생물학적 표본을 준비하기 전에 항상 하나 이상의 시험 실행을 수행합니다 (그림 1C). 또한 각 그리드가 동결된 후 에탄 용기 내의 격자 배치(도 1D)에 대해서도 약간의 조정을 한다.
에탄 저온겐의 적절한 준비는 유리체 얼음에서 생물학적 표본의 박막을 얻는 데 중요합니다. 황동 에탄 용기의 내부 가장자리 주위에 고체 에탄의 2-3mm 링이 존재하여 액체 에탄의 온도가 시료 유리화에 최적임을 보장하는 것을 관찰했습니다(도 2). 실제로, 각 그리드가 동결 된 후, 우리는 에탄의 품질을 모니터링하고 사소한 조정을합니다 - 시스템이 워밍업 한 경우 너무 많은 에탄이 고화되거나 냉각되면 선박을 약간 따뜻하게합니다. 우리는 실온 트위저의 가장자리가 1-5 분 동안 거품 뚜껑으로 탈파를 덮으면서 고체 에탄을 액화하기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 중요한 것은, 그리드 표면(즉, 플라즈마 세척)을 준비하고 이를 재현할 수 없는 그리드 준비에 또 다른 변수를 도입할 수 있으므로 그리드에 샘플을 적용하기 전에 이러한 조정을 합니다.
마지막으로, 그리드-그리드 재현성을 높이기 위해 샘플 응용 프로그램, 샘플 블로팅 및 블로팅 시간 등 표준화된 블롯 및 플런지 루틴을 개발하는 것이 좋습니다. B 그리드쪽으로 블로팅 용지를 구부리면 그리드와 용지의 균일한 접촉을 허용하고 전체 그리드에서 보다 일관된 얼음 두께를 생성하여 그리드 구멍 내의 입자 분포도 생성합니다(그림 3A 및 도B). 이 블로팅 방법은 그리드 전체의 얼음 두께의 그라데이션을 초래할 수 있는 각도로 시편과 상호 작용하는 로봇 블로팅 장치와 대조적입니다. 또한, 블로팅 용지의 이러한 굽힘또한 사용자가 적용하는 힘을 버퍼링하여 블로팅 용지와 접촉할 때 EM 그리드를 손상시킬 가능성을 감소시다. 원하는 블로팅 시간 후, 수동 플런징 암의 방출 시 그리드의 손상을 방지하기 위해 급락하기 전에 그리드 표면에서 블로팅 용지를 빠르게 이동시키는 스냅 모션을 수행하여 블로팅 용지를 신속하게 곧게 펴줍니다. 우리는 이 블로팅 방법과 블로팅 용지의 스냅 모션을 발견했으며, 풋 페달을 통해 수동 플런징 암의 동시 방출과 함께 시간이 지남에 따라 진동하기 전에 박막의 증발을 제한하고 그리드 대 그리드 재현성을 증가시킵니다.
여기에 설명된 수동 블롯 앤 플런지 방법은 신흥 실험실에 배치할 수 있는 재정적 부담을 줄이는 데 도움이 되는 강력하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 방법은 재현 할 수 있지만, 극저온에 적합한 고품질 유리체 얼음을 만드는 것은 개별 연구원의 경험과 기술에 의존한다. 로봇 플런서와 기타 신흥 기술은 동결 공정의 여러 측면을 자동화하지만 일반적으로 연구자에게 제공하는 제어량에 의해 제한되며 종종 구매 및 운영에 높은 가격을 부과합니다. 이 프로토콜에 설명된 방법을 통해 연구원은 샘플 유형 및 특성에 따라 급락 조건(예: 종이 유형, 블로팅 각도, 블로팅 지속 시간, 블로팅 길 찾기 등)을 최적화할 수 있는 유연성을 제공하는 저렴하고 다양한 EM 그리드 준비 플랫폼을 활용할 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Herzik 랩 회원들에게 이 원고와 비디오 콘텐츠에 대해 비판적으로 생각하고 피드백을 제공해 주신 것에 감사드립니다. M.A.H.주니어는 NIH R35 GM138206과 시얼 학자의 지원을 받고 있습니다. H.P.M.N은 분자 생물물리학 훈련 보조금(NIH T32 GM008326)에 의해 지원됩니다. 또한 스크립스 연구소의 빌 앤더슨, 찰스 보우먼, 가브리엘 랜더 박사에게 비디오에 표시된 수동 플런저를 설계, 조립 및 테스트하는 데 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
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