Summary
यह पेपर क्रायो-ईएम प्रयोगों के लिए ठंड से पहले, 70 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) प्रयोगों के लिए नमूना ग्रिड आमतौर पर जैविक नमूनों के भंडारण के लिए इष्टतम तापमान पर तैयार किए जाते हैं, ज्यादातर 4 डिग्री सेल्सियस पर और कभी-कभी कमरे के तापमान पर। हाल ही में, हमने पाया कि कम तापमान पर हल की गई प्रोटीन संरचना कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक नहीं हो सकती है, खासकर थर्मोफिलिक आर्किया से प्रोटीन के लिए। क्रायो-ईएम विश्लेषण के लिए उच्च तापमान (70 डिग्री सेल्सियस तक) पर प्रोटीन के नमूने तैयार करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की गई थी। हमने दिखाया कि उच्च तापमान पर तैयार किए गए नमूनों से संरचनाएं कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक और तापमान पर निर्भर हैं। यहां हम एक उदाहरण के रूप में 55 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करके उच्च तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रयोग ने एक अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करके संशोधित एक विट्रीफिकेशन उपकरण का उपयोग किया, और नमूने 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किए गए। वाष्प संघनन को कम करने और ग्रिड पर बर्फ की एक पतली परत प्राप्त करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को ठीक किया गया था। सफल और असफल प्रयोगों के उदाहरण प्रदान किए गए हैं।
Introduction
प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को हल करने के लिए क्रायो-ईएम तकनीक में सुधार जारी है, विशेष रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं को प्राप्त करने की दिशा में 1,2। इस बीच, इसके आवेदन के परिदृश्य को विटिफिकेशन प्रक्रिया3 से पहले पीएच या लिगेंड जैसी नमूना स्थितियों को बदलकर विस्तारित किया गया है, जिसमें नमूना ग्रिड की तैयारी शामिल है, जिसके बाद फ्रीजिंग 4,5 है। एक और महत्वपूर्ण स्थिति तापमान है। यद्यपि क्रायो-ईएम प्रयोग, जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, कम तापमान पर किए जाते हैं, क्रायो-ईएम द्वारा हल की गई संरचना विट्रीफिकेशन से पहले समाधान अवस्था में संरचना को दर्शाती है। हाल ही में, अधिकांश एकल कण विश्लेषण (एसपीए) क्रायो-ईएम अध्ययन उन नमूनों का उपयोग करते हैं जो विट्रीफिकेशन6 से पहले बर्फ (यानी, 4 डिग्री सेल्सियस पर) पर रखे जाते हैं, हालांकि कई अध्ययन कमरे के तापमान 7,8,9,10 या 42 डिग्री सेल्सियस 11 के आसपास नमूनों का उपयोग करते हैं। हाल की एक रिपोर्ट में, हमने थर्मोफिलिक आर्कियन सल्फोलोबस सोलफैटारिकस (एसएसओ) से एंजाइम केटोल-एसिड रिडक्टोइसोमेरेज़ (केआरआई) के तापमान-निर्भर अध्ययन 4 डिग्री सेल्सियस से 70 डिग्री सेल्सियस12 तक छह अलग-अलग तापमानों पर किए। हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करना महत्वपूर्ण है और क्रायो-ईएम एकमात्र संरचनात्मक विधि है जो कई तापमानों पर एक ही प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की संरचना को हल करने के लिए व्यावहारिक रूप से संभव है।
उच्च तापमान पर विट्रीफिकेशन के लिए प्रमुख कठिनाई वाष्प संघनन को कम करना और पतली बर्फ प्राप्त करना है। यहां हम एसएसओ-केआरआई 12 के हमारे पिछले अध्ययन में उच्च तापमान पर नमूना ग्रिड तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। हम मानते हैं कि पाठक या दर्शक पहले से ही क्रायो-ईएम प्रयोगों के लिए समग्र नमूना तैयारी और डेटा प्रोसेसिंग प्रक्रियाओं में अनुभवी हैं और उच्च तापमान से संबंधित पहलुओं पर जोर देते हैं।
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य विशिष्ट तापमान पर क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) नमूने तैयार करने के लिए एक संशोधित वाणिज्यिक विट्रीफिकेशन उपकरण का उपयोग करना है, विशेष रूप से 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक। समग्र प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 1 में दिखाया गया है। प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में 55 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करता है। अन्य तापमानों पर विशिष्ट स्थितियों के लिए, कृपया संदर्भ12 में अनुपूरक तालिका 2 देखें।
1. विटिफिकेशन उपकरण की तैयारी
- इसके बंद छोर पर 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 सेमी का छेद करें।
- अल्ट्रासोनिक पानी के आउटलेट पर विट्रीफिकेशन तंत्र कक्ष में ट्यूब रखें, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
नोट: इसका उद्देश्य पूरे कक्ष तक पहुंचने से पहले ट्यूब के माध्यम से जल वाष्प को हीट एक्सचेंजर में मार्गदर्शन करके पानी के संघनन को कम करना है। - विट्रीफिकेशन उपकरण के तापमान को निर्दिष्ट तापमान (उदाहरण के लिए, 55 डिग्री सेल्सियस, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है) पर सेट करें, और विटिफिकेशन तंत्र कक्ष को 55 डिग्री सेल्सियस और 100% सापेक्ष आर्द्रता तक पहुंचने की अनुमति दें। प्रयोग शुरू करने से पहले स्थितियों को स्थिर करने के लिए इसे कम से कम आधे घंटे तक खड़े रहने दें।
2. नमूना और उपकरणों को गर्म करना
- एक हॉटप्लेट पर पानी के स्नान को रखें और हॉटप्लेट को वांछित तापमान (यहां 55 डिग्री सेल्सियस) पर सेट करें। यह सुनिश्चित करने के लिए थर्मामीटर से जांचें कि पानी 55 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है।
- पानी के स्नान में नमूने को इनक्यूबेट करें और ब्लोटिंग प्रयोग से पहले हॉटप्लेट के किनारे पर पिपेट टिप को 2 मिनट या उससे अधिक समय के लिए प्रीहीट करें।
नोट: विट्रीफिकेशन उपकरण कक्ष के लिए उच्चतम तापमान सेटिंग 60 डिग्री सेल्सियस है। साइरो-ईएम प्रयोग (जैसे, 70 डिग्री सेल्सियस) के लिए उच्च तापमान ग्रिड तैयार करने के लिए, नमूना को 80 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेट किया जाता है, और नमूना तापमान और विटिफिकेशन उपकरण तापमान के बीच का औसत ग्रिड पर नमूने का वास्तविक तापमान होने का अनुमान है (इस मामले में 70 डिग्री सेल्सियस)। इस अनुमान पर अधिक जानकारी और सीमाओं के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
3. सोख्ता प्रयोग के लिए तैयारी
- ग्लो डिस्चार्ज 30 सेकंड के लिए 25 एमए पर एक छिद्रित कार्बन-समर्थित ग्रिड, या उपयोग किए गए डिवाइस के आधार पर मूल्यों का विकल्प।
- 2 मिनट या उससे अधिक समय के लिए विट्रीफिकेशन उपकरण में ग्रिड के साथ चिमटी को इनक्यूबेट करें।
- मानक प्रक्रियाओं के अनुसार ईथेन कंटेनर को ईथेन के साथ भरें। ईथेन को ओवरफ्लो न होने दें।
नोट: इस चरण में लगभग 10 मिनट लगते हैं और ठंड से बचने के लिए ब्लोटिंग प्रयोग के साथ तुरंत पालन किया जाना चाहिए। - सोख्ता प्रयोग से 5 मिनट पहले विटिफिकेशन फिल्टर पेपर को विटिफिकेशन तंत्र कक्ष में रखें।
नोट: फ़िल्टर पेपर को बहुत जल्द कक्ष में रखने से यह बहुत गीला हो जाएगा।
4. ब्लोटिंग प्रयोग
नोट: ग्रिड को पकड़ते समय, सुनिश्चित करें कि ग्रिड स्थिर है और चिमटी के साथ न्यूनतम संपर्क क्षेत्र है (चित्रा 4)। यह ईथेन की सर्वोत्तम शीतलन दक्षता बनाए रखने और गैर-विट्रियस बर्फ से बचने के लिए किया जाता है।
- ग्रिड पर नमूने के 7-9 μL लागू करने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें। फिर 1-2 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें, 1-1.5 सेकंड के लिए धब्बा, और जल्दी से नमूने को तरल ईथेन में डुबो दें।
- ग्रिड को तरल ईथेन से क्रायो बॉक्स में स्थानांतरित करें, जो तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत होता है।
नोट: इस चरण को बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए क्योंकि चिमटी अभी भी गर्म है, इसलिए इस समय पूरा शीतलन टैंक वाष्प से भरा है।
5. ग्रिड के लिए गुणवत्ता की जांच
- ग्रिड को क्लिप करें और उन्हें क्रायो-ईएम उपकरण पर अपलोड करें।
- ग्रिड पर बर्फ की स्थिति और ग्रिड पर नमूने के वितरण को स्क्रीन करने के लिए क्रायो-ईएम उपकरण की डिस्प्ले स्क्रीन और सॉफ्टवेयर के कम खुराक फ़ंक्शन का उपयोग करें।
नोट: अक्सर, ग्रिड बहुत शुष्क होते हैं, या बर्फ की परत बहुत मोटी होती है। उच्च तापमान पर तैयार ग्रिड की सफलता दर कमरे के तापमान या 4 डिग्री सेल्सियस की तुलना में काफी कम है। अच्छे ग्रिड और गैर-संतोषजनक ग्रिड के प्रतिनिधि परिणाम अगले खंड में दिखाए गए हैं। - यदि परिणामी ग्रिड की गुणवत्ता अच्छी नहीं है, तो विभिन्न स्थितियों (जैसे प्रतीक्षा समय, सोख्ता समय, आदि) के साथ ग्रिड तैयारी की प्रक्रिया को दोहराएं। यदि परिणामी ग्रिड की गुणवत्ता अच्छी है, तो एक अलग तापमान पर ग्रिड बनाने के लिए समान चरणों को दोहराएं।
6. डेटा संग्रह
- अच्छी गुणवत्ता वाले ग्रिड को उच्च रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम उपकरण में स्थानांतरित करें।
- स्थापित प्रक्रियाओं के अनुसार डेटा संग्रह और डेटा विश्लेषण करें।
नोट: जैसा कि हमारे पिछले प्रकाशन में दिखाया गया है, संरचना का संकल्प उच्च तापमान12 से प्रभावित नहीं होता है।
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Representative Results
कम आवर्धन अवलोकन चित्रा 5 ए, बी में दिखाया गया है। पैनल ए एक सफल ग्रिड का एक उदाहरण है। ऊपर बाईं ओर (मोटी) से नीचे दाईं ओर (पतला या खाली) एक बर्फ ढाल है। इस तरह के ग्रिड से डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त मध्य क्षेत्र में बर्फ की परत की उपयुक्त मोटाई ढूंढना आसान हो जाता है, जैसे कि नीले और हरे रंग के बक्से। ग्रिड बी बहुत सूखा है। ग्रिड में वर्गों में उज्ज्वल कंट्रास्ट होता है, जिसका अर्थ है कि बर्फ की परत बहुत पतली है या बर्फ की कोई परत नहीं है। लाल तीर द्वारा इंगित केवल दो वर्ग डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त हैं।
इसके अलावा, विभिन्न ग्रिडों से कम खुराक छवियों के उदाहरण चित्रा 5 सी, डी में दिखाए गए हैं। पैनल सी में छवि से पता चलता है कि अधिकांश बर्फ क्रिस्टलीय रूप में है, डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त नहीं है। दूसरी ओर, पैनल डी में छवि से पता चलता है कि बर्फ की परत ज्यादातर एक अनाकार स्थिति में है, जो डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त है।
कृपया ध्यान दें कि यह उच्च तापमान पर ग्रिड तैयारी पर ध्यान केंद्रित करने वाला एक छोटा पेपर है। ग्रिड में केवल डेटा संग्रह के लिए नमूना होता है। एक अच्छे ग्रिड के पास एक अच्छा मौका है, हालांकि एक निश्चित मौका नहीं है, एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना को हल करने के लिए अच्छा डेटा उत्पन्न करने के लिए। इस पेपर में वर्णित उदाहरणों के लिए वास्तविक क्रायो-ईएम डेटा और अंतिम संरचनाएं पहले से ही प्रकाशित पेपर12 में वर्णित हैं। संक्षेप में, हमने डेटा संग्रह के लिए पर्याप्त ग्रिड प्राप्त किए हैं, प्रत्येक छह अलग-अलग तापमान पर दो एसएसओ-केआरआई परिसरों की संरचनाओं को हल किया है, और प्रत्येक परिसर के लिए अलग-अलग तापमान से संरचनाओं की तुलना की है, साथ ही साथ एक ही तापमान से दो परिसरों के बीच संरचनाएं भी हैं। परिणाम बताते हैं कि प्रत्येक परिसर की संरचना तापमान-निर्भर है और तापमान-निर्भर परिवर्तन दो परिसरों के बीच भिन्न हैं। महत्वपूर्ण रूप से, क्रमिक संरचनात्मक परिवर्तन लगातार तापमान परिवर्तनों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं, जो तापमान-निर्भर नमूना ग्रिड तैयारी की सफलता के लिए एक मजबूत संकेत है।
चित्रा 1: उच्च तापमान क्रायो-ईएम नमूना तैयारी के लिए समग्र प्रयोगात्मक सेटअप। दिखाए गए आइटम में विट्रीफिकेशन उपकरण, इनक्यूबेटर, टाइमर, पिपेट टिप प्लेसमेंट, कूलिंग टैंक और चिमटी शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: विटिफिकेशन तंत्र कक्ष का संशोधन। लाल तीर12 द्वारा इंगित अल्ट्रासोनिक स्प्रे आउटलेट पर एक 50 एमएल ट्यूब स्थापित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रयोग के दौरान विट्रीफिकेशन तंत्र की उपस्थिति। स्क्रीन तापमान को 55 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता को 100% पर दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: ग्रिड को पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करना। यह अनुशंसा की जाती है कि चिमटी ग्रिड को यथासंभव कम संपर्क के साथ पकड़ते हैं, लेकिन यह ऑपरेशन की प्रक्रिया के दौरान ग्रिड को स्थिर रूप से पकड़ने में सक्षम होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: प्रतिनिधि परिणाम: क्रायो-ईएम द्वारा ग्रिड जांच। (ए, बी) ग्रिड की समग्र स्थिति दिखाते हैं। (सी, डी) विभिन्न ग्रिड से कम खुराक छवियों के उदाहरण दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटोकॉल के चरण 1 में, सुनिश्चित करें कि सेंट्रीफ्यूज ट्यूब अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और प्रयोग प्रगति पर होने पर नहीं गिरता है। कक्ष में बड़ी संख्या में पानी की बूंदों के संचय के कारण, जो फिल्टर पेपर की सोखना क्षमता को बदल सकता है, यह अनुशंसा की जाती है कि विट्रीफिकेशन तंत्र कक्ष के संतुलन तापमान तक पहुंचने के बाद प्रयोग का समग्र समय 30 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। यदि ऑपरेशन का समय 30 मिनट से अधिक है, तो ऑपरेटर को फिल्टर पेपर को बदलने और तापमान और आर्द्रता को फिर से संतुलित करने के लिए केबिन की प्रतीक्षा करने की आवश्यकता है। प्रोटोकॉल के चरण 8 में, 7-9 μL की सुझाई गई नमूना मात्रा सामान्य से बड़ी है क्योंकि अन्यथा, नमूना उच्च तापमान पर जल्दी से वाष्पित हो जाता है, जिससे ग्रिड पर खाली वर्ग हो जाते हैं। दूसरी ओर, यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि लागू किया गया नमूना 9 μL से अधिक नहीं है। अन्यथा, यह बहुत संभावना है कि सोख्ता से पहले चिमटी को स्थानांतरित करने की प्रक्रिया के दौरान नमूना नीचे टपकेगा। कुल मिलाकर, इस तकनीक की सफलता की कुंजी ग्रिड की स्थिर और तेजी से पकड़ और प्रत्येक समय-सीमित कार्रवाई का सही और स्थिर निष्पादन है। इसके अलावा, यह अनुशंसा की जाती है कि प्रयोगों का प्रत्येक दौर केवल एक विशिष्ट उच्च तापमान से संबंधित है। किसी अन्य तापमान पर प्रयोग करने के लिए आगे बढ़ने से पहले, सभी प्रणालियों को पूरी तरह से पुनर्प्राप्त और रीसेट किया जाना चाहिए।
कक्ष के उच्च तापमान और उच्च आर्द्रता के कारण, खिड़की अक्सर कोहरे से ढकी होती है जिससे प्रयोग शुरू करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। खिड़की को साफ करने के लिए थोड़े साबुन के उपयोग की सिफारिश की जाती है। यदि ग्रिड अच्छे नहीं हैं, तो संभावित कारण यह हैं कि ऊपर वर्णित चरणों का ठीक से पालन नहीं किया जाता है और / या यह कि कदम बहुत लंबा लगते हैं। सटीकता और तेजी के साथ नमूना ग्रिड की तैयारी को दोहराने की कोशिश करें। यदि दोहराव के बाद भी ग्रिड अच्छे नहीं हैं, तो शर्तों को समायोजित करने का प्रयास करें। इस प्रयोग में देखी गई अधिक लगातार समस्या उच्च तापमान पर ग्रिड पर कोई बर्फ नहीं है। यदि हां, तो सोख्ता समय को और कम करने का प्रयास करें। दूसरी ओर, यदि बर्फ बहुत मोटी है, तो सोखने के समय को बढ़ाने की कोशिश करें।
उच्च तापमान क्रायो-ईएम की एक सीमा यह है कि विटिफिकेशन तंत्र पर अधिकतम हीटिंग तापमान 60 डिग्री सेल्सियस है। उच्च तापमान तक पहुंचने के लिए, नमूने को 60 डिग्री सेल्सियस (जैसे, 80 डिग्री सेल्सियस) से ऊपर गर्म किया गया था, और नमूना तापमान और विटिफिकेशन तापमान के बीच का औसत ग्रिड पर नमूने का वास्तविक तापमान होने का अनुमान लगाया गया था (70 डिग्री सेल्सियस, इस मामले में)। इस अनुमान के आधार पर कुछ अशुद्धि हो सकती है। भविष्य का एक संभावित समाधान यह है कि ग्रिड तापमान को सही ढंग से मापने के लिए एक थर्मोकपल का निर्माण किया जाए। एक और संभावित सीमा उच्च तापमान पर प्रोटीन की स्थिरता है। परिपत्र डाइक्रोइजम का उपयोग करके एक अलग प्रयोग किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नियोजित क्रायो-ईएम प्रयोग के लिए प्रोटीन तापमान पर स्थिर है।
एक और सीमा यह है कि केवल दो प्रकार के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विट्रीफिकेशन उपकरण को 37 डिग्री सेल्सियस से ऊपर और 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता है जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है (उदाहरण के लिए, थर्मो फिशर विट्रोबोट और लीका ईएम-जीपी)। अन्य विक्रेताओं के विट्रीफिकेशन उपकरण या तो कमरे के तापमान तक सीमित हैं या केवल 4 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस के बीच समायोज्य हैं। हालांकि, अनुसंधान समूहों के लिए भविष्य में विस्तारित तापमान सीमाओं के साथ अपने स्वयं के प्लंगिंग डिवाइस का निर्माण करना संभव है।
हमारे प्रोटोकॉल को मौजूदा प्रोटोकॉल 4,5,6 से संशोधित किया गया है, जिसका उद्देश्य कमरे के तापमान से अधिक तापमान पर ग्रिड तैयार करना है। यहां वर्णित संशोधनों को बनाने के बिना, क्रायो-ईएम छवि संग्रह के लिए उपयुक्त अच्छे उच्च तापमान नमूना ग्रिड बनाने के लिए सफलता की संभावना बहुत कम है।
2019 में दो पत्रों से पता चला है कि प्रोटीन संरचनाएं तापमान पर निर्भर हैं, प्रोटीन कार्यों की तापमान निर्भरता के साथ सहसंबंध में, टीआरपी चैनल टीआरपीवी 311 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से 42 डिग्री सेल्सियस और एसएसओ-केआरआई 12 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से 70 डिग्री सेल्सियस की सीमा में। इन रिपोर्टों से क्रायो-ईएम अनुसंधान में बदलाव को प्रोत्साहित करने की संभावना है जिसमें भविष्य के अधिक अध्ययन कार्यात्मक रूप से प्रासंगिक तापमान पर किए जाएंगे, आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर। इस तापमान पर शुद्ध प्रोटीन की स्थिरता एक चिंता का विषय हो सकती है। हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल के अनुसार केवल 2 मिनट के लिए इस तापमान पर प्रोटीन के नमूने को इनक्यूबेट करना आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, टोमोग्राफी और उप-टोमो औसत का उपयोग करके कोशिकाओं में इमेजिंग प्रोटीन द्वारा शारीरिक स्थितियों को प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, क्रायो-ईएम का उपयोग उच्च तापमान पर सामने आने वाले प्रोटीन के तंत्र और मध्यवर्ती का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, संभवतः 40 डिग्री सेल्सियस से 80 डिग्री सेल्सियस की सीमा में। ये अध्ययन सभी यहां वर्णित प्रोटोकॉल से लाभान्वित होंगे।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
लेखक उपयोगी सलाह के लिए थर्मो फिशर साइंटिफिक के डॉ हर्वे रेमिगी को धन्यवाद देते हैं। क्रायो-ईएम प्रयोगएकडेमिया सिनिका क्रायो-ईएम सुविधा (एएससीईएम) में किए गए थे। ASCEM एकेडेमिया सिनिका (ग्रांट नंबर 1) द्वारा समर्थित है। एएस-सीएफआईआई-108-110) और ताइवान प्रोटीन प्रोजेक्ट (अनुदान सं। एएस-केपीक्यू-109-टीपीपी 2)। लेखकों ने नमूना तैयारी के साथ सहायता के लिए सुश्री हुई-जू हुआंग को भी धन्यवाद दिया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon tube | Falcon | 352070 | size: 50 mL |
| Filter paper | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | water bath | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu grid | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | low dose imaging |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
References
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