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Biochemistry

Modification chimique du résidu de tryptophane dans un domaine N recombinant Ca2+-ATPasepour l’étude du tryptophane-ANS FRET

Published: October 9, 2021 doi: 10.3791/62770
Automatic Translation
1, 1
1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANS se lie au domaine N recombinant Ca2+-ATPase. Les spectres de fluorescence affichent un motif de type FRET lors de l’excitation à une longueur d’onde de 295 nm. La modification chimique du Trp médiée par le NBS éteint la fluorescence du domaine N, ce qui conduit à l’absence de transfert d’énergie (FRET) entre le résidu Trp et le SNA.

Abstract

Le sarco/réticulum endoplasmique Ca2+-ATPase (SERCA) est une ATPase de type P qui a été cristallisée en diverses conformations. Des informations fonctionnelles détaillées peuvent néanmoins être obtenues à partir de domaines recombinants isolés. Le domaine de liaison aux nucléotides recombinants (domaine N) (Trp552Leu et Tyr587Trp) d’ingénierie (Trp552Leu et Tyr587Trp) affiche une trempe par fluorescence lors de la liaison au ligand. Un fluorophore extrinsèque, à savoir le sulfonate de 8-anilino-1-naphtalène (SNA), se lie au site de liaison aux nucléotides par des interactions électrostatiques et hydrophobes avec les résidus d’Arg, His, Ala, Leu et Phe. La liaison ANS est mise en évidence par l’augmentation de l’intensité de fluorescence lorsqu’elle est excitée à une longueur d’onde (λ) de 370 nm. Cependant, lorsqu’il est excité à λ de 295 nm, l’augmentation de l’intensité de fluorescence semble être couplée à la trempe de la fluorescence intrinsèque du domaine N. Les spectres de fluorescence présentent un modèle de transfert d’énergie de résonance de Föster (FRET), suggérant ainsi la présence d’une paire Trp-ANS FRET, qui semble être soutenue par la courte distance (~20 Å) entre Tyr587Trp et ANS. Cette étude décrit une analyse de la paire Trp-ANS FRET par modification chimique Trp (et trempe par fluorescence) qui est médiée par le N-bromosuccinimide (NBS). Dans le domaine N chimiquement modifié, la fluorescence ANS augmentait lorsqu’elle était excitée à un λ de 295 nm, de la même manière que lorsqu’elle était excitée à un λ de 370 nm. Par conséquent, la modification chimique médiée par le NBS du résidu de Trp peut être utilisée pour sonder l’absence de FRET entre Trp et ANS. En l’absence de fluorescence Trp, il ne faut pas observer une augmentation de la fluorescence ANS. La modification chimique des résidus de Trp dans les protéines par le NBS peut être utile pour examiner le FRET entre les résidus de Trp qui sont proches du SNA lié. Ce test sera probablement également utile lors de l’utilisation d’autres fluorophores.

Introduction

Le transfert d’énergie par résonance de Föster (FRET) est devenu une technique standard pour déterminer la distance entre les structures moléculaires après liaison ou interaction dans les études de structure et de fonction des protéines1,2,3,4. Dans les ATPases de type P, FRET a été utilisé pour étudier la structure et la fonction du réticulum sarco-endoplasmique Ca2+-ATPase (SERCA)2,5,6,7,8, par exemple, les fluctuations structurelles au cours du cycle catalytique ont été analysées dans la protéine entière par FRET7.

Les donneurs fret sont divers, et vont des petites molécules fluorescentes (extrinsèques) aux protéines fluorescentes9,10. Les résidus de tryptophane (Trp) (en raison de leur fluorescence) sont utiles pour identifier les changements structurels dans les séquences d’acides aminés protéiques11,12. L’intensité de fluorescence du Trp dépend substantiellement de la polarité de son environnement13,14. La liaison aux ligands génère généralement des réarrangements structurels dans les protéines/enzymes15,16. Si le Trp est présent au site de liaison aux protéines ou situé à proximité decelui-ci,les fluctuations structurelles affectent fréquemment le degré d’exposition au Trp aux milieux aqueux13,14; ainsi, le changement de polarité entraîne la trempe de l’intensité de fluorescence Trp13,14. Par conséquent, la propriété fluorescente de Trp est utile pour effectuer des études de liaison aux ligands pour les enzymes. D’autres phénomènes physiques peuvent également conduire à la trempe par fluorescence Trp17,18,19,20, par exemple FRET et changements de polarité moyenne. Le transfert d’énergie de l’état excité de Trp à un fluorophore a également des applications potentielles, par exemple, la détermination de l’affinité de petits ligands dans les protéines21. En effet, le Trp a été principalement utilisé comme donneur de fluorescence dans les études FRET danslesprotéines22,23,24,par exemple, dans les études FRET au terbium (Tb3+),un résidu de Trp est fréquemment utilisé comme antenne pour le transfert d’énergie vers Tb3+25,26,27. Trp présente divers avantages par rapport aux autres donneurs de FRET en raison de son caractère constitutif inhérent à la structure protéique, ce qui élimine le besoin de processus préparatoires pouvant affecter la fonction / structure de la protéine étudiée24. Ainsi, l’identification des désintégrations radiatives (transfert d’énergie et changements de polarité moyenne induits par des réarrangements structurels des protéines) est importante pour tirer des conclusions précises concernant la liaison aux ligands dans les études structurales des protéines13,14,19,28.

Dans les études structurales des protéines, un fluorophore extrinsèque, à savoir le 8-anilino-1-naphtalène sulfonate (ANS), a été principalement utilisé dans des expériences liées au repliement/déploiement des protéines28,29. Le SNA se lie aux protéines/enzymes à l’état natif, généralement dans les sites de liaison des substrats31,32,33; une augmentation du rendement quantique de fluorescence ANS (ΦF) (à savoir, une augmentation de l’intensité de fluorescence) est induite par l’excitation de la protéine à λ = 370 nm lorsque des interactions appropriées de l’ANS avec Arg et ses résidus dans les poches hydrophobes se produisent34,35,36,37. Dans diverses études, l’apparition de FRET (lorsqu’elle est excitante à λ dans les 280-295 nm) entre les résidus de Trp (donneurs) et le SNA (accepteur) a été rapportée, qui est basée sur les éléments suivants: 1) chevauchement du spectre d’émission de fluorescence du Trp et du spectre d’excitation du SNA, 2) identification d’une distance appropriée entre un ou plusieurs résidus de Trp et ANS pour le transfert d’énergie, 3) rendement quantique ANS élevé lorsqu’il est lié dans des poches de protéines, et 4) motif FRET caractéristique dans les spectres de fluorescence de la protéine en présence de ANS3,17,27,37,38.

Récemment, la liaison des ligands au domaine de liaison aux nucléotides (domaine N) dans SERCA et d’autres ATPases de type P a été étudiée à l’aide des domaines N recombinants40,41,42,43,44,45,46. L’ingénierie moléculaire du domaine N SERCA a été utilisée pour déplacer le seul résidu de Trp (Trp552Leu) vers une structure plus dynamique (Tyr587Trp) proche du site de liaison aux nucléotides, où les variations de fluorescence (trempe) peuvent être utilisées pour surveiller les changements structurels lors de la liaison au ligand34. Les résultats expérimentaux ont démontré que l’ANS se lie (sous forme d’ATP) au site de liaison aux nucléotides dans le domaine N34du SERCA recombinant purifié. Fait intéressant, la fluorescence ANS augmente lors de la liaison au domaine N lors de l’excitation à un λ de 295 nm, tandis que la fluorescence intrinsèque du domaine N diminuede 34,produisant ainsi un motif FRET qui suggère la formation d’une paire Trp-ANS FRET.

L’utilisation du NBS a été proposée pour déterminer la teneur en résidus de Trp dans les protéines47 par dosage d’absorbance de protéines modifiées. NBS modifie le groupe indole hautement absorbant de Trp en oxindole moins absorbant47,48. Il en résulte la perte (trempe) de la propriété fluorescente Trp40. Par conséquent, la modification chimique des résidus de Trp médiée par le NBS peut être utilisée comme essai pour définir le rôle du Trp (en tant que donneur) lorsque FRET est hypothétisé.

Ce protocole décrit la modification chimique du seul résidu de Trp par NBS dans le domaine N recombinant de SERCA en tant que modèle protéique. Les résultats expérimentaux démontrent que l’intensité de fluorescence ANS augmente encore dans le domaine N34modifié chimiquement par le NBS, qui manque de fluorescence intrinsèque. Par conséquent, le test est utile pour démontrer l’absence de FRET entre le résidu Trp et ANS lorsqu’il est lié au domaine N34,40,49. Par conséquent, ce test (modification chimique NBS de Trp) est utile pour prouver la présence de la paire Trp-ANS FRET dans les protéines.

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Protocol

1. Détermination (in silico) de l’interaction ans et SERCA du domaine N

  1. Générer une structure tridimensionnelle (3D) de la protéine (domaine N SERCA) par modélisation moléculaire à l’aide du logiciel de modélisation protéique préféré50.
  2. Identifier les résidus d’acides aminés qui forment le site de liaison aux nucléotides à l’aide du logiciel de structure moléculaire préféré51, et déterminer la présence de résidus Arg et Lys35; ceux-ci sont nécessaires pour la liaison ANS et pour augmenter l’intensité de fluorescence (rendement quantique).
  3. Effectuer un amarrage moléculaire (à l’aide du logiciel d’amarrage préféré)52,53,54 pour déterminer les interactions de l’ATP, de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (qui forme une liaison covalente avec Lys515 en étiquetant le site de liaison aux nucléotides) et du SNA avec les résidus d’acides aminés dans le site de liaison aux nucléotides(Figure 1).
  4. Calculer la distance moléculaire (Å) entre le résidu Trp et le SNA lié à l’aide de l’outil de mesure du logiciel préféré.
  5. Effectuer une simulation de dynamique moléculaire du complexe ANS-N-domaine pour déterminer la stabilité de l’interaction52,54. Ensuite, effectuez les expériences in vitro lorsque la stabilité du complexe a été confirmée.

2. Expression et purification du domaine N recombinant

  1. Synthétiser le gène codant pour le domaine N40.
  2. Concevoir et construire le plasmide qui contient le gène synthétique qui code pour le domaine N40.
  3. Exprimer et purifier par chromatographie d’affinité (Ni-NTA), le domaine N recombinant d’ingénierie. Effectuer une SDS-PAGE de la protéine purifiée pour déterminer la pureté (Figure 2)40.
  4. Déterminer la concentration en protéines en étudiant l’absorbance à λ de 280 nm avec le coefficient d’extinction du domaine N (ε= 11 960 M-1·cm-1)40.

3. Surveiller la formation du complexe ans-N-domaine en fonction des changements d’intensité de fluorescence ANS et N-domaine.

  1. Préparer une solution sine qua non seraite la solution sNA dans duN,N-diméthylformamide.
    1. Peser une petite quantité (1-5 mg) de SNA et la dissoudre dans 1 mL du volume final de N,N-diméthylformamide, par exemple, 3,2 mg (concentration finale de 10,69 mM).
    2. Préparer une solution mère aqueuse de 100 μM de SNA à l’aide de la solution de SNA dans du N,N-diméthylformamide, par exemple, ajouter 9,4 μL de la solution de SNA de 10,69 mM à 990,6 μL de tampon phosphate de 50 mM avec un pH de 8,0 pour obtenir un volume final de 1 mL.
    3. Mélanger les solutions en vortexant 3 à 5 fois pendant 15 s.
      REMARQUE: Dans l’expérience suivante, utilisez uniquement la solution aqueuse sur stock ANS. Préparer fraîchement la solution aqueuse SNA avant d’initier les expériences.
  2. Préparer la solution stock nbS en N,N-diméthylformamide.
    1. Peser une petite quantité (1-5 mg) de NBS et le dissoudre dans 1 mL de N,N-diméthylformamide, par exemple, 5,3 mg dans 1 mL (concentration finale de 29,78 mM).
    2. Préparer une solution mère aqueuse NBS de 1 mM en utilisant la solution NBS en N,N-diméthylformamide, par exemple, ajouter 3,36 μL de la solution NBS de 29,78 mM à 96,64 μL de tampon phosphate de 50 mM avec un pH de 8,0 pour obtenir un volume final de 0,1 mL.
    3. Mélanger les solutions en vortexant 3 à 5 fois pendant 15 s.
      REMARQUE: Préparez fraîchement la solution aqueuse NBS avant de commencer les expériences.
  3. Titrer le domaine N avec ANS et enregistrer les spectres de fluorescence par excitation à λ=295 nm à 25 °C.
    1. Obtenir la ligne de base du spectre de fluorescence.
      1. Placer 1 mL de tampon phosphate de 50 mM avec un pH de 8,0 dans une cuvette de quartz à fluorescence de 1 mL.
      2. Positionnez la cellule dans la chambre thermo-déclarée (25 °C) du spectrofluoromètre et réglez l’excitation λ à 295 nm.
      3. Enregistrez le spectre de fluorescence (305 - 550 nm).
        REMARQUE: Le spectre de fluorescence du tampon phosphate de 50 mM avec un pH de 8,0, qui sert d’échantillon vierge, est soustrait de tous les spectres de fluorescence obtenus.
    2. Obtenir le spectre de fluorescence intrinsèque du domaine N.
      1. Placer 900 μL de tampon phosphate de 50 mM avec un pH de 8,0 dans une cuvette de quartz à fluorescence.
      2. Ajouter 100 μL de suspension de domaine N (10 μM) pour obtenir une concentration finale de 1 μM dans un volume final de 1 mL.
      3. Homogénéiser doucement à l’aide d’une micropipette 20 fois pour assurer l’homogénéité de la solution.
        REMARQUE: La protéine doit être fraîchement purifiée pour obtenir des spectres de fluorescence intrinsèque de haute qualité, par exemple, le domaine N recombinant purifié ne peut être utilisé que pendant une semaine après la purification.
      4. Positionnez la cellule dans la chambre thermo-déclarée (25 °C) du spectrofluoromètre et réglez l’excitation λ à 295 nm.
      5. Enregistrez le spectre de fluorescence intrinsèque du domaine N (305-550 nm).
    3. Ajouter ANS, et obtenir le spectre de fluorescence par excitation à λ=295 nm.
      1. Ajouter une aliquote de 2 μL de solution mère aqueuse ANS de 100 μM au domaine N en suspension (1 μM) pour obtenir une concentration finale de 0,2 μM ANS.
      2. Homogénéiser doucement à l’aide d’une micropipette 20 fois pour assurer l’homogénéité de la solution.
      3. Positionnez la cellule dans la chambre thermo-stable (25 °C) du spectrofluoromètre et réglez l’excitation λ à 295 nm.
      4. Enregistrez le spectre de fluorescence (305-550 nm).
      5. Répétez les additions ANS et l’enregistrement des spectres de fluorescence au-dessus de la relation molaire 1:1 ANS:N-domaine.
      6. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel approprié.
      7. Tracez tous les spectres dans un seul graphique.
      8. Déterminez si les spectres forment un motif de type FRET. Les spectres de fluorescence du domaine ANS-N forment un motif de type FRET (Figure 3A).

4. Titrage de fluorescence intrinsèque du domaine N par modification chimique Trp avec NBS.

  1. Répétez les étapes 3.3.1 et 3.3.2.
  2. Ajouter une aliquote de 1 μL de solution mère aqueuse NBS de 1 mM au domaine N en suspension (1 μM) pour obtenir une concentration finale de 1 μM NBS.
  3. Homogénéiser doucement en utilisant une micropipette 20 fois pour assurer l’homogénéité de la solution.
  4. Positionnez la cellule dans la chambre thermo-stable (25 °C) du spectrofluoromètre et réglez l’excitation λ à 295 nm.
  5. Enregistrer le spectre de fluorescence (305-550 nm)(Figure 3B).
  6. Répétez l’addition NBS et l’enregistrement des spectres de fluorescence jusqu’à ce qu’une trempe de fluorescence intrinsèque minimale dans le domaine N soit observée40. Dans le domaine N, cela se produit généralement à un rapport molaire de 5-6 NBS / N-domaine40.
    NOTE: NBS éteint rapidement (<5 s) la fluorescence intrinsèque du domaine N; une diminution de l’intensité de fluorescence est observée. Passez immédiatement à l’étape suivante, car le NBS peut également réagir avec d’autres résidus d’acides aminés47.
  7. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel approprié.
  8. Tracez tous les spectres dans un seul graphique (Figure 3B).

5. Titrer le domaine N modifié par NBS avec ANS en enregistrant des spectres de fluorescence à 25 °C.

  1. Effectuez l’étape 3.3.3 à l’aide du domaine N modifié par NBS qui a été généré à l’étape 4.
  2. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel approprié.
  3. Tracez tous les spectres dans un seul graphique (Figure 3C).
  4. Les spectres de fluorescence générés(Figure 3C)soutiennent ou réfutent l’apparition de FRET, c’est-à-dire que lorsque FRET se produit, la fluorescence ANS n’augmente pas et vice versa.

6. Preuve de liaison ANS au domaine N chimiquement modifié par excitation à λ=370 nm.

  1. Effectuez l’étape 3.3.3 en utilisant le domaine N modifié par NBS qui a été généré à l’étape 4, mais en changeant l’excitation λ à 370 nm.
  2. Soustrayez le spectre vide de chaque spectre à l’aide d’un logiciel approprié.
  3. Tracez tous les spectres dans un seul graphique (Figure 3D).
  4. Confirmer la liaison ANS au domaine N en observant l’augmentation de l’intensité de fluorescence ANS. La liaison ANS au domaine N montre une augmentation de fluorescence lorsqu’elle est excitée à λ = 370 nm(Figure 3D). Comme témoin, le spectre de fluorescence de l’ANS (seul) dans un tampon phosphate de 50 mM avec un pH de 8,0 a été obtenu excitant à λ de 295 et 370 nm(Figure 4,non montré en vidéo).
    NOTE: La relation stœchiométrique de NBS:Trp qui est nécessaire pour la modification chimique dépend du degré d’enfouissement du ou des résidus de Trp dans la protéineétudiée 46,47,55,56. Par conséquent, il est recommandé de déterminer au préalable le rapport molaire NBS:protéine/(Trp).

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Representative Results

L’amarrage moléculaire montre la liaison de l’ANS au site de liaison aux nucléotides du domaine N via des interactions électrostatiques et hydrophobes(Figure 1). La distance moléculaire (20 Å) entre le résidu Trp et le SNA (lié au site de liaison aux nucléotides) soutient l’apparition de FRET (Figure 1). Le domaine N recombinant conçu (conçu) a été obtenu à haute pureté par chromatographie d’affinité(Figure 2)et convenait aux expériences de fluorescence. Les spectres de fluorescence du complexe ans-domaine N présentaient un motif de type FRET lors de l’excitation à λ=295 nm(Figure 3A). La modification chimique du résidu Trp par nbS a conduit à la trempe de la fluorescence intrinsèque du domaine N (Figure 3B). Dans le domaine N modifié chimiquement par le NBS, les résultats expérimentaux démontrent que la fluorescence ANS augmentait lors de l’excitation à λ=295 nm (Figure 3C), similaire à celle observée dans le domaine N non modifié (Figure 3A). Par conséquent, l’excitation directe de l’ANS à λ= 295 nm fournit le plus d’énergie pour la fluorescence de l’ANS(Figure 3C),comme suggéré précédemment28. La liaison ANS au domaine N chimiquement modifié est mise en évidence par une augmentation de sa fluorescence lorsqu’elle est excitée à λ = 370 nm(Figure 3D). Par conséquent, fret ne se produit pas entre le résidu Trp et le SNA qui est lié au site de liaison aux nucléotides.

Figure 1
Figure 1: Amarrage moléculaire de l’ANS au site de liaison aux nucléotides du domaine N ca 2+-ATPase. L’amarrage moléculaire ANS a été effectué à l’aide du logiciel AutoDock Vina (http://vina.scripps.edu/) et d’un modèle 3D généré du domaine N40. Le domaine N modifié contient les mutations Trp552Leu et Tyr587Trp (en bleu). Les résidus d’acides aminés qui forment le site de liaison aux nucléotides sont représentés sous forme de boules et de bâtonnets et mis en évidence en orange. Cette figure a été modifiée avec la permission de Springer Nature: Springer, Journal of Fluorescence. Droit d’auteur (2020)34. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: SDS−PAGE du domaine N recombinant Ca 2+-ATPase. Le domaine N a été soumis à une purification d’affinité à l’aide d’une colonne chromatographique. Les fractions qui correspondaient aux pics d’absorption (à λ =280 nm) ont été soumises à SDS−PAGE et visualisées par coloration bleue de Coomassie. Le domaine N marqué par His ~30 kDa est formé de 27 kDa de N-domaine Ca2+-ATPase et de 3 kDa de poly-His tag. La pureté du domaine Ca2+-ATPase N- a été déterminée comme faisant ≥95% par densitométrie à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: La modification chimique médiée par le NBS du résidu de Trp dans le domaine N réfute la FRET entre Trp et ANS qui est liée au site de liaison aux nucléotides. A. Schéma FRET du complexe ans-N-domaine lors de l’excitation à λ=295 nm. Le SNA a été ajouté (concentration finale en μM : spectres a, 0 ; b, 0,2 ; c, 0,4 ; d, 0,6 ; e, 0,8 ; f, 1,0 ; g, 1,2 ; et h, 1,4) au domaine N en suspension (1 μM). B. Trempe par fluorescence du domaine N par NBS (concentration de NBS en μM: a, 0; b, 1; c, 2; d, 3; e, 4; et f, 6). NBS médère la modification chimique du résidu de Trp. Une fluorescence intrinsèque du domaine N a été observée lors de l’excitation à λ = 295 nm. C. Spectres de fluorescence de l’ANS qui est lié au domaine N chimiquement modifié lors de l’excitation à λ = 295 nm. Les conditions expérimentales sont comme dans A. Les figures A, B et C ont été modifiées avec la permission de Springer Nature: Springer, Journal of Fluorescence. Droit d’auteur (2020)34. D. Spectres de fluorescence de l’ANS qui est lié au domaine N chimiquement modifié lors de l’excitation à λ = 370 nm. Le domaine N a été suspendu dans 1 ml de tampon phosphate de 50 mM (pH 8,0) et des aliquotes de NBS, et le SNA a été ajouté en conséquence, comme décrit dans A (ANS) et B (NBS). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Spectres de fluorescence ANS. Le SNA (1,4 μM) dans un tampon phosphate de 50 mM avec un pH de 8,0 a été excité à λ de 295 et 370 nm; les spectres sont présentés en noir et en bleu, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les spectres de fluorescence du complexe ans-N-domaine présentent un motif de type FRET lorsqu’ils sont excités à un λ de 295 nm, tandis que la distance moléculaire (20 Å) entre le résidu Trp et ANS semble soutenir l’apparition de FRET (Figure 1). La modification chimique du Trp par le NBS donne un domaine N moins fluorescent(Figure 3B, Spectre f); par conséquent, le transfert d’énergie n’est pas possible. Les spectres de fluorescence ANS sont similaires à ceux du domaine N non modifié lorsqu’ils sont excités à un λ de 295 nm(Figure 3A et C).

Par conséquent, l’excitation directe de l’ANS à un λ de 295 nm est la principale source de fluorescence de l’ANS lorsqu’elle est liée au site de liaison de l’ATP (Figure 3C), ce qui est en accord avec le mécanisme qui a été proposé par d’autres auteurs28. Par conséquent, fret du résidu Trp au SNA lié ne se produit pas dans le complexe N-domaine-ANS. Néanmoins, la modification chimique médiée par le NBS des résidus de Trp dans d’autres protéines soutient fret entre Trp et ANS, par exemple, dans les enzymes xylose réductase de Neurospora crassa49, la sous-unité α de F1-ATPase de la mitochondrie de levure58, et thermolysine59.

Le test fonctionnerait bien dans les protéines / enzymes avec des poches hydrophobes (sites de liaison) qui contiennent des résidus His et Arg, car ceux-ci contribuent à la stabilisation de l’interaction ANS. De plus, ces protéines devraient idéalement contenir un seul résidu de Trp situé à la surface de la protéine, à savoir, accessible pour une réaction rapide avec NBS40,41,49.

Alternativement, pour analyser la paire Trp-ANS FRET dans les protéines, la modification chimique des résidus de His par acétylation et succinylation peut être utilisée pour entraver l’interaction ANS dans le site de liaison protéine/enzyme60. La suppression du résidu Trp par mutation est une autre stratégie d’analyse du FRET. Cependant, cela peut prendre beaucoup de temps et les constructions peuvent présenter des différences structurelles, affectant ainsi la liaison au ligand61. De même, la mutation des résidus d’Arg et de His au site de liaison au ligand peut générer des changements structurels imprévus, rendant ainsi la protéine mutée impropre aux expériences62.

En ce qui concerne le résidu de Trp, la performance du test de modification chimique NBS serait limitée dans les cas suivants: 1) si le résidu de Trp est enfoui profondément au cœur d’une protéine bien pliée et compacte; puisque la fraction NBS ne pourrait pas accéder au résidu Trp en raison de l’absence de grandes cavités41,48,63, 2) si les résidus Trp sont situés dans une structure membranaire (transmembranaire α-hélice), car le caractère aqueux du NBS l’empêchera d’entrer dans le milieuhydrophobe 32,56,64, 3) si la structure protéique contient plusieurs résidus Trp; car les variations d’accessibilité et d’environnement physicochimique peuvent être importantes, rendant ainsi difficile l’attribution d’un changement de signal de fluorescence à un résidu Trp32,41,56, 4) si la liaison ANS aux protéines est due principalement à une interaction hydrophobe, car l’augmentation de fluorescence ANS est due principalement aux interactions électrostatiques32,65,66,67et e) si statique la trempe du Trp se produit, par exemple, en présence d’oxygène68.

La modification chimique médiée par le NBS des résidus de Trp semble être un test rapide et facile pour étudier le FRET entre le Trp et le SNA qui est lié aux protéines / enzymes. D’autres réactifs modificateurs du Trp peuvent être utilisés à la place du NBS, par exemple, le bromure d’hydroxy-5-nitrobenzyle (HNB)69,70. Enfin, le test peut être applicable à la détection des paires FRET proposées de Trp avec d’autres flurophores21.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été partiellement financé par le numéro de subvention FAI-UASLP C19-FAI-05-89.89 et le numéro de subvention CONACYT 316463 (Apoyos a la Ciencia de Frontera: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). Les auteurs remercient l’assistance technique de Julian E. Mata-Morales en édition vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
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Biochimie numéro 176
Modification chimique du résidu de tryptophane dans un domaine N recombinant Ca<sup>2+-ATPase</sup>pour l’étude du tryptophane-ANS FRET
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Sampedro, J. G., Cataño, Y.… More

Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).

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