Summary
Dette manuskript skitserer blot-and-plunge metode til manuelt at fryse biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi.
Abstract
Imaging biologiske prøver med elektroner til høj opløsning struktur bestemmelse af enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) kræver et tyndt lag af glasagtig is, der indeholder biomolekyler af interesse. På trods af talrige teknologiske fremskridt i de seneste år, der har drevet enkelt-partikel cryoEM på forkant med strukturel biologi, de metoder, hvormed prøver er vitrified for høj opløsning billeddannelse ofte forbliver den sats-begrænsende skridt. Selv om talrige nylige bestræbelser har givet midler til at overvinde forhindringer, der ofte opstår under prøve vitrificering, herunder udvikling af nye prøvestøtter og innovativ vitrifikationsinstrumentering, forbliver det traditionelle manuelt betjente stempel et dagligt syn i kryoEM-samfundet på grund af de lave omkostninger til køb og brugervenlighed. Her giver vi detaljerede metoder til brug af en standard, guillotine-stil manuelt betjent blot-and-plunge enhed til vitrificering af biologiske prøver til høj opløsning billeddannelse af enkelt-partikel cryoEM. Derudover beskrives ofte stødte problemer og fejlfindingsanbefalinger til, hvornår et standardpræparat ikke giver en passende prøve.
Introduction
Enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftfuld strukturel teknik, der kan bruges til at løse strukturer af dynamiske biologiske prøver til næsten atomare opløsning1,2,3,4. Faktisk er de seneste fremskridt inden for direkte elektrondetektorteknologier4,5,6,7,8,9,10, forbedringer i elektronkilder4,11,12,13,14 og elektromagnetisk linsestabilitet15 kombineret med den fortsatte udvikling af dataindsamling 16,17 og analyse softwarepakker18,19, har gjort det muligt for forskere til nu rutinemæssigt at bestemme strukturer af velopdragne prøver til 3 Å opløsning eller bedre4,11,13,14,20,21,22,23 . På trods af disse forbedrede billed- og databehandlingsfunktioner er kryoEM-gitterforberedelse fortsat den største hindring for vellykket strukturbestemmelse med høj opløsning og fungerer ofte som en betydelig flaskehals i EM-arbejdsgangen24,25,26,27.
CryoEM er afhængig af billeddannelse af biologiske prøver i vandige opløsninger, der er frosset til at danne en tynd film af "glaslignende" is - en proces kendt som vitrificering - der bevarer den indfødte biokemiske tilstand. Vitrifikation af biologiske prøver til cryoEM går tilbage over 40 år28,29,30 og mange teknikker og udstyr, der er udviklet til denne proces stole på den oprindeligt detaljerede blot-and-plunge metode31,32,33,34,35 , hvorved der påføres en lille prøvevolumen (f.eks. 1-5 μL) på et specialiseret EM-gitter, før den overskydende opløsning fjernes ved hjælp af nettets fysiske interaktion med blottingpapir. Timingen af denne proces er normalt empirisk bestemt for hver prøve som en kritisk komponent i frysning prøver er tykkelsen af glaslegeme is film - hvis isen er for tyk derefter billeddannelse kvalitet forringes dramatisk på grund af øget spredning af elektronstrålen, mens is, der er for tynd kan begrænse protein orienteringer og / eller udelukke partikler fra midten af gitteret folie huller36 . Denne afhængighed af den perfekte istykkelse til enkeltpartikel kryoEM har ført til en bred vifte af teknikker og udstyr, der kan fryse prøver, herunder robotteknologi37,38, mikrofluidics42, og ultralyd eller sprøjtning enheder27,39,40,41,42,43,44 . I de senere år er nogle af de mest populære prøveforberedelsesenheder afhængige af brugen af robotteknologi til automatiseret frysning af prøver ved hjælp af blot-and-plunge-teknikken45. Mens disse enheder er designet til at reproducer korrekt istykkelse til billeddannelse, forbliver de ofte for dyre for individuelle laboratorier at købe og betjene og findes generelt inden for cryoEM-faciliteter til timepriser for brug. I de senere år er den oprindelige manuelle blot-and-plunge teknik kommet tilbage i øget brug3,47,48,49,50,51,52. Faktisk kan en manuelt betjent blot-and-plunge enhed opnå høj kvalitet cryoEM gitre til en brøkdel af omkostningerne ved robot kolleger. Desuden giver manuel blotting også flere brugere kontrol over blotting, da forskere kan justere typen af blotting (dvs. back-blotting af nettet, front-blotting af nettet osv.) og blotting tid baseret på hver enkelt prøve og forskningsspørgsmål.
I denne artikel giver vi detaljer om, hvordan man effektivt fryser biologiske prøver ved hjælp af en traditionel manuel blot-and-plunge vitrifikationsenhed kombineret med en specialdesignet dewar platform53. Bedste praksis, herunder forberedelse af cryogen, nethåndtering, prøveanvendelse og blotting samt almindelige faldgruber og anbefalinger til, hvordan man overvinder disse forhindringer, leveres. Der diskuteres råd om, hvordan man øger reproducerbarheden af istykkelse mellem gitterpræparater, og hvordan prøvepletter ændres baseret på biologisk prøvetype. I betragtning af de lave omkostninger forbundet med køb og drift af den manuelle stempel beskrevet i dette manuskript, laboratorier over hele kloden kan forberede biologiske prøver til cryoEM i en omkostningseffektiv og reproducerbar måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered det manuelle kastemiljø
BEMÆRK: Anslået driftstid: 5-30 minutter
- Find det manuelle stempel i et 4 °C koldt rum, hvor en luftfugter kan placeres sammen for at opretholde rummet tæt på 100% relativ luftfugtighed (RH) (figur 1A).
FORSIGTIG: Kontakt institutionens retningslinjer for miljøsundhed og sikkerhed for sikker placering af det manuelle stempel og de anbefalede operationer. - Før gitterforberedelse skal du tænde for luftfugteren i kølerummet for at sikre, at kulderummets RH er ≥ 95 %.
BEMÆRK: Gitterforberedelse ved lav luftfugtighed kan resultere i dehydrering af tynde film, ændring af bufferkomponenter på grund af fordampning og et fald i reproducerbarhed fra gitter til gitter46. Det anbefales ikke at fryse gitre til < 80 % RH. - Sørg for, at temperaturen i kølerummet er ved 4 °C.
- Find det manuelle stempel væk fra stærke luftstrømme (dvs. væk fra ventilationsåbninger af klimaanlæg), da de kan føre til turbulens nær gitre og/eller fremtrædende isakkumulering på kolde overflader.
2. Forbered kastematerialer og tilbehør
BEMÆRK: Anslået driftstid: 1-5 minutter
- Brug ren saks til at skære blotting papir cirkler i 1-1,5 cm bred og ~ 9 cm lange strimler. Undgå at røre midten af blotting papir og kassere de mindre ende stykker. Det er vigtigt at sikre, at blotting papirstrimlerne er tørre, rene og fri for forurenende stoffer. Adskil strimlerne og læg dem i en 100 mm petriskål.
- Placer en 22x22 mm firkantet glas coverlip i en separat 60 mm glas Petri fad. Denne coverlip-holdige glas Petriskål vil blive brugt til at gemme, overføre, og glød-udledning gitre.
BEMÆRK: Det anbefales at bruge en luftdårredåse til at fjerne synlige snavs fra diaset, før du tilføjer gitre. En anti-statisk pistol kan også bruges til at fjerne enhver statisk elektricitet, der akkumuleres. - Saml og mærk gitteropbevaringsbokse.
- Erhverve 4 til 6 ren og tør fastspænding pincet og finde dem til den manuelle stemplet. Undersøg visuelt hver pincet før kast for at sikre, at de ikke er beskadiget og er fri for forurenende stoffer.
3. Forbered cryogen dewar og manuel stemplet
BEMÆRK: Anslået driftstid: 5-15 minutter
- Installer platformbasen i bunden af den faldende dewar. Placer ethanbeholderen dewar oven på platformbasen, tilsæt messing ethanbeholderen, og installer derefter spinning grid-opbevaringsplatformen.
- Når flydende nitrogen (LN2) tilsættes til den faldende dewar, kan højden af platformbasen ikke længere justeres. Sørg for, at gitterbasen er installeret korrekt og er i niveau for at begrænse gitter- og/eller pincetskader på grund af forkert stempelhøjde.
- Før frysningen skal du kontrollere det manuelle stempel og alt hjælpeudstyr for at sikre, at de fungerer korrekt for at begrænse prøve- og/eller nettabet.
- Før hver frysning session, skal du udskifte båndet på den manuelle stempelarm bruges til at holde pincet. Den høje luftfugtighed i rummet kan forringe tapeklæben og mindske båndets evne til at holde pincet, hvilket øger sandsynligheden for pincetskader og / eller gittertab.
- Juster lamperne i nærheden af det manuelle stempel for at sikre, at der er tilstrækkeligt lys til at overvåge prøvetransport og sikre, at netoverførslen let kan visualiseres for at forhindre netskader og/eller tab (se trin 3.7). Brug en ringlampe direkte bag stemplet til at visualisere flydende bevægelse og et fleksibelt armopgavelys nær dewar til at belyse de frosne gitre.
- Juster fodpedalen spænding for at sikre dewar kaster arm er sikkert bevaret på plads, mens i den hævede position og er fuldt frigivet, når pedalen er trykket ned. Udfør flere "tørre" kørsler før prøveapplikationen for at sikre, at stemplet fungerer korrekt.
BEMÆRK: Forkert justering af fodpedalens spænding vil resultere i for tidlig frigivelse af den faldende arm (dvs. spændingen er sat for lavt) og nettab eller ufuldstændig nedsnrammer af nettet i ethanbeholderen (dvs. spændingen er sat for højt). - Placer den faldende dewar i bunden af det manuelle stempel direkte under den faldende arm og fastgør den på plads. Fastgør et par pincet til den faldende arm ved hjælp af det vedhæftede bånd. Mens du holder den manuelle kastearm, trykke fodpedalen til forsigtigt at sænke den faldende arm og justere rejsen af den faldende arm for at sikre, at nettet vil finde inden for midten af ethanbeholderen.
- Brug bump stop på toppen af den faldende arm til at bestemme den endelige position af den faldende arm, når fodpedalen er helt deprimeret (Figur 1B). Juster bumpstophøjden på den faldende arm for at justere gitterets placering i ethanbeholderen (figur 1C).
BEMÆRK: Forkert indstilling af den faldende armhøjde kan føre til gitter- og/eller pincetskader (f.eks. er den faldende armhøjde sat for lavt) eller utilstrækkelig vitrificering (f.eks. er den faldende armhøjde sat for højt). - Find dewar uden for det kolde rum og fortsæt med at forberede flydende ethan (trin 4).
4. Forbered cryogen
BEMÆRK: Anslået driftstid: 10-30 minutter
- Vurder ethantanken, regulatoren, slange- og ethandispenseringsspidsen for tegn på skade. Rapporter straks og ret eventuelle tegn på skade, før du fortsætter.
FORSIGTIG: Komprimerede ethan- og ethangasblandinger er brandfarlige og kan udgøre en alvorlig trussel mod livet og/eller resultere i personskade, hvis den håndteres forkert. Kontakt en ekspert, hvis du er usikker på, hvordan du betjener eller håndterer komprimerede gastanke. Der henvises til institutionens retningslinjer for miljøsundhed og sikkerhed ved håndtering af brændbare komprimerede gasser. Derudover er liquified ethan en kraftig cryogen, der kan udgøre en alvorlig trussel mod liv og / eller skade, hvis den ikke håndteres korrekt. Der henvises til institutionens retningslinjer for miljøsundhed og sikkerhed ved håndtering af cryogener. - Erhverve tilstrækkelig LN2 i en passende LN2 håndtering dewar (dvs. 3-4 L er typisk for gitter forberedelse og opbevaring).
FORSIGTIG: LN2 er en cryogen, der kan udgøre en alvorlig trussel mod liv og / eller skade, hvis den ikke håndteres korrekt.- Sørg for, at alle personlige værnemidler anvendes til at minimere risikoen for kvæstelser. Dampen af LN2 er et kvælningsmiddel og bør håndteres i godt ventilerede områder. Kontakt en ekspert, hvis du er usikker på, hvordan du betjener eller håndterer kryogene fartøjer og cryogener. Der henvises til institutionens retningslinjer for miljøsundhed og sikkerhed ved håndtering af cryogener. I situationer, hvor flydende nitrogen ikke kan bruges i et koldt rum, anbefaler vi at springe frysning i et køligt og godt ventileret rum.
- Uden for det kolde rum skal du køle den neddæmning af dewar ved at hælde LN2 direkte ind i messing ethanbeholderen, indtil det flydende nitrogenniveau når toppen af ethanbeholderen (dvs. lige over platformen). Top ln2 uden for ethanbeholderen efter behov. Fortsæt til næste trin, når LN2 holder op med at boble voldsomt (ca. 5 minutter).
- Tilsæt LN2 direkte til messing ethanbeholderen for at afkøle beholderen tilstrækkeligt, inden der kondenseres ethangas. Undladelse af korrekt afkøling messing ethan fartøj vil dramatisk øge den tid, det tager at kondensere ethan.
- Når dewar har nået LN2 temperatur, undgå overfyldning dewar således, at LN2 spilder ind i ethan fartøjet.
- Ethan kommer som en komprimeret gas og skal flydende til brug. Ethantanken bruger en dobbelttrinsregulator med høj renhed til at styre gasstrømmen. Tilslut slangen til regulatorens udløbsventil, og brug en 14-gauge flad metaldispenseringsspids, der er tilsluttet i slutningen til dispensering af ethan.
- Før du åbner ethan hovedtankventilen, skal du sørge for, at trykjusteringsknappen og udløbsventilen er lukket hele vejen. Åbn hovedtankventilen helt, og åbn derefter udløbsventilen til ~50%. Åbn langsomt trykjusteringsknappen, indtil der observeres en langsom gasstrøm. Brug udløbsventilen til at finjustere gasstrømmen.
FORSIGTIG: Ret altid metaldispenseringsspidsen væk fra sig selv, når ventilerne åbnes eller justeres af gasstrømmen. - Start langsomt gasstrømmen og vurder strømningshastigheden ved at indsætte spidsen af ethangasledningen i et lille bæger af deioniseret vand. Juster gasstrømmen, indtil strømningshastigheden forstyrrer vandet moderat .
- Juster gasstrømshastigheden for at sikre korrekt ethankondensering opstår - for langsom strømningshastighed vil få ethangassen til at størkne i dispenserspidsen, og for hurtigt af en strømningshastighed vil resultere i intens boble og forhindre frysning.
- Før spidsen af ethangasledningen indsættes i messingethanbeholderen, skal du rengøre og tørre dispenserspidsen af med delikate opgaveservietter for at fjerne vand.
- I en glat og hurtig bevægelse skal du finde gasdispenseringsspidsen i bunden af messingethanbeholderen og begynde at flytte dispenserspidsen i en langsom cirkel rundt om bunden af ethanbeholderen. Solid ethan vil danne straks, men vil hurtigt flydende som mere ethan gas er tilsat / kondenseret.
- Fortsæt med at flytte metal ethan dispensering tip rundt i bunden af ethanbeholderen for at flydende den faste ethan. Fyld ethanbeholderen op til 3/4 fuld af flydende ethan (2-3 tråde fra toppen). Stop ethangasstrømmen ved forsigtigt at fjerne metalethandispenseringsspidsen fra messingethanbeholderen og lukke udløbsventilen.
- Top off den kaste dewar med LN2 hælde forsigtigt på siden af dewar at undgå LN2 tilføjelse til messing ethan fartøj, indtil væsken niveau bare rører messing ethan fartøj. Placer skumlåget på den faldende dewar for at lette ethanstørring.
- LN2 skal kontakte messing ethanbeholderen direkte for at hjælpe med størkning af ethan. Efter ca. 5 minutter bliver ethanen i messingbeholderen helt frosset fast. Tilføj mere LN2, indtil det bare rører ethan fartøjet og gå videre til næste skridt.
- Hvis ethanen ikke er frosset fast, er messingethanbeholderen ikke koldt nok til de resterende trin. Tilføj mere LN2 , indtil det bare rører ethanbeholderen og vent yderligere 5 minutter. Sørg for, at ethanen i messingbeholderen er helt frosset fast.
- Åbn gasudtagventilen for at producere en ethangasstrøm med samme hastighed som fastsat i trin 4.6. Placer lodret metalethandispenseringsspidsen i den faste ethan, og fortsæt med at flytte ethandispenseringsspidsen i en cirkulær bevægelse for at smelte den faste ethan.
- Fortsæt med at tilføje ethan, indtil det er niveau med toppen af messing ethanbeholderen. Fjern langsomt spidsen fra ethanbeholderen, og luk ethantankens udløbsventil. Dæk dewar med låget i ~ 1-4 minutter (r) for at lade ethan størkne omkring kanterne af messing ethan fartøj.
BEMÆRK: Et ideelt ethankar vil have en 2-3 mm symmetrisk ring af fast ethan ved omkredsen af messingethanbeholderen med flydende ethan i midten (figur 1D og figur 2). - Sørg for, at ethanen er så kold som muligt uden at størkne for at sikre korrekt vitrificering af den biologiske prøve. Hvis den flydende ethan ikke forberedes korrekt, kan den resultere i utilstrækkelig vitrificering af prøven, isakkumulering og/eller tab af prøve, hvilket hver især bidrager til forringelsen af prøvekvaliteten til billeddannelse.
- Hvis en solid ring af ethan ikke dannes efter 2-3 minutter, skal du tilføje mere LN2 til dewar og dække i 2-5 minutter mere.
- Hvis ethanen størkner for hurtigt, skal du bruge et stort par rene pincet til forsigtigt at opvarme ethanbeholderen og / eller solid ethan for at forhindre fuldstændig ethanstørring. Når ethanen og LN2 er stabile, skal du lukke alle ethantankventilerne og lokalisere den faldende dewar til det manuelle stempel. Fastgør den neddykkede dewar til det manuelle stempel.
FORSIGTIG: Vær ekstra forsigtig, når du overfører dewar som LN2 kan spilde ind i ethanen fartøjet og størkne den flydende ethan. Hvis det er nødvendigt, kan et rent sæt pincet bruges til at smelte enhver fast ethan i midten af fartøjet.
- Fortsæt med at tilføje ethan, indtil det er niveau med toppen af messing ethanbeholderen. Fjern langsomt spidsen fra ethanbeholderen, og luk ethantankens udløbsventil. Dæk dewar med låget i ~ 1-4 minutter (r) for at lade ethan størkne omkring kanterne af messing ethan fartøj.
- Test placeringen af ethandefornåren med et par tomme pincet for at sikre, at pincetspidsen lokaliserer i midten af ethanbeholderen, og der er tilstrækkelig plads til gitteret og pincetspidsen inde i væskedehanen (figur 1D).
- Hvis den faste ethanring er for tyk til nem nethåndtering, skal du bruge et par stuetemperaturer, rense pincet til at smelte den faste ethan og skabe mere fryseområde i midten af ethanbeholderen.
5. Forbered EM-gitre
BEMÆRK: Anslået driftstid: 1-5 minutter
- Tilføj gitteropbevaringsboksen(e) til dewar, skru gitteret opbevaringskasse låg (r), og sørg for hvert låg frit kan rotere til en ny gitter slot.
- Overfør forsigtigt gitre fra gitteropbevaringsboksen til kanten af den firkantede glasovertræk med ~ 30-40% af gitteret ud for diaskanten. Sørg for, at gitterfolien vender nedad. Sørg for, at gitre er dækket, når de ikke er i brug. Placering af gitre over kanten af det firkantede glas coverlip giver nem nethåndtering og mindsker chancen for at bøje eller beskadige nettet under overførsel.
BEMÆRK: 4-6 gitre fremstilles typisk ad gangen. - Render gitre hydrofil ved hjælp af en glød udledningsmotor eller plasma renere.
BEMÆRK: Se de anbefalede retningslinjer for netrensning fra producenten af glødeudladnings-/plasmarenseren.- Brug gitrene inden for 10 minutter efter plasmarensning, da gitrene mister hydrofilitet, og reproducerbarheden fra gitter til gitter falder efter dette tidspunkt.
6. Forbered cryoEM prøve ved at springe frysning
BEMÆRK: Anslået driftstid: >10 minutter (~1-3 min pr. gitter)
- Brug en ren og tør klemme pincet til at afhente et renset gitter, skub plast klemme ned for at fastsætte nettet på plads, og forsigtigt trykke på pincet for at sikre, at nettet er korrekt sikret.
- Håndter gitre ved den ydre ring for at forhindre beskadigelse af gitterfolien.
- Prøven påføres 1-5 μL på den forberedte side (f.eks. for- eller foliesiden) af gitteret.
BEMÆRK: Den optimale lydstyrke og blotting tid afhænger af prøven og skal optimeres for hver prøve; større mængder og mere tyktflydende prøver kræver længere blotting gange. - Fastgør pincet-grid-prøvekonstruktionen til den manuelle kastearm ved at vikle tape rundt om pincethåndtaget.
- Face prøven mod brugeren for traditionelle front blotting. Hvis prøven kræver tilbage blotting, derefter finde prøven væk fra brugeren.
- Hold et rent, tørt, skåret stykke blotting papir mellem tommelfingeren og pegefingeren på hver hånd.
- Håndter kun blottingpapirerne fra kanterne og rør aldrig midten, da olier og andre forurenende stoffer fra hænder/handsker kan ændre gitterkvaliteten.
- Hvil hænderne på kanten af den kastede dewar for at etablere en stabil position. Find blottingpapiret parallelt med gitteroverfladen ca. 1 cm væk fra gitteroverfladen.
- Brug den midterste del af blottingpapiret til at give mulighed for fuldstændig væskemobilitet og endda svede over gitteroverfladen.
- Skub forsigtigt og drej tommelfingeren og ring fingre mod hinanden for at bøje blotting papir mod nettet for at indlede blotting. Bevar kontakten mellem blottingpapiret og gitteroverfladen under hele blottingprocessen.
- Kontakt blottingpapiret direkte til gitteroverfladen, og hold en ensartet kontakt på tværs af gitteroverfladen.
- Forsigtigt bøjning af blotting papir mindsker bøjning af nettet og / eller skader på gitteret overfladen, og resulterer i mere konsekvent is på tværs af nettet (Figur 3A).
- Overhold den mobile væskefront, og når den holder op med at komme ind i blotting-papiret, begynder du at tælle i 4 til 6 sekunder.
BEMÆRK: Optælling kan forekomme, når blottingpapiret kontakter gitteroverfladen, men der kan forekomme lavere reproducerbarhed fra gitter til gitter. Den samlede blot tid vil afhænge af gittertype, folietype, prøvekoncentration og prøvetype (f.eks. opløselige versus membran versus filamentøse proteiner). For mere tyktflydende prøver længere blot gange (f.eks 5 til 7 sekunder) vil være påkrævet.- Vigtigt: Udvikle en pålidelig og konsekvent optælling ordning til i høj grad at forbedre reproducerbarhed under indefrysningsprocessen.
- Flyt venstre, højre tommelfinger og pegefingre i modsatte retninger for at fjerne blotting-papiret i en "snappende bevægelse" væk fra gitteroverfladen. Tryk straks fodpedalen for at frigøre den faldende arm og kaste gitteret i flydende ethan.
- Fjern samtidig blottingpapiret og tryk på fodpedalen for at kaste gitteret ind i ethanen så hurtigt som muligt for de bedste fryseresultater. Jo længere tid mellem blotting papir fjernelse og kaste, jo mere fordampning af tynde film vil forekomme og mindske gitter-til-gitter reproducerbarhed.
- Brug den ene hånd til at stabilisere fastspænding pincet, slappe tape omhyggeligt fra omkring pincet og manuel kaste arm.
- Hold altid kontakt med pincet for at forhindre bevægelse af pincet-nettet og begrænse netskader, der opstår fra at banke nettet mod den faste ethan.
- Når fastspænding pincet er fri for den manuelle kastearm, opretholde pincet i den ene hånd hviler oven på den kastede dewar, sikre nettet forbliver i den flydende ethan. Skub forsigtigt plastikklemmen væk fra gitteret, så gitteret kan overføres. Hold pres på pincet for at bevare nettet.
- Med en hurtig bevægelse kan du hurtigt overføre nettet fra ethanbeholderen til LN2-reservoiret . Placer forsigtigt gitteret i gitterlagerboksen.
BEMÆRK: Nogle ethaner kan størkne på gitteroverfladen. Åbning af pincet lidt vil bryde ethan og give mulighed for nettet, der skal droppes i gitteret boksen.
- Med en hurtig bevægelse kan du hurtigt overføre nettet fra ethanbeholderen til LN2-reservoiret . Placer forsigtigt gitteret i gitterlagerboksen.
- Pak spidsen af pincet i en delikat opgave tørre for at forhindre frost ophobning. Sæt til side, indtil pincet er vendt tilbage til stuetemperatur.
- Har 4 til 6 pincet på hånden for brugervenlighed. Hver pincet vil blive brugt til prøvefrysning og opvarmet før senere brug.
- Gentag trin 6.1-6.11 for hvert gitter.
- Når frysningen er kulmineret, skal du lukke gitterboksen sikkert og overføre til et ordentligt lagersted.
- Smid forsigtigt den flydende ethan og LN2 ud, og opbevar alle materialer på et tørt sted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket udførelse af blot-and-plunge protokol beskrevet her vil resultere i et tyndt, ensartet lag af glasagtig is, der er fri for enhver sekskantet is, forurenende stoffer, og store gradienter af ubrugelig is, som kan observeres under elektronmikroskop (Figur 3). Inkonsekvent kontakt af blotting papir med gitteret overfladen, for tidligt at fjerne blotting papir, eller flytte blotting papir under gitter kontakt kan forringe kvaliteten af glaslegemet is og føre til inkonsekvent is tykkelse på tværs af EM nettet (Figur 4)
Figur 1: Prøveudsætningsrum og påkrævet udstyr. A) Iscenesat koldt rum til manuel frysning af biologiske prøver ved hjælp af en traditionel blot-and-plunge enhed skitseret i denne artikel. Nødvendigt udstyr vises og mærkes i overensstemmelse hermed. B) For at justere arbejdshøjden på det manuelle stempel skal du justere bumpstoppet ved at skubbe det op og ned ad den manuelle kastearm og fastgøre den ved at stramme skruen. C) Zoomet udsyn til ethanbeholderen og spindegitteropbevaringsplatformen for at angive den korrekte højde og placering af spændet pincet og gitter inde i det tomme messingethanfartøj. Pincet og gitter bør ikke kontakte siderne eller bunden af messing ethan for at undgå skader. D) Korrekt højde og placering af fastspænding pincet og gitter i flydende ethan. Pincet og gitteret skal komme ind i den flydende ethan i midten og undgå kontakt med den faste ethan ved omkredsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tilberedt flydende ethan. Zoomet i betragtning af den faldende dewar viser tilstanden af flydende ethan i messing ethan fartøj før prøve frysning. Den 2-3 mm ring af fast ethan i messing ethanbeholderen er tydeligt synlig. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative apoferritinbilleder, der er opnået ved hjælp af den manuelle blot-and-plunge-teknik. (B) Bevægelseskorrigeret mikrograf af vitrified museapudulv erhvervet ved hjælp af et 200 kV transmissionselektronmikroskop udstyret med en direkte elektrondetektor ved University of California, San Diego's CryoEM Facility. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentativ atlas over et suboptimalt kryoEM-gitter, der viser inkonsekvent istykkelse på tværs af gitteret, mange brudte firkanter og områder, hvor isen er for tyk til at afbilde prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitrificeringen af biologiske prøver til billeddannelse ved enkeltpartikel kryogen elektronmikroskopi (cryoEM) er fortsat et kritisk vigtigt skridt for vellykket strukturbestemmelse. Den manuelle blot-and-plunge metode, der er beskrevet i denne protokol repræsenterer en omkostningseffektiv, pålidelig og robust metode til hurtigt at fryse biologiske prøver i tynde film af glasagtig is til kryoEM billeddannelse. Ved hjælp af de metoder, der er skitseret i manuskriptet, vil forskerne være i stand til at samle og betjene det manuelle stempel, forberede cryogen egnet til flash-frysende biologiske prøver og manuelt blot-og-springet EM-net, der indeholder biologiske prøver. Mens denne metode er ganske robust, bør man passe på kritiske skridt i denne procedure for at opnå optimal istykkelse og kvalitet til høj opløsning billeddannelse. Vi har skitseret flere af disse vigtige trin nedenfor og giver anbefalinger til, hvordan du foretager fejlfinding af disse trin.
Det er bydende nødvendigt at placere den manuelle kastearm korrekt for at sikre, at gitteret lokaliserer i midten af den flydende ethan i messingbeholderen efter at have kastet. Forkert højde eller position af den faldende arm og/eller ikke sikring af pincet korrekt vil føre til skader på klemme pincet, EM nettet, og muligvis den manuelle stemplet. Som beskrevet ovenfor udfører vi altid mindst en prøvekørsel, før vi forbereder biologiske prøver for at kontrollere, at EM-gitteret vil lokalisere til midten af messing ethanbeholderen efter vellykket kast (Figur 1C). Derudover foretager vi også mindre justeringer af placeringen af den faldende dewar efter hvert gitterfrysning for at finjustere gitterplaceringen i ethanbeholderen (Figur 1D).
Den korrekte forberedelse af ethan cryogen er afgørende for at opnå tynde film af biologiske prøver i glasagtig is. Vi har observeret, at tilstedeværelsen af en 2-3 mm ring af fast ethan omkring den indre kant af messingethanbeholderen sikrer, at temperaturen på den flydende ethan er optimal til prøvevitrificering (Figur 2). Faktisk, efter at hvert gitter er blevet frosset, overvåger vi ethanens kvalitet og foretager mindre justeringer - lidt opvarmning af beholderen, hvis for meget ethan har størknet eller afkøling af ethanen, hvis systemet er varmet op - efter behov. Vi har konstateret, at kanten af en stuetemperatur pincet er tilstrækkelig til at flydende fast ethan, mens der dækker dewar med skum låg i 1-5 min er nok tid til at tillade ethan til at køle. Det er vigtigt, at vi foretager disse justeringer, før vi forbereder gitteroverfladen (dvs. plasmarensning) og anvender prøven på nettet, da dette kan introducere en anden variabel til gitterforberedelse, der ikke kan reproducerbar.
Endelig anbefaler vi at udvikle en standardiseret blot-and-plunge rutine - prøve ansøgning, prøve blotting, og blotting tid - for at øge gitter-til-gitter reproducerbarhed. Hvis du bøjer blottingpapiret mod EM-gitteret, kan papirets kontakt med nettet bøjes og frembringes en mere ensartet istykkelse på tværs af hele gitteret, hvilket resulterer i jævn partikelfordeling i gitterhullerne (henholdsvis figur 3A og figur B). Denne metode til blotting er i modsætning til robot blotting enheder, der interagerer med prøven i en vinkel, der kan resultere i en gradient af is tykkelse på tværs af nettet. Derudover mindsker denne bøjning af blottingpapiret også chancen for at beskadige EM-nettet ved kontakt med blottingpapiret ved at buffere den kraft, der påføres af brugeren. Efter den ønskede blotting tid, hurtigt rette blotting papir ved at udføre en snapping bevægelse til hurtigt at flytte blotting papir væk fra gitteret overfladen, før du kaster for at forhindre skader på nettet ved frigivelse af den manuelle kaste arm. Vi har fundet denne blotting metode og snapping bevægelse af blotting papir, når timet med den samtidige frigivelse af den manuelle kaste arm via fodpedalen, begrænser fordampning af den tynde film før vitrifikation og øger gitter-til-gitter reproducerbarhed.
Den manuelle blot-and-plunge metode beskrevet her er en robust og pålidelig metode, der hjælper mindske nogle af de finansielle byrde cryoEM kan placere på nye laboratorier. Mens denne metode er reproducerbar, skabe høj kvalitet glasagtig is, der er egnet til cryoEM bygger på erfaring og dygtighed af den enkelte forsker. Selvom robot stempler og andre nye teknologier automatisere flere aspekter af indefrysningsprocessen, er de generelt begrænset af, hvor meget kontrol de tilbyder forskere og ofte pådrager sig en høj pris for at købe og drive. Med den metode, der er skitseret i denne protokol, forskere vil være i stand til at udnytte en overkommelig og alsidig EM gitter forberedelse platform, der tilbyder fleksibilitet til at optimere de faldende betingelser (dvs. blotting papirtyper, blotting vinkel, blotting varigheder, blotting retninger, osv.) baseret på prøvetyper og egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Herzik lab medlemmer for kritisk tænkning og give feedback på dette manuskript og videoindhold. M.A.H.Jr. er støttet af NIH R35 GM138206 og som Searle Scholar. H.P.M.N er støttet af Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vi vil også gerne takke Bill Anderson, Charles Bowman, og Dr. Gabriel Lander på Scripps Research Institute for hjælp til at designe, samle, og teste den manuelle stemplet vist i videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al.
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G.
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H.
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).
