ANS binder till ca2+-ATPase rekombinant N-domän. Fluorescensspektra visar ett FRET-liknande mönster vid excitation vid en våglängd på 295 nm. NBS-medierad kemisk modifiering av Trp släcker N-domänens fluorescens, vilket leder till avsaknad av energiöverföring (FRET) mellan Trp-resterna och ANS.
Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) är en P-typ ATPase som har kristalliserats i olika konformationer. Detaljerad funktionell information kan dock erhållas från isolerade rekombinanta domäner. Den konstruerade (Trp552Leu och Tyr587Trp) rekombinanta nukleotidbindningsdomänen (N-domän) visar fluorescenssläckande på ligandbindning. En extrinsisk fluorofor, nämligen 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), binder till nukleotidbindningsstället via elektrostatiska och hydrofobiska interaktioner med resterna Arg, His, Ala, Leu och Phe. ANS-bindning framgår av ökningen av fluorescensintensiteten när den är upphetsad vid en våglängd (λ) på 370 nm. Men när upphetsad på λ av 295 nm, ökningen av fluorescens intensitet verkar vara kopplade till släckning av N-domänen inneboende fluorescens. Fluorescensspektra visar ett Föster resonansenergiöverföringsmönster (FRET)-liknande mönster, vilket tyder på närvaron av ett Trp-ANS FRET-par, som verkar stödjas av det korta avståndet (~ 20 Å) mellan Tyr587Trp och ANS. Denna studie beskriver en analys av Trp-ANS FRET par av Trp kemisk modifiering (och fluorescenssläckande) som förmedlas av N-bromosuccinimide (NBS). I den kemiskt modifierade N-domänen ökade ANS fluorescens när upphetsad på en λ på 295 nm, liknande när upphetsad på en λ på 370 nm. Den NBS-medierade kemiska modifieringen av Trp-resterna kan därför användas för att undersöka frånvaron av fret mellan Trp och ANS. I avsaknad av Trp fluorescens bör man inte observera en ökning av ANS fluorescens. Den kemiska modifieringen av Trp-rester i proteiner från NBS kan vara användbar för att undersöka FRET mellan Trp-rester som ligger nära det bundna ans. Denna analys kommer sannolikt också att vara användbar vid användning av andra fluorforer.
Föster resonans energiöverföring (FRET) har blivit en standardteknik för att bestämma avståndet mellan molekylära strukturer efter bindning eller interaktion i proteinstruktur ochfunktionsstudier 1,2,3,4. I ATPases av P-typ har FRET använts för att undersöka strukturen och funktionen hos sarko-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8 ,t.ex.strukturella fluktuationer under katalytisk cykel har analyserats i hela proteinet av FRET7.
FRET-givare är olika och sträcker sig från små fluorescerande (extrinsiska) molekyler till fluorescerandeproteiner 9,10. Tryptofanrester (Trp) (på grund av deras fluorescens) är användbara för att identifiera strukturella förändringar i proteinaminosyrasekvenser11,12. Trps fluorescensintensitet beror i hög grad på polariteten i dess omgivande miljö13,14. Ligandbindning genererar vanligtvis strukturella omorganiseringar i proteiner /enzymer 15,16. Om Trp förekommer på eller befinner sig nära proteinbindningsstället påverkar strukturella fluktuationer ofta graden av Trp-exponering för vattenhaltiga medier13,14. Således resulterar förändringen i polaritet i släckning av Trp fluorescensintensitet13,14. Därför är Trps fluorescerande egenskap användbar för att utföra ligand bindande studier för enzymer. Andra fysiska fenomen kan också leda till Trp fluorescenssläckande17,18,19,20, t.ex. FRET och förändringar i medelpolaritet. Energiöverföring från Trps upphetsade tillstånd till en fluorfor har också potentiella tillämpningar, t.ex. affinitetsbestämning av små ligands iproteiner 21. Faktum är att Trp främst har använts som fluorescensdonator i FRET-studier påproteiner 22,23,24,t.ex. i terbium (Tb3 +) FRET-studier, en Trp-rest används ofta som en antenn för energiöverföring till Tb3+25,26,27. Trp uppvisar olika fördelar jämfört med andra FRET-givare på grund av dess inneboende konstituerande karaktär i proteinstrukturen, vilket eliminerar behovet av förberedande processer som kan påverka funktionen/strukturen hos det studeradeproteinet 24. Således är identifieringen av radiativa sönderfall (energiöverföring och förändringar i den medelpolaritet som induceras av proteinstrukturiska omorganiseringar) viktig för att dra exakta slutsatser om ligandbindning i proteinstrukturstudier13,14,19,28.
I proteinstrukturstudier har en extrinsisk fluorfor, nämligen 8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), främst använts i experiment relaterade till proteinveckning/utfällning28,29. ANS binder till proteiner/enzymer i infödda tillstånd, vanligtvis i de bindande platserna för substrat31,32,33; en ökning av ANS fluorescens kvantutbyte (ΦF) (nämligen en ökning av fluorescensintensiteten) induceras av spännande proteinet vid λ = 370 nm när lämpliga interaktioner mellan ANS med Arg och hans rester i hydrofobiska fickorförekommer 34,35,36,37. I olika studier har förekomsten av FRET (när det är spännande vid λ inom 280-295 nm) mellan Trp-rester (givare) och ANS (acceptor) rapporterats, vilket baseras på följande: 1) överlappning av fluorescensutsläppsspektrumet av Trp och excitationsspektrum av ANS, 2) identifiering av ett lämpligt avstånd mellan en eller flera Trp-rester och ANS för energiöverföring, 3) hög ANS-kvantutbyte när det är bundet i proteinfickor och 4) karakteristiskt FRET-mönster i proteinspektrat fluorescensspektra i närvaro av ANS3,17,27,37,38.
Nyligen har ligandbindning till nukleotidbindningsdomänen (N-domän) i SERCA och andra ATPas av P-typ undersökts med hjälp av konstruerade rekombinanta N-domäner40,41,42,43,44,45,46. Molekylär teknik för SERCA N-domänen har använts för att flytta de enda Trp-resterna (Trp552Leu) till en mer dynamisk struktur (Tyr587Trp) som ligger nära nukleotidbindningsstället, där fluorescensvariationer (släckning) kan användas för att övervaka strukturella förändringar vidligandbindning 34. Experimentella resultat har visat att ANS binder (som ATP) till nukleotidbindningsstället i det renade rekombinanta SERCA N-domänen34. Intressant nog ökar ANS fluorescens vid bindning till N-domänen vid excitation vid en λ på 295 nm, medan den inneboende fluorescensen hos N-domänen minskar34, vilket producerar ett FRET-mönster som föreslår bildandet av ett Trp-ANS FRET-par.
Användningen av NBS har föreslagits för att bestämma halten av Trp-rester iproteiner 47 genom absorbansanalys av modifierade proteiner. NBS modifierar den mycket absorberande indolgruppen Trp till den mindre absorberande oxindolen47,48. Detta resulterar i förlust (släckning) av Trp fluorescerande egenskap40. Därför kan NBS-medierad kemisk modifiering av Trp-rester användas som en analys för att definiera Trps (som givare) roll när FRET hypoteseras.
Detta protokoll beskriver den kemiska modifieringen av de enda Trp resterna av NBS i den konstruerade rekombinanta N-domänen för SERCA som en proteinmodell. Experimentella resultat visar att ANS fluorescensintensitet fortfarande ökar i den kemiskt NBS-modifierade N-domänen34, som saknar inneboende fluorescens. Därför är analysen användbar för att visa frånvaron av FRET mellan Trp-resterna och ANS när den är bunden till N-domänen34,40,49. Därför är denna analys (NBS kemisk modifiering av Trp) användbar för att bevisa närvaron av Trp-ANS FRET-paret i proteiner.
Fluorescensspektra i ANS-N-domänkomplexet visar ett FRET-liknande mönster när det är upphetsad på en λ på 295 nm, medan det molekylära avståndet (20 Å) mellan Trp-resterna och ANS verkar stödja förekomsten av FRET (Figur 1). Trp kemisk modifiering av NBS resulterar i en mindre fluorescerande N-domän(figur 3B,Spektrum f); Därför är energiöverföring inte möjlig. ANS fluorescensspektra liknar den för den icke-förmodifierade N-domänen när den …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades delvis av FAI-UASLP-bidragsnummer C19-FAI-05-89.89 och CONACYT-bidragsnummer 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Författarna tackar den tekniska hjälpen av Julian E. Mata-Morales i videoutgåva.
Acrylamide | Bio-Rad | 1610107 | SDS-PAGE |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 1610700 | SDS-PAGE |
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid | Sigma-Aldrich | A1028 | Fluorophore |
Bis-acrylamide | Bio-Rad | 1610125 | SDS-PAGE |
N-Bromosuccinimide | Sigma-Aldrich | B81255 | Chemical modification |
N,N-dimethylformamide | J.T. Baker | 9213-12 | Stock solution preparation |
Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Chemical fluorescence label |
Fluorescence cuvette | Hellma | Z801291 | Fluorescence assay |
Fluorescence Spectrofluorometer | Shimadzu | RF 5301PC | Fluorescence assay |
HisTrap™ FF | GE Healtcare | 11-0004-59 | Protein purification |
IPTG, Dioxane free | American Bionalytical | AB00841-00010 | Protein expression |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | Protein purification |
LB media | Fisher Scientific | 10000713 | Cell culture |
Pipetman L P10L | Gilson | FA10002M | Fluorescence assay |
Pipetman L P100L | Gilson | FA10004M | Fluorescence assay |
Pipetman L P200L | Gilson | FA10005M | Fluorescence assay |
Pipetman L P1000L | Gilson | FA10006M | Fluorescence assay |
Pipetman L P5000L | Gilson | FA10007 | Fluorescence assay |
Precision plus std | Bio-Rad | 1610374 | SDS-PAGE |
Sodium dodecyl sulphate | Bio-Rad | 1610302 | SDS-PAGE |
Sodium phosphate dibasic | J.T. Baker | 3828-19 | Buffer preparation |
Sodium phosphate monobasic | J.T. Baker | 3818-01 | Buffer preparation |
Syringe filter 0.2 um | Millipore | GVWP04700 | Solution filtration |
Temed | Bio-Rad | 1610801 | SDS-PAGE |
Tris | Bio-Rad | 1610719 | SDS-PAGE |