Summary

Kemisk modifiering av tryptofanresterna i en rekombinant Ca2+-ATPase N-domän för studier av tryptofan-ANS FRET

Published: October 09, 2021
doi:

Summary

ANS binder till ca2+-ATPase rekombinant N-domän. Fluorescensspektra visar ett FRET-liknande mönster vid excitation vid en våglängd på 295 nm. NBS-medierad kemisk modifiering av Trp släcker N-domänens fluorescens, vilket leder till avsaknad av energiöverföring (FRET) mellan Trp-resterna och ANS.

Abstract

Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) är en P-typ ATPase som har kristalliserats i olika konformationer. Detaljerad funktionell information kan dock erhållas från isolerade rekombinanta domäner. Den konstruerade (Trp552Leu och Tyr587Trp) rekombinanta nukleotidbindningsdomänen (N-domän) visar fluorescenssläckande på ligandbindning. En extrinsisk fluorofor, nämligen 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), binder till nukleotidbindningsstället via elektrostatiska och hydrofobiska interaktioner med resterna Arg, His, Ala, Leu och Phe. ANS-bindning framgår av ökningen av fluorescensintensiteten när den är upphetsad vid en våglängd (λ) på 370 nm. Men när upphetsad på λ av 295 nm, ökningen av fluorescens intensitet verkar vara kopplade till släckning av N-domänen inneboende fluorescens. Fluorescensspektra visar ett Föster resonansenergiöverföringsmönster (FRET)-liknande mönster, vilket tyder på närvaron av ett Trp-ANS FRET-par, som verkar stödjas av det korta avståndet (~ 20 Å) mellan Tyr587Trp och ANS. Denna studie beskriver en analys av Trp-ANS FRET par av Trp kemisk modifiering (och fluorescenssläckande) som förmedlas av N-bromosuccinimide (NBS). I den kemiskt modifierade N-domänen ökade ANS fluorescens när upphetsad på en λ på 295 nm, liknande när upphetsad på en λ på 370 nm. Den NBS-medierade kemiska modifieringen av Trp-resterna kan därför användas för att undersöka frånvaron av fret mellan Trp och ANS. I avsaknad av Trp fluorescens bör man inte observera en ökning av ANS fluorescens. Den kemiska modifieringen av Trp-rester i proteiner från NBS kan vara användbar för att undersöka FRET mellan Trp-rester som ligger nära det bundna ans. Denna analys kommer sannolikt också att vara användbar vid användning av andra fluorforer.

Introduction

Föster resonans energiöverföring (FRET) har blivit en standardteknik för att bestämma avståndet mellan molekylära strukturer efter bindning eller interaktion i proteinstruktur ochfunktionsstudier 1,2,3,4. I ATPases av P-typ har FRET använts för att undersöka strukturen och funktionen hos sarko-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8 ,t.ex.strukturella fluktuationer under katalytisk cykel har analyserats i hela proteinet av FRET7.

FRET-givare är olika och sträcker sig från små fluorescerande (extrinsiska) molekyler till fluorescerandeproteiner 9,10. Tryptofanrester (Trp) (på grund av deras fluorescens) är användbara för att identifiera strukturella förändringar i proteinaminosyrasekvenser11,12. Trps fluorescensintensitet beror i hög grad på polariteten i dess omgivande miljö13,14. Ligandbindning genererar vanligtvis strukturella omorganiseringar i proteiner /enzymer 15,16. Om Trp förekommer på eller befinner sig nära proteinbindningsstället påverkar strukturella fluktuationer ofta graden av Trp-exponering för vattenhaltiga medier13,14. Således resulterar förändringen i polaritet i släckning av Trp fluorescensintensitet13,14. Därför är Trps fluorescerande egenskap användbar för att utföra ligand bindande studier för enzymer. Andra fysiska fenomen kan också leda till Trp fluorescenssläckande17,18,19,20, t.ex. FRET och förändringar i medelpolaritet. Energiöverföring från Trps upphetsade tillstånd till en fluorfor har också potentiella tillämpningar, t.ex. affinitetsbestämning av små ligands iproteiner 21. Faktum är att Trp främst har använts som fluorescensdonator i FRET-studier påproteiner 22,23,24,t.ex. i terbium (Tb3 +) FRET-studier, en Trp-rest används ofta som en antenn för energiöverföring till Tb3+25,26,27. Trp uppvisar olika fördelar jämfört med andra FRET-givare på grund av dess inneboende konstituerande karaktär i proteinstrukturen, vilket eliminerar behovet av förberedande processer som kan påverka funktionen/strukturen hos det studeradeproteinet 24. Således är identifieringen av radiativa sönderfall (energiöverföring och förändringar i den medelpolaritet som induceras av proteinstrukturiska omorganiseringar) viktig för att dra exakta slutsatser om ligandbindning i proteinstrukturstudier13,14,19,28.

I proteinstrukturstudier har en extrinsisk fluorfor, nämligen 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), främst använts i experiment relaterade till proteinveckning/utfällning28,29. ANS binder till proteiner/enzymer i infödda tillstånd, vanligtvis i de bindande platserna för substrat31,32,33; en ökning av ANS fluorescens kvantutbyte (ΦF) (nämligen en ökning av fluorescensintensiteten) induceras av spännande proteinet vid λ = 370 nm när lämpliga interaktioner mellan ANS med Arg och hans rester i hydrofobiska fickorförekommer 34,35,36,37. I olika studier har förekomsten av FRET (när det är spännande vid λ inom 280-295 nm) mellan Trp-rester (givare) och ANS (acceptor) rapporterats, vilket baseras på följande: 1) överlappning av fluorescensutsläppsspektrumet av Trp och excitationsspektrum av ANS, 2) identifiering av ett lämpligt avstånd mellan en eller flera Trp-rester och ANS för energiöverföring, 3) hög ANS-kvantutbyte när det är bundet i proteinfickor och 4) karakteristiskt FRET-mönster i proteinspektrat fluorescensspektra i närvaro av ANS3,17,27,37,38.

Nyligen har ligandbindning till nukleotidbindningsdomänen (N-domän) i SERCA och andra ATPas av P-typ undersökts med hjälp av konstruerade rekombinanta N-domäner40,41,42,43,44,45,46. Molekylär teknik för SERCA N-domänen har använts för att flytta de enda Trp-resterna (Trp552Leu) till en mer dynamisk struktur (Tyr587Trp) som ligger nära nukleotidbindningsstället, där fluorescensvariationer (släckning) kan användas för att övervaka strukturella förändringar vidligandbindning 34. Experimentella resultat har visat att ANS binder (som ATP) till nukleotidbindningsstället i det renade rekombinanta SERCA N-domänen34. Intressant nog ökar ANS fluorescens vid bindning till N-domänen vid excitation vid en λ på 295 nm, medan den inneboende fluorescensen hos N-domänen minskar34, vilket producerar ett FRET-mönster som föreslår bildandet av ett Trp-ANS FRET-par.

Användningen av NBS har föreslagits för att bestämma halten av Trp-rester iproteiner 47 genom absorbansanalys av modifierade proteiner. NBS modifierar den mycket absorberande indolgruppen Trp till den mindre absorberande oxindolen47,48. Detta resulterar i förlust (släckning) av Trp fluorescerande egenskap40. Därför kan NBS-medierad kemisk modifiering av Trp-rester användas som en analys för att definiera Trps (som givare) roll när FRET hypoteseras.

Detta protokoll beskriver den kemiska modifieringen av de enda Trp resterna av NBS i den konstruerade rekombinanta N-domänen för SERCA som en proteinmodell. Experimentella resultat visar att ANS fluorescensintensitet fortfarande ökar i den kemiskt NBS-modifierade N-domänen34, som saknar inneboende fluorescens. Därför är analysen användbar för att visa frånvaron av FRET mellan Trp-resterna och ANS när den är bunden till N-domänen34,40,49. Därför är denna analys (NBS kemisk modifiering av Trp) användbar för att bevisa närvaron av Trp-ANS FRET-paret i proteiner.

Protocol

1. Bestämning (i silico) av ANS- och SERCA N-domäninteraktion Generera en tredimensionell (3D) struktur av proteinet (SERCA N-domän) genom molekylär modellering med hjälp av den föredragna proteinmodelleringsprogramvaran50. Identifiera de aminosyrarester som utgör nukleotidbindningsstället med hjälp av den föredragnamolekylära strukturprogramvaran 51och bestäm förekomsten av Arg- och Lysrester35; Dessa krävs…

Representative Results

Molekylär dockning visar bindning av ANS till N-domänens nukleotidbindningsställe via elektrostatiska såväl som hydrofobiska interaktioner (figur 1). Molekylärt avstånd (20 Å) mellan Trpresterna och ANS (bundet till nukleotidbindningsstället) stöder förekomsten av FRET (figur 1). Den konstruerade (konstruerade) rekombinanta N-domänen erhölls med hög renhet genom affinitetskromatografi (figur 2) och var lämplig för fl…

Discussion

Fluorescensspektra i ANS-N-domänkomplexet visar ett FRET-liknande mönster när det är upphetsad på en λ på 295 nm, medan det molekylära avståndet (20 Å) mellan Trp-resterna och ANS verkar stödja förekomsten av FRET (Figur 1). Trp kemisk modifiering av NBS resulterar i en mindre fluorescerande N-domän(figur 3B,Spektrum f); Därför är energiöverföring inte möjlig. ANS fluorescensspektra liknar den för den icke-förmodifierade N-domänen när den …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades delvis av FAI-UASLP-bidragsnummer C19-FAI-05-89.89 och CONACYT-bidragsnummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Författarna tackar den tekniska hjälpen av Julian E. Mata-Morales i videoutgåva.

Materials

Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE

References

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
  2. Dong, X., Thomas, D. D. Time-resolved FRET reveals the structural mechanism of SERCA-PLB regulation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 449 (2), 196-201 (2014).
  3. Szilvay, G. R., Blenner, M. A., Shur, O., Cropek, D. M., Banta, S. A FRET-based method for probing the conformational behavior of an intrinsically disordered repeat domain from Bordetella pertussis adenylate cyclase. Biochemistry. 48 (47), 11273-11282 (2009).
  4. Sun, Y., Wallrabe, H., Booker, C. F., Day, R. N., Periasamy, A. Three-color spectral FRET microscopy localizes three interacting proteins in living cells. Biophysical Journal. 99 (4), 1274-1283 (2010).
  5. Cornea, R. L., et al. High-throughput FRET assay yields allosteric SERCA activators. Journal of Biomolecular Screening. 18 (1), 97-107 (2013).
  6. Gruber, S. J., et al. Discovery of enzyme modulators via high-throughput time-resolved FRET in living cells. Journal of Biomolecular Screening. 19 (2), 215-222 (2014).
  7. Dyla, M., et al. Dynamics of P-type ATPase transport revealed by single-molecule FRET. Nature. 551 (7680), 346-351 (2017).
  8. Corradi, G. R., Adamo, H. P. Intramolecular fluorescence resonance energy transfer between fused autofluorescent proteins reveals rearrangements of the N- and C-terminal segments of the plasma membrane Ca2+ pump involved in the activation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (49), 35440-35448 (2007).
  9. Piston, D. W., Kremers, G. -. J. Fluorescent protein FRET: The good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32 (9), 407-414 (2007).
  10. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  11. Chen, Y., Barkley, M. D. Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry. 37 (28), 9976-9982 (1998).
  12. Zelent, B., et al. Tryptophan fluorescence yields and lifetimes as a probe of conformational changes in human glucokinase. Journal of Fluorescence. 27 (5), 1621-1631 (2017).
  13. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. I: Descriptive quantum principles of fluorescence quenching using a supermolecule approach. Journal of Molecular Structure. 1077, 14-21 (2014).
  14. Callis, P. R. Binding phenomena and fluorescence quenching. II: Photophysics of aromatic residues and dependence of fluorescence spectra on protein conformation. Journal of Molecular Structure. 1077, 22-29 (2014).
  15. Agarwal, P. K., Geist, A., Gorin, A. Protein dynamics and enzymatic catalysis: Investigating the peptidyl-prolyl cis-trans isomerization activity of cyclophilin A. Biochemistry. 43 (33), 10605-10618 (2004).
  16. Deng, H., Zhadin, N., Callender, R. Dynamics of protein ligand binding on multiple time scales: NADH binding to lactate dehydrogenase. Biochemistry. 40 (13), 3767-3773 (2001).
  17. van de Weert, M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors. Journal of fluorescence. 20 (2), 625-629 (2010).
  18. van de Weert, M., Stella, L. Fluorescence quenching and ligand binding: A critical discussion of a popular methodology. Journal of Molecular Structure. 998 (1-3), 144-150 (2011).
  19. Stella, L., van de Weert, M., Burrows, H. D., Fausto, R. Fluorescence spectroscopy and binding: Getting it right. Journal of Molecular Structure. 1077, 1-3 (2014).
  20. Credi, A., Prodi, L. Inner filter effects and other traps in quantitative spectrofluorimetric measurements: Origins and methods of correction. Journal of Molecular Structure. 1077, 30-39 (2014).
  21. Lee, M. M., Peterson, B. R. Quantification of small molecule-protein interactions using FRET between tryptophan and the pacific blue fluorophore. ACS Omega. 1 (6), 1266-1276 (2016).
  22. Zhang, Y., et al. Comparison of FÖrster-resonance-energy-transfer acceptors for tryptophan and tyrosine residues in native proteins as donors. Journal of Fluorescence. 23 (1), 147-157 (2013).
  23. Xie, Y., Maxson, T., Tor, Y. Fluorescent ribonucleoside as a FRET acceptor for tryptophan in native proteins. Journal of the American Chemical Society. 132 (34), 11896-11897 (2010).
  24. Ghisaidoobe, A. B. T. T., Chung, S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: A focus on Förster resonance energy transfer techniques. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 22518-22538 (2014).
  25. Goryashchenko, A. S., et al. Genetically encoded FRET-sensor based on terbium chelate and red fluorescent protein for detection of caspase-3 activity. International Journal of Molecular Sciences. 16 (7), 16642-16654 (2015).
  26. Arslanbaeva, L. R., et al. Induction-resonance energy transfer between the terbium-binding peptide and the red fluorescent proteins DsRed2 and TagRFP. Biophysics. 56 (3), 381-386 (2011).
  27. Di Gennaro, A. K., Gurevich, L., Skovsen, E., Overgaard, M. T., Fojan, P. Study of the tryptophan-terbium FRET pair coupled to silver nanoprisms for biosensing applications. Physical Chemistry Chemical Physics. 15 (22), 8838-8844 (2013).
  28. Hawe, A., Poole, R., Jiskoot, W. Misconceptions over Förster resonance energy transfer between proteins and ANS/bis-ANS: Direct excitation dominates dye fluorescence. Analytical Biochemistry. 401 (1), 99-106 (2010).
  29. Ghosh, U., Das, M., Dasgupta, D. Association of fluorescent probes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate and 4,4´-dianilino-1,1´-binaphthyl-5,5´-disulfonic acid with T7 RNA polymerase. Biopolymers. 72 (4), 249-255 (2003).
  30. Vreuls, C., et al. Guanidinium chloride denaturation of the dimeric Bacillus licheniformis BlaI repressor highlights an independent domain unfolding pathway. The Biochemical Journal. 384, 179-190 (2004).
  31. Möller, M., Denicola, A. Study of protein-ligand binding by fluorescence. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (5), 309-312 (2002).
  32. Chang, L., Wen, E., Hung, J., Chang, C. Energy transfer from tryptophan residues of proteins to 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate. Journal of Protein Chemistry. 13 (7), 635-640 (1994).
  33. Togashi, D. M., Ryder, A. G. A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: Binding properties revisited by using energy transfer. Journal of Fluorescence. 18 (2), 519-526 (2008).
  34. Dela Cruz-Torres, V., Cataño, Y., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. Journal of Fluorescence. 30 (3), 483-496 (2020).
  35. Gasymov, O. K., Glasgow, B. J. ANS fluorescence: Potential to augment the identification of the external binding sites of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1774 (3), 403-411 (2007).
  36. Matulis, D., Lovrien, R. 1-anilino-8-naphthalene sulfonate anion-protein binding depends primarily on ion pair formation. Biophysical Journal. 74 (1), 422-429 (1998).
  37. Samukange, V., Yasukawa, K., Inouye, K. Interaction of 8-anilinonaphthalene 1-sulphonate (ANS) and human matrix metalloproteinase 7 (MMP-7) as examined by MMP-7 activity and ANS fluorescence. Journal of Biochemistry. 151 (5), 533-540 (2012).
  38. Qin, J., et al. Selective and sensitive homogenous assay of serum albumin with 1-anilinonaphthalene-8-sulphonate as a biosensor. Analytica Chimica Acta. 829, 60-67 (2014).
  39. Malik, A., Kundu, J., Karmakar, S., Lai, S., Chowdhury, P. K. Interaction of ANS with human serum albumin under confinement: Important insights and relevance. Journal of Luminescence. 167, 316-326 (2015).
  40. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  41. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Journal of fluorescence. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  42. Abu-Abed, M., Millet, O., MacLennan, D. H., Ikura, M. Probing nucleotide-binding effects on backbone dynamics and folding of the nucleotide-binding domain of the sarcoplasmic/endoplasmic-reticulum Ca2+-ATPase. The Biochemical Journal. 379, 235-242 (2004).
  43. Abu-Abed, M., Mal, T. K., Kainosho, M., MacLennan, D. H., Ikura, M. Characterization of the ATP-binding domain of the sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase: probing nucleotide binding by multidimensional NMR. Biochemistry. 41 (4), 1156-1164 (2002).
  44. Sazinsky, M. H., Mandal, A. K., Argüello, J. M., Rosenzweig, A. C. Structure of the ATP binding domain from the Archaeoglobus fulgidus Cu+-ATPase. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11161-11166 (2006).
  45. Liu, L., et al. Crystallization and preliminary X-ray studies of the N-domain of the Wilson disease associated protein. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 65 (6), 621-624 (2009).
  46. Banci, L., et al. The binding mode of ATP revealed by the solution structure of the N-domain of human ATP7A. Journal of Biological Chemistry. 285 (4), 2537-2544 (2010).
  47. Spande, T. F., Witkop, B. Determination of the tryptophan content of proteins with N-bromosuccinimide. Methods in Enzymology. 11, 498-506 (1967).
  48. Spande, T. F., Green, N. M., Witkop, B. The Reactivity toward N-bromosuccinimide of tryptophan in enzymes, zymogens, and inhibited enzymes. Biochemistry. 5 (6), 1926-1933 (1966).
  49. Rawat, U. B., Rao, M. B. Purification, kinetic characterization and involvement of tryptophan residue at the NADPH binding site of xylose reductase from Neurospora crassa. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Protein Structure and Molecular Enzymology. 1293 (2), 222-230 (1996).
  50. Zaki, M. J., Bystroff, C. . Protein Structure Prediction. , (2008).
  51. Wang, Z., et al. Comprehensive evaluation of ten docking programs on a diverse set of protein-ligand complexes: The prediction accuracy of sampling power and scoring power. Physical Chemistry Chemical Physics. 18 (18), 12964-12975 (2016).
  52. Pagadala, N. S., Syed, K., Tuszynski, J. Software for molecular docking: A review. Biophysical Reviews. , 91-102 (2017).
  53. Dolatkhah, Z., Javanshir, S., Sadr, A. S., Hosseini, J., Sardari, S. Synthesis, Molecular Docking, Molecular Dynamics Studies, and Biological Evaluation of 4 H -Chromone-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate Derivatives as Potential Antileukemic Agents. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (6), 1246-1257 (2017).
  54. Forli, S., et al. Computational protein-ligand docking and virtual drug screening with the AutoDock suite. Nature Protocols. 11 (5), 905-919 (2016).
  55. Lindahl, E. R. Molecular dynamics simulations. Molecular Modeling of Proteins. Methods in Molecular Biology. 443, 3-23 (2008).
  56. Turk, T., Maček, P., Gubenšek, F. The role of tryptophan in structural and functional properties of equinatoxin II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Protein Structure and Molecular. 1119 (1), 1-4 (1992).
  57. Peterman, B. F., Laidler, K. J. Study of reactivity of tryptophan residues in serum albumins and lysozyme by N-bromosuccinamide fluorescence quenching. Archives of Biochemistry and Biophysics. 199 (1), 158-164 (1980).
  58. Divita, G., Goody, R. S., Gautheron, D. C., Di Pietro, A. Structural mapping of catalytic site with respect to α-subunit and noncatalytic site in yeast mitochondrial F1-ATPase using fluorescence resonance energy transfer. Journal of Biological Chemistry. 268 (18), 13178-13186 (1993).
  59. Horrocks, W. D., Holmquist, B., Vallee, B. L. Energy transfer between terbium (III) and cobalt (II) in thermolysin: a new class of metal-metal distance probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 4764-4768 (1975).
  60. Chakraborty, J., Das, N., Halder, U. C. Unfolding diminishes fluorescence resonance energy transfer (FRET) of lysine modified β-lactoglobulin: Relevance towards anti-HIV binding. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 102 (1), 1-10 (2011).
  61. Sirangelo, I., Malmo, C., Casillo, M., Irace, G. Resolution of Tryptophan-ANS Fluorescence Energy Transfer in Apomyoglobin by Site-directed Mutagenesis. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 381-384 (2007).
  62. Ribeiro, A. J. M., Tyzack, J. D., Borkakoti, N., Holliday, G. L., Thornton, J. M. A global analysis of function and conservation of catalytic residues in enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 314-324 (2020).
  63. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Exposure of tryptophanyl residues in proteins. Quantitative determination by fluorescence quenching studies. Biochemistry. 15 (3), 672-680 (1976).
  64. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching of indole and model micelle systems. The Journal of Physical Chemistry. 80 (5), 486-493 (1976).
  65. Kinsley, N., Sayed, Y., Mosebi, S., Armstrong, R. N., Dirr, H. W. Characterization of the binding of 8-anilinonaphthalene sulfonate to rat class Mu GST M1-1. Biophysical Chemistry. 137 (2-3), 100-104 (2008).
  66. Mohsenifar, A., et al. A study of the oxidation-induced conformational and functional changes in neuroserpin. Iranian Biomedical Journal. 11 (1), 41-46 (2007).
  67. Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Application of ANS fluorescent probes to identify hydrophobic sites on the surface of DREAM. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (9), 1472-1480 (2014).
  68. Eftink, M. R., Ghiron, C. A. Fluorescence quenching studies with proteins. Analytical Biochemistry. 114 (2), 199-227 (1981).
  69. Poulos, T. L., Price, P. A. The identification of a tryptophan residue essential to the catalytic activity of bovine pancreatic deoxyribonuclease. The Journal of biological chemistry. 246 (12), 4041-4045 (1971).
  70. Hu, J. -. J., He, P. -. Y., Li, Y. -. M. Chemical modifications of tryptophan residues in peptides and proteins. Journal of Peptide Science An Official Publication of the European Peptide Society. 27 (1), 3286 (2021).

Play Video

Cite This Article
Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).

View Video