Summary
Ce manuscrit décrit la méthode de transfert et de plongée pour congeler manuellement des échantillons biologiques pour la microscopie électronique cryogénique à particule unique.
Abstract
L’imagerie d’échantillons biologiques avec des électrons pour la détermination de la structure à haute résolution par microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) nécessite une fine couche de glace vitrée contenant les biomolécules d’intérêt. Malgré les nombreuses avancées technologiques de ces dernières années qui ont propulsé le cryoEM monoparticule à l’avant-garde de la biologie structurale, les méthodes par lesquelles les spécimens sont vitrifiés pour l’imagerie à haute résolution restent souvent l’étape limitante du débit. Bien que de nombreux efforts récents aient fourni des moyens de surmonter les obstacles fréquemment rencontrés lors de la vitrification des échantillons, y compris le développement de nouveaux supports d’échantillons et d’instruments de vitrification innovants, le piston à commande manuelle traditionnelle reste un élément de base dans la communauté cryoEM en raison du faible coût d’achat et de la facilité d’utilisation. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour l’utilisation d’un dispositif de transfert et de plongeon standard de type guillotine à commande manuelle pour la vitrification d’échantillons biologiques pour l’imagerie à haute résolution par cryoEM à particule unique. En outre, les problèmes fréquemment rencontrés et les recommandations de dépannage lorsqu’une préparation standard ne parvient pas à produire un échantillon approprié sont également décrits.
Introduction
La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est une technique structurelle puissante qui peut être utilisée pour résoudre des structures d’échantillons biologiques dynamiques à une résolution quasi atomique1,2,3,4. En effet, les progrès récents dans les technologies de détecteurs d’électrons directs4,5,6,7,8,9,10, les améliorations des sources d’électrons4,11,12,13,14 et la stabilité des lentilles électromagnétiques15, associés au développement continu de l’acquisition de données 16,17 et des progiciels d’analyse18,19 ont permis aux chercheurs de déterminer systématiquement les structures de spécimens bien élevés à une résolution de 3 Å ou mieux4,11,13,14,20,21,22,23 . Malgré ces capacités améliorées d’imagerie et de traitement des données, la préparation de la grille cryoEM reste le principal obstacle à la détermination réussie de la structure à haute résolution et constitue souvent un goulot d’étranglement considérable dans le flux de travail EM24,25,26,27.
CryoEM s’appuie sur l’imagerie d’échantillons biologiques dans des solutions aqueuses qui sont congelées pour former un mince film de glace « semblable à du verre » - un processus connu sous le nom de vitrification - qui préserve l’état biochimique natif. La vitrification d’échantillons biologiques pour cryoEM remonte à plus de 40 ans28,29,30 et de nombreuses techniques et équipements développés pour ce processus reposent sur la méthode de transfert et de plongeon initialement détaillée31,32,33,34,35 , par lequel un petit volume d’échantillon (p. ex., 1 à 5 μL) est appliqué sur une grille EM spécialisée avant que la solution excédentaire ne soit éliminée à l’aide de l’interaction physique de la grille avec du papier buvard. Le moment de ce processus est généralement déterminé empiriquement pour chaque échantillon, car un élément essentiel de la congélation des échantillons est l’épaisseur du film de glace vitré - si la glace est trop épaisse, la qualité de l’imagerie se détériore considérablement en raison de la diffusion accrue du faisceau d’électrons, tandis que la glace trop mince peut restreindre l’orientation des protéines et / ou exclure les particules du centre des trous de feuille de grille36 . Cette dépendance à l’épaisseur de glace parfaite pour le cryoEM à particule unique a conduit à un large éventail de techniques et d’équipements capables de congeler des échantillons, notamment la robotique37,38, la microfluidique42 et les appareils à ultrasons ou de pulvérisation27,39,40,41,42,43,44 . Ces dernières années, certains des dispositifs de préparation d’échantillons les plus populaires reposent sur l’utilisation de la robotique pour la congélation automatisée des échantillons à l’aide de la technique de transfert et de plongeon45. Bien que ces dispositifs soient conçus pour créer de manière reproductible une épaisseur de glace appropriée pour l’imagerie, ils restent souvent trop coûteux pour que les laboratoires individuels puissent les acheter et les exploiter et se trouvent généralement dans les installations cryoEM à des taux horaires d’utilisation. Au cours des dernières années, la technique originale de transfert et de plongeon manuel est revenue à une utilisation accrue3,47,48,49,50,51,52. En effet, un dispositif de transfert et de plongeon à commande manuelle peut obtenir des grilles cryoEM de haute qualité à une fraction du coût des homologues robotiques. En outre, le buvard manuel offre également aux utilisateurs un plus grand contrôle sur le buvard, car les chercheurs peuvent ajuster le type de transfert (c.-à-d. le transfert arrière de la grille, le transfert avant de la grille, etc.) et le temps de transfert en fonction de chaque échantillon individuel et des questions de recherche.
Dans cet article, nous fournissons des détails sur la façon de congeler efficacement des échantillons biologiques à l’aide d’un dispositif de vitrification manuelle traditionnelle par transfert et par immersion couplé à une plate-forme dewar conçue sur mesure53. Les meilleures pratiques, y compris la préparation du cryogène, la manipulation de la grille, l’application d’échantillons et le buvard, ainsi que les pièges courants et les recommandations sur la façon de surmonter ces obstacles sont fournies. Des conseils sur la façon d’augmenter la reproductibilité de l’épaisseur de la glace entre les préparations de grille et sur la façon de modifier le buvard d’échantillon en fonction du type d’échantillon biologique sont discutés. Compte tenu du faible coût associé à l’achat et à l’utilisation du piston manuel décrit dans ce manuscrit, les laboratoires du monde entier peuvent préparer des échantillons biologiques pour cryoEM de manière rentable et reproductible.
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Protocol
1. Préparez l’environnement de plongée manuelle
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 5-30 minutes
- Placez le piston manuel dans une chambre froide à 4 °C où un humidificateur peut être co-localisé pour maintenir la pièce à près de 100 % d’humidité relative (HR) (Figure 1A).
ATTENTION : Veuillez consulter les lignes directrices de l’institution en matière de santé et de sécurité environnementales pour connaître l’emplacement sécuritaire du piston manuel et les opérations recommandées. - Avant la préparation de la grille, allumez l’humidificateur dans la chambre froide pour vous assurer que l’HR de la chambre froide est ≥ 95 %.
REMARQUE: La préparation de la grille dans un faible taux d’humidité peut entraîner une déshydratation des couches minces, une altération des composants tampons due à l’évaporation et une diminution de la reproductibilité de la grille à la grille46. Il n’est pas recommandé de geler les grilles à <80 % HR. - Assurez-vous que la température de la chambre froide est à 4 °C.
- Placez le piston manuel loin des forts courants d’air (c.-à-d. loin des bouches d’aération de l’unité de climatisation), car ils peuvent entraîner des turbulences près des grilles et/ou une accumulation de glace proéminente sur les surfaces froides.
2. Préparez des matériaux et des accessoires plongeants
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 1-5 minutes
- Utilisez des ciseaux propres pour couper les cercles de papier buvard en bandes de 1 à 1,5 cm de large et d’environ 9 cm de long. Évitez de toucher le centre du papier buvard et jetez les plus petits embouts. Il est important de s’assurer que les bandes de papier buvard sont sèches, propres et exemptes de contaminants. Séparez les bandes et placez-les dans une boîte de Petri de 100 mm.
- Placez un couvercle en verre carré de 22 x 22 mm dans une boîte de Petri en verre séparée de 60 mm. Cette boîte de Petri en verre contenant des couvercles sera utilisée pour stocker, transférer et évacuer les grilles de décharge incandescente.
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser un dépoussiéreur à air pour enlever tout débris visible de la diapositive avant d’ajouter des grilles. Un pistolet antistatique peut également être utilisé pour éliminer toute électricité statique qui s’accumule. - Assemblez et étiquetez les boîtes de stockage en grille.
- Procurez-vous 4 à 6 pinces à pince propres et sèches et placez-les dans le piston manuel. Inspectez visuellement chaque pince avant de plonger pour vous assurer qu’elle n’est pas endommagée et qu’elle est exempte de contaminants.
3. Préparez le dewar cryogénique et le piston manuel
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 5-15 minutes
- Installez la base de la plate-forme au bas du dewar plongeant. Placez le dewar du récipient à éthane sur la base de la plate-forme, ajoutez le récipient en laiton ethane, puis installez la plate-forme de stockage de la grille tournante.
- Une fois que de l’azote liquide (LN2) est ajouté au dewar plongeant, la hauteur de la base de la plate-forme ne peut plus être ajustée. Assurez-vous que la base de la grille est correctement installée et qu’elle est de niveau pour limiter les dommages à la grille et / ou à la pince à épiler en raison d’une hauteur de piston incorrecte.
- Avant la congélation, vérifiez le piston manuel et tous les équipements auxiliaires pour vous assurer qu’ils fonctionnent correctement afin de limiter la perte d’échantillons et/ou de grilles.
- Avant chaque séance de congélation, remplacez le ruban adhésif sur le piston manuel utilisé pour tenir la pince à épiler. L’humidité élevée de la pièce peut détériorer l’adhésif et diminuer la capacité du ruban à tenir la pince à épiler, ce qui augmente le risque d’endommagement de la pince et / ou de perte de grille.
- Ajustez la ou les lampes près du piston manuel pour vous assurer qu’il y a suffisamment de lumière pour surveiller l’évacuation des échantillons et vous assurer que le transfert de grille est facilement visualisé pour éviter les dommages et/ou la perte de grille (voir l’étape 3.7). Utilisez une lampe annulaire directement derrière le piston pour visualiser le mouvement du liquide et une lumière de travail flexible près du dewar pour éclairer les grilles gelées.
- Ajustez la tension de la pédale pour vous assurer que le bras plongeant dewar est solidement maintenu en place en position surélevée et est complètement relâché lorsque la pédale est enfoncée. Effectuez plusieurs exécutions « sèches » avant l’application de l’échantillon pour vous assurer que le piston fonctionne correctement.
REMARQUE : Un mauvais réglage de la tension de la pédale entraînera un relâchement prématuré du bras plongeant (c.-à-d. que la tension est réglée trop bas) et une perte de grille ou une plongée incomplète de la grille dans le récipient éthane (c.-à-d. que la tension est trop élevée). - Placez le dewar plongeant à la base du piston manuel directement sous le bras plongeant et fixez-le en place. Fixez une pince à épiler au bras plongeant à l’aide du ruban adhésif attaché. Tout en tenant le bras plongeant manuel, appuyez sur la pédale pour abaisser soigneusement le bras plongeant et ajustez la course du bras plongeant pour vous assurer que la grille se localisera au milieu du récipient à éthane.
- Utilisez la butée de bosse en haut du bras plongeant pour déterminer la position finale du bras plongeant lorsque la pédale est complètement enfoncée (Figure 1B). Ajustez la hauteur de l’arrêt de la bosse sur le bras plongeant pour ajuster l’emplacement de la grille dans le récipient d’éthane (Figure 1C).
REMARQUE : Un mauvais réglage de la hauteur du bras plongeant peut entraîner des dommages à la grille et/ou à la pince (par exemple, la hauteur du bras plongeant est trop basse) ou une vitrification inadéquate (par exemple, la hauteur du bras plongeant est trop élevée). - Localisez le dewar à l’extérieur de la chambre froide et procédez à la préparation de l’éthane liquide (étape 4).
4. Préparer le cryogène
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 10-30 minutes
- Évaluez le réservoir d’éthane, le détendeur, le tuyau et l’embout de distribution d’éthane pour détecter tout signe de dommage. Signalez et rectifiez immédiatement tout signe de dommage avant de continuer.
ATTENTION : Éthane comprimé et éthane : les mélanges de gaz propane sont inflammables et peuvent constituer une menace grave pour la vie et/ou causer des blessures s’ils sont mal manipulés. Veuillez consulter un expert si vous ne savez pas comment faire fonctionner ou manipuler les réservoirs de gaz comprimé. Veuillez consulter les lignes directrices de l’institution en matière de santé et de sécurité environnementales lorsque vous manipulez des gaz comprimés inflammables. De plus, l’éthane liquéfié est un cryogène puissant qui peut constituer une menace sérieuse pour la vie et/ou les blessures s’il n’est pas manipulé correctement. Veuillez consulter les lignes directrices de l’institution en matière de santé et de sécurité environnementales lors de la manipulation de cryogènes. - Acquérir suffisamment de LN2 dans un dewar de manutention LN2 approprié (c’est-à-dire que 3-4 L est typique pour la préparation et le stockage du réseau).
ATTENTION : Le LN2 est un cryogène qui peut constituer une menace sérieuse pour la vie et/ou les blessures s’il n’est pas manipulé correctement.- Assurez-vous que tout l’équipement de protection individuelle est utilisé pour minimiser le risque de blessure. La vapeur de LN2 est un asphyxiant et doit être manipulée dans des zones bien ventilées. Veuillez consulter un expert si vous ne savez pas comment faire fonctionner ou manipuler les vaisseaux cryogéniques et les cryogènes. Veuillez consulter les lignes directrices de l’institution en matière de santé et de sécurité environnementales lors de la manipulation de cryogènes. Pour les situations dans lesquelles l’azote liquide ne peut pas être utilisé dans une chambre froide, nous recommandons de plonger la congélation dans un espace frais et bien ventilé.
- À l’extérieur de la chambre froide, refroidissez le dewar plongeant en versant du LN2 directement dans le récipient d’éthane en laiton jusqu’à ce que le niveau d’azote liquide atteigne le sommet du récipient d’éthane (c’est-à-dire juste au-dessus de la plate-forme). Complétez le LN2 à l’extérieur du récipient d’éthane au besoin. Passez à l’étape suivante lorsque le LN2 cesse de bouillonner violemment (environ 5 minutes).
- Ajouter LN2 directement à la cuve d’éthane en laiton pour refroidir suffisamment la cuve avant de condenser le gaz éthane. Si vous ne refroidissez pas correctement le récipient d’éthane en laiton, le temps nécessaire à la condensation de l’éthane augmentera considérablement.
- Une fois que le dewar a atteint la température LN2 , évitez de trop remplir le dewar de sorte que LN2 se déverse dans le récipient d’éthane.
- L’éthane se présente sous forme de gaz comprimé et doit être liquéfié pour être utilisé. Le réservoir d’éthane utilise un régulateur à deux étages de haute pureté pour contrôler le débit de gaz. Connectez le tuyau à la vanne de sortie du régulateur et utilisez une embout de distribution métallique plat de calibre 14 connecté à l’extrémité pour la distribution d’éthane.
- Avant d’ouvrir la vanne principale du réservoir d’éthane, assurez-vous que le bouton de réglage de la pression et la vanne de sortie sont fermés tout le long. Ouvrez complètement la vanne du réservoir principal, puis ouvrez la vanne de sortie à ~ 50%. Ouvrez lentement le bouton de réglage de la pression jusqu’à ce qu’un débit de gaz lent soit observé. Utilisez la vanne de sortie pour affiner le débit de gaz.
ATTENTION: Pointez toujours la pointe de distribution métallique loin de vous-même lorsque vous ouvrez les vannes ou effectuez des ajustements de débit de gaz. - Démarrez lentement le débit de gaz et évaluez le débit en insérant l’extrémité de la conduite de gaz éthane dans un petit bécher d’eau désionisée. Ajustez le débit de gaz jusqu’à ce que le débit perturbe modérément l’eau.
- Ajustez le débit de gaz pour vous assurer qu’une condensation correcte de l’éthane se produit - un débit trop lent entraînera la solidification du gaz éthane dans la pointe de distribution et un débit trop rapide entraînera un bouillonnement intense et empêchera le gel.
- Avant d’insérer l’extrémité de la conduite de gaz éthane dans le récipient en laiton et éthane, nettoyez et essuyez l’embout de distribution avec des lingettes de travail délicates pour éliminer toute eau.
- Dans un mouvement doux et rapide, localisez l’extrémité de distribution de gaz au fond du récipient d’éthane en laiton et commencez à déplacer l’extrémité de distribution dans un cercle lent autour du fond du récipient d’éthane. L’éthane solide se formera immédiatement, mais se liquéfiera rapidement à mesure que plus de gaz éthane est ajouté / condensé.
- Continuez à déplacer l’embout de distribution d’éthane métallique au fond du récipient d’éthane pour liquéfier l’éthane solide. Remplissez le récipient d’éthane aux 3/4 plein d’éthane liquide (2-3 fils du haut). Arrêtez l’écoulement du gaz éthane en retirant soigneusement l’embout de distribution d’éthane métallique du récipient en laiton et en fermant la vanne de sortie.
- Complétez le dewar plongeant avec LN2 versant doucement sur le côté du dewar pour éviter l’ajout de LN2 au récipient d’éthane en laiton, jusqu’à ce que le niveau de liquide touche simplement le récipient d’éthane en laiton. Placez le couvercle en mousse sur le dewar plongeant pour faciliter la solidification de l’éthane.
- Le LN2 doit entrer directement en contact avec le récipient en laiton-éthane pour faciliter la solidification de l’éthane. Après environ 5 minutes, l’éthane dans le récipient en laiton deviendra complètement congelé solide. Ajoutez plus de LN2 jusqu’à ce qu’il touche simplement le récipient d’éthane et passez à l’étape suivante.
- Si l’éthane n’a pas gelé solidement, le récipient en laiton ethane n’est pas assez froid pour les étapes restantes. Ajoutez plus de LN2 jusqu’à ce qu’il touche simplement le récipient d’éthane et attendez 5 minutes supplémentaires. Assurez-vous que l’éthane à l’intérieur du récipient en laiton est complètement congelé solide.
- Ouvrez la vanne de sortie de gaz pour produire un débit de gaz éthane à un débit de gaz similaire à celui déterminé à l’étape 4.6. Placez verticalement l’embout de distribution d’éthane métallique dans l’éthane solide et continuez à déplacer l’embout de distribution d’éthane dans un mouvement circulaire pour faire fondre l’éthane solide.
- Continuez d’ajouter de l’éthane jusqu’à ce qu’il soit au niveau du haut du récipient d’éthane en laiton. Retirez lentement la pointe du récipient d’éthane et fermez la vanne de sortie du réservoir d’éthane. Couvrez le dewar avec le couvercle pendant environ 1 à 4 minutes pour laisser l’éthane se solidifier autour des bords du récipient en laiton ethane.
REMARQUE: Un récipient d’éthane idéal aura un anneau symétrique de 2-3 mm d’éthane solide au périmètre du récipient d’éthane en laiton avec de l’éthane liquide au centre (Figure 1D et Figure 2). - S’assurer que l’éthane est aussi froid que possible sans se solidifier pour assurer une vitrification adéquate de l’échantillon biologique. Le défaut de préparer correctement l’éthane liquide peut entraîner une vitrification inadéquate de l’échantillon, une accumulation de glace et/ou une perte d’échantillon, chacun contribuant à la détérioration de la qualité de l’échantillon pour l’imagerie.
- Si un anneau solide d’éthane ne se forme pas après 2-3 minutes, ajoutez plus de LN2 au dewar et couvrez pendant 2-5 minutes de plus.
- Si l’éthane se solidifie trop rapidement, utilisez une grande pince à épiler propre pour réchauffer doucement le récipient éthane et / ou l’éthane solide pour éviter une solidification complète de l’éthane. Une fois que l’éthane et le LN2 sont stables, fermez toutes les vannes du réservoir d’éthane et localisez le plongeur plongeur sur le piston manuel. Fixez le dewar plongeant au piston manuel.
ATTENTION: Soyez très prudent lors du transfert du dewar car LN2 peut se déverser dans le récipient d’éthane et solidifier l’éthane liquide. Si nécessaire, un ensemble propre de pinces à épiler peut être utilisé pour faire fondre tout éthane solide au milieu du récipient.
- Continuez d’ajouter de l’éthane jusqu’à ce qu’il soit au niveau du haut du récipient d’éthane en laiton. Retirez lentement la pointe du récipient d’éthane et fermez la vanne de sortie du réservoir d’éthane. Couvrez le dewar avec le couvercle pendant environ 1 à 4 minutes pour laisser l’éthane se solidifier autour des bords du récipient en laiton ethane.
- Testez l’emplacement du dewar éthane avec une paire de pinces à épiler vides pour vous assurer que la pointe de la pince se trouve au centre du récipient éthane et qu’il y a suffisamment d’espace pour la grille et la pointe de la pince à l’intérieur de l’éthane liquide (Figure 1D).
- Si l’anneau éthane solide est trop épais pour faciliter la manipulation de la grille, utilisez une pince à épiler propre à température ambiante pour faire fondre l’éthane solide et créer plus de zone de congélation au centre du récipient éthane.
5. Préparer les grilles EM
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: 1-5 minutes
- Ajoutez la ou les boîtes de stockage de grille au dewar, dévissez le ou les couvercles de la boîte de stockage de grille et assurez-vous que chaque couvercle peut pivoter librement vers un nouvel emplacement de grille.
- Transférez soigneusement les grilles de la boîte de stockage de la grille vers le bord de la glissière de couverture en verre carré avec ~ 30-40% de la grille sur le bord de la glissière. Assurez-vous que la feuille de grille est tournée vers le haut. Assurez-vous que les grilles sont couvertes lorsqu’elles ne sont pas utilisées. Placer les grilles sur le bord du couvercle en verre carré facilite la manipulation de la grille et réduit le risque de plier ou d’endommager la grille pendant le transfert.
REMARQUE: 4-6 grilles sont généralement préparées à la fois. - Rendre les grilles hydrophiles à l’aide d’un dissipateur de lueur ou d’un nettoyeur plasma.
REMARQUE: Veuillez vous référer aux directives recommandées pour le nettoyage de grille fournies par le fabricant du déchargeur de lueur / nettoyeur plasma.- Utilisez les grilles dans les 10 minutes suivant le nettoyage au plasma, car les grilles perdent de l’hydrophilie et la reproductibilité de grille à grille diminue après cette période.
6. Préparer l’échantillon cryoEM par congélation par congélation par immersion
REMARQUE: Temps de fonctionnement estimé: >10 minutes (~ 1-3 min par grille)
- Utilisez une pince à pince propre et sèche pour ramasser une grille nettoyée, faites glisser la pince en plastique pour fixer la grille en place et tapotez doucement la pince à épiler pour vous assurer que la grille est correctement fixée.
- Manipulez les grilles près de l’anneau extérieur pour éviter d’endommager la feuille de grille.
- Appliquer 1 à 5 μL d’échantillon sur le côté préparé (p. ex., côté avant ou feuille) de la grille.
REMARQUE: Le volume optimal et le temps de buvard dépendent de l’échantillon et doivent être optimisés pour chaque échantillon; des volumes plus importants et des échantillons plus visqueux nécessitent des temps de buvardage plus longs. - Fixez l’ensemble pince-grille-échantillon au bras de plongée manuel en enroulant du ruban adhésif autour de la poignée de la pince.
- Faites face à l’échantillon vers l’utilisateur pour le transfert frontal traditionnel. Si l’échantillon nécessite un transfert arrière, localisez l’échantillon loin de l’utilisateur.
- Tenez un morceau de papier buvard propre, sec et coupé entre le pouce et l’index de chaque main.
- Ne manipulez que les papiers buvards des bords et ne touchez jamais le centre, car les huiles et autres contaminants des mains / gants peuvent altérer la qualité de la grille.
- Posez les mains sur le bord du dewar plongeant pour établir une position stable. Placez le papier buvard parallèlement à la surface de la grille à environ 1 cm de la surface de la grille.
- Utilisez la section centrale du papier buvard pour permettre une mobilité complète du fluide et même une mèche sur la surface de la grille.
- Faites glisser doucement et faites pivoter le pouce et l’annulaire l’un vers l’autre pour plier le papier buvard vers la grille afin d’initier le buvard. Maintenez le contact entre le papier buvard et la surface de la grille pendant tout le processus de transfert.
- Entrez directement en contact avec le papier buvard avec la surface de la grille et maintenez un contact cohérent sur toute la surface de la grille.
- Le fait de plier doucement le papier buvard réduit la flexion de la grille et/ou endommage la surface de la grille, et entraîne une glace plus uniforme sur l’ensemble de la grille (Figure 3A).
- Observez le front de liquide mobile et une fois qu’il cesse de progresser dans le papier buvard, commencez à compter pendant 4 à 6 secondes.
REMARQUE: Le comptage peut avoir lieu une fois que le papier de transfert entre en contact avec la surface de la grille, mais une reproductibilité de grille à grille inférieure peut se produire. Le temps total de transfert dépendra du type de grille, du type de feuille, de la concentration de l’échantillon et du type d’échantillon (p. ex., protéines solubles par rapport aux protéines membranaires par rapport aux protéines filamenteuses). Pour les échantillons plus visqueux, des temps de transfert plus longs (par exemple, 5 à 7 secondes) seront nécessaires.- Important : Développer un schéma de comptage fiable et cohérent pour améliorer considérablement la reproductibilité pendant le processus de congélation.
- Déplacez le pouce gauche, le pouce droit et l’index dans des directions opposées pour retirer le papier buvard dans un « mouvement d’accrochage » loin de la surface de la grille. Appuyez immédiatement sur la pédale pour libérer le bras plongeant et plongez la grille dans de l’éthane liquide.
- Retirez simultanément le papier buvard et appuyez sur la pédale pour plonger la grille dans l’éthane dès que possible pour de meilleurs résultats de congélation. Plus le temps entre l’élimination du papier et le plongeon est long, plus l’évaporation des films minces se produira et diminuera la reproductibilité de grille à grille.
- Utilisez une main pour stabiliser la pince à épiler, déroulez soigneusement le ruban adhésif autour de la pince à épiler et du bras plongeant manuellement.
- Maintenez toujours le contact avec la pince à épiler pour empêcher le mouvement de la grille de la pince et limiter les dommages au réseau qui se produisent en frappant la grille contre l’éthane solide.
- Une fois que les pinces à épiler sont libres du bras plongeant manuel, maintenez la pince dans une main reposant sur le dessus du dewar plongeant, assurez-vous que la grille reste dans l’éthane liquide. Faites glisser soigneusement la pince en plastique loin de la grille afin que la grille puisse être transférée. Maintenez la pression sur la pince à épiler pour conserver la grille.
- D’un seul mouvement rapide, transférez rapidement la grille du récipient à éthane dans le réservoir LN2 . Placez soigneusement la grille dans la boîte de stockage de la grille.
REMARQUE: Un peu d’éthane peut se solidifier sur la surface de la grille. Ouvrir légèrement la pince à épiler cassera l’éthane et permettra de déposer la grille dans la boîte de grille.
- D’un seul mouvement rapide, transférez rapidement la grille du récipient à éthane dans le réservoir LN2 . Placez soigneusement la grille dans la boîte de stockage de la grille.
- Enveloppez la pointe de la pince à épiler dans une lingette délicate pour éviter l’accumulation de gel. Réserver jusqu’à ce que la pince à épiler soit revenue à la température ambiante.
- Ayez 4 à 6 pinces à tisser à portée de main pour faciliter l’utilisation. Chaque pince à épiler sera utilisée pour la congélation des échantillons et réchauffée avant utilisation ultérieure.
- Répétez les étapes 6.1 à 6.11 pour chaque grille.
- Une fois que la congélation a atteint son point culminant, fermez solidement la boîte de grille et transférez-la à un endroit de stockage approprié.
- Éliminer soigneusement l’éthane liquide et le LN2 et stocker tous les matériaux dans un endroit sec.
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Representative Results
L’exécution réussie du protocole de transfert et de plongeon décrit ici se traduira par une couche mince et uniforme de glace vitrée qui est exempte de toute glace hexagonale, de contaminants et de grands gradients de glace inutilisable qui peuvent être observés au microscope électronique (Figure 3). Un contact incohérent du papier buvard avec la surface de la grille, le retrait prématuré du papier buvard ou le déplacement du papier buvard pendant le contact avec la grille peuvent diminuer la qualité de la glace vitrée et entraîner une épaisseur de glace incohérente sur la grille EM (Figure 4)
Figure 1 : Salle de plongée de l’échantillon et équipement requis. A) Chambre froide mise en scène pour la congélation manuelle d’échantillons biologiques à l’aide d’un dispositif traditionnel de transfert et de plongeon décrit dans cet article. L’équipement nécessaire est indiqué et étiqueté en conséquence. B) Pour régler la hauteur de travail du piston manuel, réglez la butée en la faisant glisser de haut en bas du bras plongeant manuel et en la sécurisant en serrant la vis. C) Vue zoomée de la cuve d’éthane et de la plate-forme de stockage de la grille tournante pour indiquer la hauteur et l’emplacement appropriés de la pince à épiler et de la grille de serrage à l’intérieur de la cuve d’éthane en laiton vide. La pince à épiler et la grille ne doivent pas entrer en contact avec les côtés ou le fond de l’éthane en laiton pour éviter tout dommage. D) Hauteur et emplacement appropriés de la pince à épiler et de la grille de serrage dans l’éthane liquide. La pince à épiler et la grille doivent pénétrer dans l’éthane liquide au centre, en évitant tout contact avec l’éthane solide au périmètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Éthane liquide préparé. Vue zoomée du dewar plongeant montrant l’état de l’éthane liquide dans le récipient en laiton ethane avant la congélation de l’échantillon. L’anneau de 2-3 mm d’éthane solide dans le récipient en laiton ethane est clairement visible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images représentatives de l’apoferritine obtenues à l’aide de la technique manuelle de transfert et de plongée. (A) Atlas représentatif d’une grille cryoEM montrant l’épaisseur de la glace et la qualité des carrés de grille pouvant être obtenus à l’aide de la technique manuelle de transfert et de plongée. (B) Micrographie corrigée du mouvement de l’apoferritine de souris vitrifiée acquise à l’aide d’un microscope électronique à transmission de 200 kV équipé d’un détecteur d’électrons direct à l’installation CryoEM de l’Université de Californie à San Diego. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Atlas représentatif d’une grille cryoEM sous-optimale montrant une épaisseur de glace incohérente sur la grille, de nombreux carrés brisés et des zones dans lesquelles la glace est trop épaisse pour imager le spécimen. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La vitrification d’échantillons biologiques pour l’imagerie par microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) reste une étape cruciale pour une détermination réussie de la structure. La méthode manuelle de transfert et de plongée décrite dans ce protocole représente une méthode rentable, fiable et robuste pour congeler rapidement des échantillons biologiques dans de minces films de glace vitrée pour l’imagerie cryoEM. En utilisant les méthodes décrites dans le manuscrit, les chercheurs seront en mesure d’assembler et d’utiliser le piston manuel, de préparer du cryogène adapté à la congélation éclair d’échantillons biologiques et de éponger et de plonger manuellement des grilles EM contenant des échantillons biologiques. Bien que cette méthode soit assez robuste, des précautions doivent être prises lors des étapes critiques de cette procédure pour obtenir une épaisseur et une qualité de glace optimales pour l’imagerie à haute résolution. Nous avons décrit plusieurs de ces étapes critiques ci-dessous et fournissons des recommandations sur la façon de résoudre ces étapes.
Il est impératif de positionner correctement le bras de plongée manuel pour s’assurer que la grille se situe au centre de l’éthane liquide dans le récipient en laiton après la plongée. Une hauteur ou une position incorrecte du bras plongeant et/ou une mauvaise fixation de la pince à épiler entraîneront des dommages à la pince à épiler, à la grille EM et éventuellement au piston manuel. Comme indiqué ci-dessus, nous effectuons toujours au moins un essai avant de préparer des échantillons biologiques pour vérifier que la grille EM se localisera au centre du récipient d’éthane en laiton après une plongée réussie (Figure 1C). En outre, nous apportons également des ajustements mineurs à l’emplacement du dewar plongeant après chaque gel de la grille afin d’affiner le placement de la grille dans le récipient d’éthane (Figure 1D).
La bonne préparation du cryogène éthane est essentielle pour obtenir des couches minces d’échantillons biologiques dans la glace vitrée. Nous avons observé que la présence d’un anneau de 2-3 mm d’éthane solide autour du bord interne du récipient en laiton éthane garantit que la température de l’éthane liquide est optimale pour la vitrification de l’échantillon (Figure 2). En effet, après la congélation de chaque grille, nous surveillons la qualité de l’éthane et effectuons des ajustements mineurs - réchauffant légèrement le récipient si trop d’éthane s’est solidifié ou refroidissant l’éthane si le système s’est réchauffé - au besoin. Nous avons constaté que le bord d’une pince à température ambiante est suffisant pour liquéfier l’éthane solide tandis que couvrir le dewar avec le couvercle en mousse pendant 1 à 5 minutes est suffisant pour permettre à l’éthane de refroidir. Il est important de noter que nous effectuons ces ajustements avant de préparer la surface de la grille (c.-à-d. nettoyage au plasma) et d’appliquer l’échantillon à la grille, car cela peut introduire une autre variable dans la préparation de la grille qui n’est pas reproductible.
Enfin, nous recommandons de développer une routine standardisée de transfert et de plongeon - application d’échantillon, transfert d’échantillon et temps de transfert - pour augmenter la reproductibilité de grille à grille. La flexion du papier buvard vers la grille EM permet un contact uniforme du papier avec la grille et produit une épaisseur de glace plus constante sur l’ensemble de la grille, ce qui se traduit par une distribution uniforme des particules dans les trous de la grille (Figure 3A et Figure B, respectivement). Cette méthode de buvard contraste avec les dispositifs de buvard robotisés qui interagissent avec l’échantillon à un angle qui peut entraîner un gradient d’épaisseur de glace à travers la grille. En outre, cette flexion du papier buvard diminue également le risque d’endommager la grille EM au contact du papier buvard en tamponnant la force appliquée par l’utilisateur. Après le temps de buvard souhaité, redressez rapidement le papier buvard en effectuant un mouvement d’accrochage pour éloigner rapidement le papier buvard de la surface de la grille avant de plonger pour éviter d’endommager la grille lors de la libération du bras de plongée manuel. Nous avons trouvé cette méthode de buvard et le mouvement d’accrochage du papier buvard, lorsqu’il est chronométré avec la libération simultanée du bras plongeant manuel via la pédale, limite l’évaporation du film mince avant la vitrification et augmente la reproductibilité grille à grille.
La méthode manuelle de transfert et de plongée décrite ici est une méthode robuste et fiable qui aide à alléger une partie du fardeau financier que cryoEM peut imposer aux laboratoires émergents. Bien que cette méthode soit reproductible, la création de glace vitrée de haute qualité adaptée à cryoEM repose sur l’expérience et les compétences de chaque chercheur. Bien que les pistons robotisés et d’autres technologies émergentes automatisent plusieurs aspects du processus de congélation, ils sont généralement limités par le degré de contrôle qu’ils offrent aux chercheurs et entraînent souvent un prix élevé d’achat et d’exploitation. Grâce à la méthode décrite dans ce protocole, les chercheurs seront en mesure d’utiliser une plate-forme de préparation de grille EM abordable et polyvalente qui offre une flexibilité pour optimiser les conditions de plongée (c.-à-d. types de papier buvard, angle de buvardage, durées de transfert, directions de transfert, etc.) en fonction des types et des caractéristiques des échantillons.
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Disclosures
Nous n’avons rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire Herzik d’avoir fait preuve de réflexion critique et d’avoir fourni des commentaires sur ce manuscrit et le contenu vidéo. M.A.H.Jr. est soutenu par NIH R35 GM138206 et en tant que Searle Scholar. H.P.M.N est soutenu par la subvention de formation en biophysique moléculaire (NIH T32 GM008326). Nous tenons également à remercier Bill Anderson, Charles Bowman et le Dr Gabriel Lander du Scripps Research Institute pour leur aide dans la conception, l’assemblage et le test du piston manuel présenté dans la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22x22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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