Summary
この原稿は、単粒子低温電子顕微鏡用の生物学的標本を手動で凍結するブロット・アンド・プランジ法の概要を説明している。
Abstract
単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)による高解像構造決定のための電子を用いた生物学的標本のイメージングには、目的の生体分子を含む亜粒子の薄層が必要です。近年、単粒子cryoEMを構造生物学の最前線に押し上げた多くの技術進歩にもかかわらず、高解像イメージングのために標本をガラス化する方法は、しばしばレート制限ステップのままです。新しいサンプルサポートや革新的なガラス化計器の開発など、標本ガラス化中に頻繁に遭遇するハードルを克服するための多くの最近の努力が提供されていますが、従来の手動操作プランジャーは、購入コストが低く、操作が容易であるため、cryoEMコミュニティの定番のままです。ここでは、単粒子クライオEMによる高解像度イメージングのための生物学的標本のガラス化のための標準のギロチンスタイルの手動操作ブロットとプランジデバイスを使用するための詳細な方法を提供します。また、標準的な準備が適切な標本を得られなかった場合に関する一般的な問題とトラブルシューティングの推奨事項も説明します。
Introduction
単粒子低温電子顕微鏡(クライオエム)は、動的生物学的標本の構造を原子に近い分解能1,2,3,4に解決するために使用できる強力な構造技術です。実際、最近の直接電子検出器技術の進歩 4,5,6,7,8,9,10, 電子源の改善 4,11,12,13,14,電磁気レンズ安定性15と相まってデータ取得の継続的な発展16,17および分析ソフトウェアパッケージ18,19は、研究者が3 Å解像度またはより良い3Åに行き届いた標本の構造を日常的に決定することを可能にしました4,11,11,13,14,20,21,22,23.これらの改善された画像およびデータ処理機能にもかかわらず、cryoEMグリッドの準備は、高解像構造の決定を成功させるための最大の障害であり、しばしばEMワークフロー24、25、26、27においてかなりのボトルネックとなる。
CryoEMは、天然の生化学的状態を維持する「ガラス状」氷(ガラス化と呼ばれるプロセス)の薄膜を形成するために凍結された水溶液中の生物学的サンプルのイメージングに依存しています。クライオEM用の生物学的サンプルのガラス化は40年以上前までさかのぼり、このプロセスのために開発された多くの技術や機器は、当初の詳細なブロットとプランジ法に依存しています31,32,33,34,35 これは、過剰な溶液がブロッティング紙とのグリッドの物理的相互作用を使用して除去される前に、少量のサンプル(例えば、1〜5 μL)が特殊なEMグリッドに適用される。このプロセスのタイミングは、通常、氷のサンプルの重要な成分が膜膜の厚さであるように各標本について経験的に決定されます - 氷が厚すぎると、薄すぎる氷がタンパク質の配向を制限したり、グリッド箔の中心から粒子を除外することができますが、電子ビームの散乱の増加によりイメージング品質が劇的に悪化します36.単粒子クライオEMのための完璧な氷の厚さにこの依存は、ロボティクス37,38、マイクロ流体42、超音波または噴霧装置27,39,40,41,42,43,44を含むサンプルを凍結できる幅広い技術と機器につながっています。.近年、最も人気のあるサンプル調製装置のいくつかは、ブロットとプランジ技術45を使用してサンプルの自動凍結のためのロボット工学の使用に依存しています。これらのデバイスは、イメージング用の適切な氷の厚さを再現的に作成するように設計されていますが、個々のラボが購入して動作するには高価すぎることが多く、一般的にcryoEM施設内で使用のために毎時の料金で見られます。近年、オリジナルのマニュアルブロットアンドプランジ技術は、使用数が増加し、3,47,48,49,50,51,52に戻ってきました。実際、手動で操作されたブロットとプランジデバイスは、ロボットの対応するコストのほんの一部で高品質のクライオEMグリッドを実現できます。さらに、手動ブロッティングは、研究者がブロッティングの種類(すなわち、グリッドのバックブロット、グリッドのフロントブロッティングなど)、および個々のサンプルと研究の質問に基づいてブロット時間を調整できるため、より多くのユーザーがブロッティングを制御することができます。
本稿では、従来の手動ブロットとプランジガラス化装置を使用して、カスタム設計のデュワープラットフォーム53と組み合わせて生物学的サンプルを効果的に凍結する方法について詳しく説明します。クライオゲンの準備、グリッド処理、サンプルアプリケーション、ブロッティングなどのベストプラクティス、これらのハードルを克服する方法に関する一般的な落とし穴と推奨事項が提供されています。グリッド調製の間の氷の厚さを向上させる方法と、生物学的標本の種類に基づいてサンプルブロッティングを変更する方法についてのアドバイスが議論されています。この原稿に記載されている手動プランジャーの購入と操作に関連する低コストを考えると、世界中のラボは、コスト効率が良く再現可能な方法でcryoEMの生物学的標本を調製することができます。
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Protocol
1. 手動の突っ込み環境を準備する
注意:予想運転時間:5~30分
- 加湿器を同じ場所に設置できる4°Cの冷たい部屋で手動プランジャーを探して、相対湿度(RH)の100%近くを維持します(図1A)。
注意:手動プランジャーと推奨操作の安全な場所については、施設の環境安全衛生ガイドラインに従ってください。 - グリッドの準備の前に、冷たい部屋のRHが95%≥であることを確認するために、冷たい部屋で加湿器をオンにします。
注:低湿度でのグリッド調製は、薄膜の脱水、蒸発によるバッファー成分の変更、およびグリッド間再現性の低下につながる可能性があります46。<80% RH でグリッドをフリーズすることは推奨されません。 - 冷たい部屋の温度が4 °Cであることを確認してください。
- 手動プランジャーは、冷たい表面にグリッド付近の乱気流や顕著な氷の蓄積につながる可能性があるため、強い気流(すなわち、空調ユニットの通気孔から離れた)から離れた場所に位置付けます。
2. 突っ込み素材やアクセサリーを用意
注意:予想運転時間:1-5分
- きれいなはさみを使用して、ブロッティング紙の円を幅1〜1.5cm、長さ約9cmに切ります。ブロッティング紙の中心に触れないようにし、小さな端部を捨てます。ブロッティング紙のストリップが乾燥し、清潔で、汚染物質がないことを確認することが重要です。ストリップを分離し、100 mm ペトリ皿に入れます。
- 22x22 mm の正方形のガラスカバースリップを別の 60 mm ガラスペトリ皿に入れます。このカバースリップ含有ガラスペトリ皿は、貯蔵、移動、およびグロー放電グリッドに使用されます。
注:グリッドを追加する前に、スライドから目に見える破片を取り除くためにエアダスター缶を使用することをお勧めします。静電気防止銃は、蓄積する静電気を取り除くためにも使用できます。 - グリッドの格納ボックスをアセンブルおよびラベル付けします。
- 4~6本のクリーンでドライなクランプピンセットを取得し、手動プランジャーに配置します。突っ込む前に各トゥイザーを目視で点検し、損傷を受けず、汚染物質がないことを確認します。
3. クライオゲンデュワーと手動プランジャーを準備します。
注意:予想運転時間:5~15分
- 突っ込んだデュワーの底にプラットフォームベースをインストールします。プラットフォームベースの上にエタン容器デュワーを置き、真鍮エタン容器を追加し、次に回転グリッドストレージプラットフォームを設置します。
- 液体窒素(LN2)が急激なデュワーに加えられると、プラットフォームベースの高さは調整できなくなります。グリッドベースが正しく設置され、不適切なプランジャ高さによるグリッドやトゥイザーの損傷を制限するレベルであることを確認します。
- 凍結する前に、手動プランジャーとすべての補助機器をチェックして、サンプルやグリッドの損失を制限するために適切に機能していることを確認してください。
- 各凍結セッションの前に、ピンセットを保持するために使用される手動プランジャーアームのテープを交換してください。室内の高湿度は、テープの接着剤を劣化させ、ピンセットを保持するテープの能力を低下させ、ピンセットの損傷および/またはグリッド損失の可能性を高める可能性があります。
- 手動プランジャの近くのランプを調整して、サンプルのウィッキングを監視するのに十分な光があることを確認し、グリッドの損傷や損失を防ぐためにグリッド転送が容易に視覚化されるようにします(ステップ3.7を参照)。プランジャーの真後ろにリングランプを使用して液体の動きを視覚化し、デュワー付近の柔軟なアームタスクライトを使用して凍結したグリッドを照らします。
- 足のペダルの張力を調整して、デュワーの突っ込んだ腕が上げられた位置に固定され、ペダルが落ち込んでいるときに完全に解放されるようにします。プランジャが正常に動作していることを確認するために、サンプルアプリケーションの前にいくつかの「ドライ」実行を実行します。
注意:足のペダルテンションを不適切に調整すると、突っ込んだアームの早期解放(すなわち、テンションが低くなり過ぎる)、エタン容器へのグリッド損失や不完全な突っ込み(すなわち、テンションが高すぎる)が発生します。 - 突っ込んだデュワーを手動プランジャーのベースに置き、突っ込んだ腕の真下に置き、所定の位置に固定します。付属のテープを使用して、突っ込んだ腕にピンセットのペアを取り付けます。手動突っ込みアームを保持しながら、 慎重に突 っ込んだ腕を下げ、グリッドがエタン容器の真ん中に位置するように突っ込んだ腕の移動を調整するために足のペダルを押下します。
- 突っ込んだアームの上部にあるバンプストップを使用して、足のペダルが完全に落ち込んでいるときに突っ込んだ腕の最終的な位置を決定します(図1B)。突っ込んだアームのバンプストップの高さを調整して、エタン容器のグリッドの位置を調整します(図1C)。
注:突っ込んだ腕の高さを不適切に設定すると、グリッドやトゥイザーの損傷(例えば、腕の高さの急落が低すぎる)や不十分なガラス化(例えば、急激な腕の高さが高く設定されている)につながる可能性があります。 - 冷たい部屋の外でデュワーを見つけ、液体エタンの準備に進みます(ステップ4)。
4. クライオゲンを準備する
注意:予想運転時間:10-30分
- エタンタンク、レギュレータ、チューブ、エタンの塗布チップを評価し、損傷の兆候がないか確認します。直ちに報告し、続行する前に、損傷の兆候を修正します。
注意:圧縮エタンとエタン:プロパンガスミックスは可燃性であり、不適切に取り扱われた場合、生命に深刻な脅威を与えたり、怪我をしたりする可能性があります。圧縮ガスタンクの操作や取り扱い方法がわからない場合は、専門家にご相談ください。可燃性圧縮ガスの取り扱いについては、施設の環境安全衛生ガイドラインを参照してください。また、リケ化エタンは、適切に処理されない場合、生命や怪我に深刻な脅威を与えることができる強力なクライオゲンです。クライオゲンの取り扱いについては、施設の環境安全衛生ガイドラインをご参照ください。 - 適切なLN2 処理デュワーで十分なLN2 を取得します(すなわち、3-4 Lは、グリッドの準備と保管のために典型的です)。
注意:LN2 は、適切に処理されない場合、生命および/または傷害に深刻な脅威を与えることができるクライオゲンです。- すべての個人保護具が傷害の危険を最小にするために利用されることを確認してください。LN2の蒸気は窒息剤であり、換気の良い場所で扱われるべきである。極低温血管や極低温物質の操作方法がわからない場合は専門家にご相談ください。クライオゲンの取り扱いについては、施設の環境安全衛生ガイドラインをご参照ください。冷たい部屋では液体窒素が使えない場合は、涼しく換気の良い空間で凍結を行うことをおすすめします。
- 冷たい部屋の外で、液体窒素レベルがエタン容器の上部(すなわち、プラットホームのすぐ上)に達するまで、真鍮のエタン容器に直接LN2を注ぐことによって、急激なデュワーを冷やします。必要に応じて、エタン船の外のLN2を上に向けてください。LN2 が激しくバブリングを停止したとき (約 5 分) 次の手順に進みます。
- LN2を真鍮エタン容器に直接加え、エタンガスを凝縮する前に容器を十分に冷却します。真鍮のエタン容器を適切に冷却しないと、エタンの凝縮にかかる時間が劇的に増加します。
- デュワーがLN2 温度に達したら、LN2 がエタン容器にこぼれるようなデュワーを過剰に充填しないようにしてください。
- エタンは圧縮ガスとして来て、使用するために液化する必要がある。エタンタンクはガスの流れを制御するために高純度の二段の調整装置を利用する。チューブをレギュレータの出口バルブに接続し、エタンを分配するために端に接続された14ゲージの平らな金属分配チップを使用します。
- エタンメインタンクバルブを開く前に、圧力調整ノブと出口バルブがずっと閉じられていることを確認してください。メインタンクバルブを完全に開き、出口弁を~50%まで開きます。ゆっくりとしたガスの流れが観察されるまで、圧力調整ノブをゆっくりと開きます。出口弁を使用して、ガスの流れを微調整します。
注意:バルブを開けたり、ガスの流れを調整したりする際には、必ず金属分配チップを自己から遠ざけます。 - ガス流をゆっくりと開始し、エタンガスラインの先端を脱イオン水の小さなビーカーに挿入して流量を評価します。流量が 水を適度に 乱すまで、ガスの流れを調整します。
- 適切なエタン凝縮が発生するようにガス流量を調整する - 流量が遅すぎるとエタンガスが分配チップで固まり、流量が速すぎると激しいバブリングが発生し、凍結を防ぐことができます。
- 真鍮エタン容器にエタンガスラインの先端を挿入する前に、水を除去するために繊細な作業ワイプで分配チップをきれいに拭きます。
- 滑らかで素早い動きで、真鍮のエタン容器の底にガス分配の先端を見つけ、エタン容器の底の周りのゆっくりとした円の中で分配の先端を動かしなさい。固体エタンはすぐに形成されますが、より多くのエタンガスが追加/凝縮されるとすぐに液化します。
- 金属エタン塗布チップをエタン容器の底部で動かし、固体エタンを液化する。エタン容器を液体エタン(上から2~3本の糸)で満杯の3/4まで満たします。真鍮エタン容器から金属エタン分配チップを慎重に取り外し、出口弁を閉じることによって、エタンガスの流れを止める。
- 液体レベルがちょうど真鍮エタン容器に触れるまで、真鍮エタン容器にLN2の追加を避けるために、デュワーの側面に静かに注ぐLN2で急落したデュワーをオフにトップ。泡のふたを突っ込んだデュワーに置き、エタン固化を容易にします。
- LN2は、エタンの固化を助けるために真鍮エタン容器に直接連絡する必要があります。約5分後、真鍮容器内のエタンは完全に凍結した固体となる。それはちょうどエタン容器に触れるまでLN2を追加し、次のステップに進みます。
- エタンが固形物を凍結していない場合、真鍮エタン容器は残りのステップのために十分に冷たくない。それはちょうどエタン容器に触れるまでLN2 を追加し、さらに5分待ちます。真鍮容器内のエタンが完全に固着していることを確認します。
- ガス出口弁を開き、ステップ4.6で決定した同様の速度でエタンガスの流れを生成する。金属エタン塗布チップを固体エタンに垂直に配置し、円運動でエタン塗布先端を動かして固体エタンを溶融させます。
- 真鍮エタン容器の上部と同じレベルになるまでエタンを加え続けます。エタン容器から先端をゆっくりと取り外し、エタンタンク出口バルブを閉じます。デュワーを蓋で覆い、約1~4分で、真鍮のエタン容器の縁を囲んでエタンを固めます。
注:理想的なエタン容器は中央に液体エタンと真鍮エタン容器の周囲に固体エタンの2-3 mm対称リングを持つことになります(図1D と 図2)。 - エタンは、生物学的標本の適切なガラス化を確実にするために固化することなく、できるだけ冷たくすることを確認してください。液体エタンを適切に調製しないと、試料のガラス化、氷の蓄積、および/または標本の損失が発生し、それぞれがイメージングのための標本品質の劣化に寄与する可能性があります。
- 2~3分後にエタンの固体リングが形成されない場合は、デュワーにさらにLN2 を追加し、さらに2〜5分間カバーします。
- エタンが速すぎると、大きなきれいなピンセットを使用してエタン容器や固体エタンを軽く温め、完全なエタン凝固を防ぎます。エタンとLN2 が安定したら、すべてのエタンタンクバルブを閉じて、手動プランジャーに突っ込んだデュワーを見つけます。手動プランジャーに急落のデュワーを確保します。
注意:LN2 がエタン容器にこぼれ、液体エタンを固めることができるので、デュワーを移す際には特別な注意を払ってください。必要に応じて、ピンセットのクリーンなセットを使用して、容器の真ん中にある固体エタンを溶融させることができます。
- 真鍮エタン容器の上部と同じレベルになるまでエタンを加え続けます。エタン容器から先端をゆっくりと取り外し、エタンタンク出口バルブを閉じます。デュワーを蓋で覆い、約1~4分で、真鍮のエタン容器の縁を囲んでエタンを固めます。
- テインジの先端がエタン容器の中心に位置し、液体エタンの中にグリッドとピンセットチップのための十分なスペースがあることを確認するために、空のピンセットのペアでエタンデュワーの位置をテストします(図1D)。
- 固体エタンリングが容易なグリッド処理のために厚すぎる場合は、室温、きれいなピンセットを使用して固体エタンを溶融し、エタン容器の中心により多くの凍結領域を作成します。
5. EM グリッドの準備
注意:予想運転時間:1-5分
- グリッドストレージボックスをデュワーに追加し、グリッドストレージボックスの蓋を緩め、各蓋が新しいグリッドスロットに自由に回転できることを確認します。
- グリッドをグリッド収納ボックスから正方形のガラスカバースリップの端に慎重に移動し、グリッドの30~40%をスライドエッジから外します。グリッドフォイルが上向きになっていることを確認します。使用しない場合は、グリッドがカバーされていることを確認します。正方形のガラスカバースリップの端にグリッドを置くことは、グリッドの取り扱いの容易さを提供し、転送中にグリッドを曲げたり損傷する可能性を減少させます。
注: 通常、4~6 グリッドは一度に用意されています。 - グロー放電器またはプラズマクリーナーを使用して、親水性のグリッドをレンダリングします。
注:グロー放電/プラズマクリーナーメーカーが提供するグリッドクリーニングの推奨ガイドラインを参照してください。- グリッドは親水性を失い、グリッド間の再現性がこの時間の後に減少するため、プラズマ洗浄から10分以内にグリッドを使用します。
6. 凍結のプランジによりクライオEM標本を準備する
注意:推定動作時間:>10分(グリッドあたり1〜3分)
- クリーンで乾燥したクランプ用ピンセットを使用して、クリーニングされたグリッドを拾い、プラスチック製のクランプをスライドさせてグリッドを固定し、ピンセットを軽くタップしてグリッドが適切に固定されていることを確認します。
- グリッドフォイルの損傷を防ぐために、外側のリングでグリッドを取り扱います。
- グリッドの調製側(例えば、前面またはホイル側)に1~5μLのサンプルを塗布します。
注:最適なボリュームとブロッティング時間はサンプルに依存し、各サンプルに合わせて最適化する必要があります。より大きい容積およびより粘性のサンプルはより長いブロット時間を要求する。 - トゥイザーグリッドサンプルアセンブリを、トゥイザーハンドルの周りにテープを巻いて手動の突っ込みアームに固定します。
- 従来のフロントブロッティングのために、サンプルをユーザーの方に向けて見てください。サンプルがバックブロッティングを必要とする場合は、サンプルをユーザーから離して見つけます。
- 各手の親指と人差し指の間に、清潔で乾燥した切れたブロット紙を持ちます。
- 唯一の端からブロッティングペーパーを扱い、手や手袋からの油や他の汚染物質がグリッド品質を変更することができるので、中心に触れることはありません。
- 安定した位置を確立するために、急激なデュワーの端に手を置きます。ブロッティングペーパーをグリッドサーフェスから約1cm離れたグリッドサーフェスに平行に配置します。
- ブロッティングペーパーの中央部を使用して、完全な流体移動性を実現し、グリッド表面を横切るウィッキングを可能にします。
- 親指と指指を互いにそっとスライドさせて回転させ、ブロット紙をグリッドに向かって曲げてブロッティングを開始します。ブロッティングプロセス全体で、ブロッティング紙とグリッド表面との接触を維持します。
- ブロッティングペーパーをグリッドサーフェスに直接接続し、グリッドサーフェス全体で一貫した接触を維持します。
- ブロッティング紙を軽く曲げると、グリッドの曲げやグリッド表面の損傷が減少し、グリッド全体の氷の一貫性が高くなります(図3A)。
- 移動式液体の前面を観察し、ブロッティングペーパーへの進行が止まると、4〜6秒間カウントを開始します。
注: カウンティングは、ブロッティング紙がグリッドサーフェスに接触すると発生する可能性がありますが、グリッド間の再現性が低くなる可能性があります。総ブロット時間は、グリッドタイプ、ホイルタイプ、サンプル濃度、サンプルタイプ(例えば、可溶性対膜対糸状タンパク質)によって異なります。より粘性の高いサンプルの場合は、より長いブロット時間(例えば、5〜7秒)が必要になります。- 重要: 凍結プロセス中の再現性を大幅に向上させる、信頼性と一貫性のあるカウントスキームを開発します。
- 左、右手の親指、人差し指を反対方向に動かして、グリッドサーフェスから離れた「スナップモーション」でブロッティングペーパーを取り除きます。すぐに足のペダルを落として突っ込んだ腕を解放し、液体エタンにグリッドを突っ込む。
- 同時にブロッティング紙を取り外し、足のペダルを押して、できるだけ早くエタンにグリッドを突っ込んで最高の凍結結果を得ます。ブロッティング紙の除去と突っ込みの間の時間が長いほど、薄膜の蒸発が増え、グリッド間の再現性が低下します。
- 片手でピンセットを安定させ、ピンセットの周りからテープを慎重に巻き戻し、手動突っ込みアームを使用します。
- 必ずトゥイザーとの接触を維持し、トゥイザーグリッドの動きを防ぎ、固体エタンに対してグリッドをノックすることから生じるグリッドの損傷を制限します。
- ピンセットをクランプすると、手動突っ込みアームから解放され、突っ込んだデュワーの上に片手でピンセットを維持し、グリッドが液体エタンに残っていることを確認します。グリッドを移動できるように、プラスチッククランプをグリッドから慎重にスライドさせます。グリッドを保持するためにピンセットの圧力を維持します。
- 1つの迅速な動きで、すぐにLN2 の貯蔵所にエタン容器から格子を移す。グリッドストレージボックスにグリッドを慎重に配置します。
注: 一部のエタンは、グリッドサーフェス上で固化することがあります。トゥイーザを少し開くと、エタンが壊れ、グリッドがグリッドボックスにドロップされます。
- 1つの迅速な動きで、すぐにLN2 の貯蔵所にエタン容器から格子を移す。グリッドストレージボックスにグリッドを慎重に配置します。
- 霜の蓄積を防ぐために繊細なタスクワイプでピンセットの先端を包みます。ピンセットが室温に戻るまで脇に置きます。
- 使いやすさのために手元に4〜6ピンセットを持っています。各トゥイザーはサンプルの凍結のために使用され、その後の使用の前に温める。
- 各グリッドに対して手順 6.1 ~ 6.11 を繰り返します。
- フリーズが最高潮に達したら、グリッドボックスを安全に閉じ、適切な保管場所に転送します。
- 慎重に液体エタンとLN2 を処分し、乾燥した場所にすべての材料を保管してください。
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Representative Results
ここで説明するブロット・アンド・プランジプロトコルの実行に成功すると、電子顕微鏡下で観察できる六角形の氷、汚染物質、および使用できない氷の大きな勾配のない薄く均一な層のビトレウス氷が生じる(図3)。ブロッティング紙とグリッド表面との接触が一貫していない、ブロッティング紙を早期に取り外す、またはグリッド接触中にブロッティング紙を動かすと、バイトレウス氷の品質が低下し、EMグリッド全体で氷の厚みが一貫していない可能性があります(図4)
図1:検体突っ込み室と必要な機器。A)この記事で概説されている伝統的なブロットとプランジデバイスを使用して、生物学的標本の手動凍結のための冷たい部屋を上演しました。必要な機器が表示され、それに応じてラベルが付けられます。 B) 手動プランジャの動作高さを調整するには、手動突っ込みアームを上下にスライドさせて、ねじを締めて固定して、バンプストップを調整します。 C)エタン容器と紡糸グリッド貯蔵プラットフォームのズームインビューは、空の真鍮エタン容器内のクランプピンセットとグリッドの適切な高さと位置を示す。ピンセットとグリッドは、損傷を避けるために、真鍮の側面や底部に接触しないでください。 D)液体エタン内のクランプピンセットとグリッドの適切な高さと位置。ピンセットとグリッドは、周囲の固体エタンとの接触を避け、中央の液体エタンに入る必要があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:液体エタンを調製した。 試料凍結前の真鍮エタン容器内の液体エタンの状態を示す急激なデュワーのズームインビュー。真鍮エタン容器内の固体エタンの2-3 mmのリングははっきり見える。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マニュアルブロット・アンド・プランジ技術を用いて得られた代表的なアポフェリチン画像(A)手動ブロット・アンド・プランジ技術を用いて得ることができるグリッド四角形の氷の厚さと品質を示すcryoEMグリッドの代表的なアトラス。(B)カリフォルニア大学サンディエゴ校のクライオエムファシリティで、200kV透過型電子顕微鏡を用いて取得したガラス化マウスアポフェリチンの動き補正顕微鏡。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:グリッド全体に一貫性のない氷の厚さ、多数の壊れた正方形、および氷が厚すぎて標本をイメージする領域を示す最適でないcryoEMグリッドの代表的なアトラス。
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Discussion
単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)によるイメージングのための生物学的標本のガラス化は、構造決定を成功させるための極めて重要なステップであり続ける。このプロトコルで説明されている手動のブロットとプランジ法は、クライオEMイメージング用の氷の薄膜中の生物学的サンプルを迅速に凍結するための費用対効果の高い、信頼性の高い、堅牢な方法を表します。原稿に記載されている方法を使用して、研究者は手動プランジャーを組み立てて操作し、フラッシュ凍結生物学的サンプルに適したクライオゲンを準備し、生物学的標本を含む手動でブロットとプランジEMグリッドを作成することができます。この方法は非常に堅牢ですが、この手順の重要な手順では、高解像度イメージングに最適な氷の厚さと品質を得るために注意する必要があります。以下に、これらの重要な手順のいくつかを概説し、これらの手順のトラブルシューティング方法に関する推奨事項を示します。
グリッドが突っ込んだ後に真鍮容器内の液体エタンの中心に位置することを確認するために、手動の突っ込みアームを適切に配置することが不可欠です。突っ込んだ腕の高さや位置が不適切で、ピンセットを適切に固定しないと、ピンセット、EMグリッド、およびマニュアルプランジャーの損傷につながります。上記で説明したように、我々は、EMグリッドが成功した後に真鍮エタン容器の中心に位置することを確認するために、生物学的標本を準備する前に、常に少なくとも1つの試運転を行います(図1C)。また、各グリッドが凍結した後の突っ込みデュワーの位置を微調整し、エタン容器内のグリッド配置を微調整します(図1D)。
エタンクライオゲンの適切な調製は、膜炎中の生物学的標本の薄膜を得るために重要である。真鍮エタン容器の内縁に固体エタンの2〜3mmのリングが存在することで、液体エタンの温度がサンプルガラス化に最適であることを確認しました(図2)。確かに、各グリッドが凍結された後、我々はエタンの品質を監視し、わずかな調整を行います - あまりにも多くのエタンが固まった場合は容器をわずかに温めるか、システムがウォームアップした場合、エタンを冷却する - 必要に応じて。室温のトゥイザーの端は、1〜5分間泡蓋でデュワーを覆いながら固体エタンを液化するのに十分であることを発見しました。重要なことは、グリッド表面を準備する前に(すなわち、プラズマクリーニング)、サンプルをグリッドに適用する前に、再現性の高くないグリッド調製に別の変数を導入することができるので、これらの調整を行います。
最後に、グリッドツーグリッドの再現性を高めるために、標準化されたブロットとプランジルーチン(サンプルアプリケーション、サンプルブロッティング、ブロッティング時間)を開発することをお勧めします。消し紙をEMグリッドに向かって曲げると、グリッドとの用紙の均一な接触が可能になり、グリッド全体でより一貫した氷厚が生成され、グリッドホール内の粒子分布も均一になります(図3Aと図Bはそれぞれ)。このブロッティング方法は、グリッド全体に氷の厚さの勾配をもたらす可能性のある角度で標本と相互作用するロボットブロッティングデバイスとは対照的です。さらに、このブロッティングペーパーの屈曲は、ユーザが適用する力をバッファリングすることによって、ブロッティング紙と接触したときにEMグリッドを損傷する可能性も低下する。目的のブロッティング時間の後、手動突っ込みアームの解放時にグリッドへの損傷を防ぐために突っ込む前に、迅速にブローティング紙をグリッド表面から離れて移動するスナップモーションを実行することによって、ブロッティング紙をまっすぐにします。このブロッティング法とブロッティング紙のスナップモーションは、フットペダルを介して手動突っ込みアームの同時放出に伴ってタイミングを合わせると、ガラス化前の薄膜の蒸発を制限し、グリッドツーグリッド再現性を高めます。
ここで説明する手動のブロットとプランジの方法は、cryoEMが新興ラボに置くことができる財政的負担の一部を軽減するのに役立つ堅牢で信頼性の高い方法です。この方法は再現可能ですが、cryoEMに適した高品質のバイトレウス氷を作ることは、個々の研究者の経験とスキルに依存しています。ロボットプランジャーやその他の新興技術は、凍結プロセスのいくつかの側面を自動化しますが、一般的に研究者に提供する制御の量によって制限され、多くの場合、購入と運用のために高い価格が発生します。このプロトコルで概説されている方法により、研究者はサンプルの種類と特性に基づいて、急落条件(すなわち、ブロッティング紙の種類、ブロッティング角度、ブロッティング時間、ブロット方向など)を最適化する柔軟性を提供する手頃で汎用性の高いEMグリッド調製プラットフォームを利用することができます。
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Disclosures
私たちは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、この原稿とビデオコンテンツについて批判的に考え、フィードバックを提供してくれたHerzikラボのメンバーに感謝します。M.A.H.Jr.はNIH R35 GM138206およびサール学者によってサポートされています。H.P.M.Nは分子生物物理学トレーニンググラント(NIH T32 GM008326)によってサポートされています。また、スクリプス研究所のビル・アンダーソン、チャールズ・ボウマン、ガブリエル・ランダー博士に感謝し、ビデオに示されている手動プランジャーの設計、組み立て、テストを支援したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
References
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).
