Summary
यहां, हम प्लेटलेट लिसेट (पीएल) से व्युत्पन्न एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) के अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं और टाइटेनियम (टीआई) प्रत्यारोपण सतहों को कोटिंग करने के लिए उनके उपयोग करते हैं। हम ड्रॉप कास्टिंग कोटिंग विधि का वर्णन करते हैं, सतहों से ईवी एस रिलीज प्रोफ़ाइल, और ईवी लेपित टीआई सतहों के इन विट्रो बायोकॉम्पैटिबिलिटी।
Abstract
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) जैविक नैनोवेसिकल्स हैं जो सेल संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनकी सामग्री में प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड जैसे सक्रिय बायोमोलेक्यूल्स शामिल हैं, जो पुनर्योजी चिकित्सा में बड़ी क्षमता प्रस्तुत करते हैं। हाल ही में, प्लेटलेट लिसेट (पीएल) से व्युत्पन्न ईवी ने पीएल के तुलनीय एक ओस्टियोजेनिक क्षमता दिखाई है। इसके अलावा, बायोमैटेरियल्स का उपयोग अक्सर ऑर्थोपेडिक्स या दंत बहाली में किया जाता है। यहां, हम उनके ऑस्टियोजेनिक गुणों में सुधार करने के लिए पीएल-व्युत्पन्न ईवी के साथ टीआई सतहों को कार्यात्मक बनाने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।
ईवी को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीएल से अलग किया जाता है, और बाद में टीआई सतहों को ड्रॉप कास्टिंग द्वारा पीएल-ईवी के साथ कार्यात्मक किया जाता है। Functionalization ईवीएस रिलीज और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) रिलीज परख द्वारा इसकी biocompatibility द्वारा साबित होता है.
Introduction
ईवी किसी भी सेल द्वारा स्रावित झिल्ली पुटिकाएं (30-200 एनएम) हैं और अपने कार्गो को वितरित करके सेल-टू-सेल संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनमें विभिन्न प्रकार के सक्रिय बायोमोलेक्यूल्स होते हैं जिनमें न्यूक्लिक एसिड, विकास कारक, या बायोएक्टिव लिपिड शामिल हो सकते हैं1। इन कारणों से, ईवी का मूल्यांकन चिकित्सीय में उनके संभावित उपयोग के लिए किया गया है। ऑर्थोपेडिक्स और हड्डी के उत्थान के संदर्भ में, विभिन्न स्रोतों से ईवी का परीक्षण किया गया है। उनमें से, प्लेटलेट-व्युत्पन्न ईवी को कम साइटोटॉक्सिक प्रोफाइल 2,3 को बनाए रखते हुए स्टेम कोशिकाओं पर एक भेदभाव प्रभाव को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, दैनिक नैदानिक अभ्यास में उनका उपयोग करने के लिए बायोमैटेरियल्स के साथ ईवी के संयोजन की संभावना का पता लगाने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है।
टाइटेनियम आधारित biomaterials व्यापक रूप से उनके यांत्रिक गुणों, उच्च biocompatibility, और दीर्घकालिक स्थायित्व के कारण हड्डी चिकित्सा नैदानिक हस्तक्षेप के लिए scaffolds के रूप में उपयोग किया जाता है4. फिर भी, टीआई प्रत्यारोपण एक बायोइनर्ट सामग्री हैं और इसलिए, आसपास की हड्डी के ऊतकों के साथ बंधन के लिए एक खराब क्षमता पेश करते हैं5। इस कारण से, टाइटेनियम संशोधनों का अध्ययन किया जा रहा है ताकि इसकी सतह 4,6,7 पर अधिक कार्यात्मक माइक्रोएन्वायरमेंट प्राप्त करके उनके प्रदर्शन में सुधार किया जा सके। इस अर्थ में, ईवी को रासायनिक 8 या भौतिक इंटरैक्शन 9,10 द्वारा टाइटेनियम में लंगर डाला जा सकता है। स्टेम कोशिकाओं या मैक्रोफेज से व्युत्पन्न स्थिर ईवी सेलुलर आसंजन और प्रसार को बढ़ावा देकर टीआई की जैव सक्रियता को बढ़ाते हैं जिससे एक ओस्टियोजेनिक प्रभाव 8,9,10 उत्प्रेरण होता है।
यह लेख विस्तार से पीएल-व्युत्पन्न ईवी के साथ टीआई सतहों को कोटिंग करने के लिए एक ड्रॉप कास्टिंग रणनीति पर ध्यान केंद्रित करेगा। इसके अलावा, हम समय के साथ लेपित सतह से ईवी रिलीज प्रोफाइल का मूल्यांकन करेंगे और विट्रो में इसकी सेलुलर बायोकॉम्पैटिबिलिटी की पुष्टि करेंगे।
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Protocol
प्लेटलेट Lysate (PL) के रूप में पहले संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में वर्णित के रूप में प्राप्त किया जाता है3 शुरू सामग्री के रूप में IdISBA Biobank द्वारा प्रदान किए गए ताजा buffy कोट का उपयोग कर. वर्तमान परियोजना के लिए उनके उपयोग को इसकी नैतिकता समिति (आईबी 1995/12 बायो) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. पीएल से ईवी अलगाव
- बड़े निकायों को हटाने
- कमरे के तापमान पर PL को पिघलाएं।
- सेंट्रीफ्यूज पीएल 1,500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए। गोली को छोड़ दें क्योंकि इसमें सेल मलबे होते हैं।
- supernatant ले लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 x g पर दो लगातार centrifugations प्रदर्शन।
नोट:: गोली ऐसे microvesicles के रूप में बड़े EVs करने के लिए संगत है, और इस मामले में, यह छोड़ दिया जाता है। - 0.8 μm झरझरा झिल्ली के माध्यम से पहले supernatant फ़िल्टर, और फिर 0.2 μm झरझरा झिल्ली के माध्यम से।
नोट:: ये चरण सभी गैर-वांछित EVs निकालें। - फ़िल्टर किए गए PL को पूल करें और उपयोग करने तक -20 °C पर स्टोर करें।
- आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी
- फ़िल्टर किए गए पीबीएस के साथ वांछित प्रवाह दर पर क्रोमैटोग्राफी उपकरणके लिए युग्मित कॉलम को संतुलित करें।
नोट:: उपयोग की गई प्रवाह दर स्तंभ विशेषताओं पर निर्भर करती है; इस मामले में, यह 0.5 mL / मिनट के लिए सेट किया गया है। - उपकरण के लिए एक सिरिंज के साथ संसाधित PL (5 mL) लोड करें।
- स्तंभ में PL इंजेक्ट करें और 15 mL ट्यूबों में 5 mL अंशों को इकट्ठा करना शुरू करें।
- EVs समृद्ध अंशों को इकट्ठा करें और उपयोग करने तक उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: पहली बार प्रयोग करते समय, EVs3,11 के साथ समृद्ध एक को निर्धारित करने के लिए प्रोटीन परिमाणीकरण और immunodetection द्वारा सभी अंशों की विशेषता है। इस प्रयोग में, 9 वें अंश को एकत्र किया जाता है। - क्रोमैटोग्राफिक कॉलम को 0.2% NaOH समाधान के 30 मिलीलीटर के साथ धोएं और संतुलन तक पहुंचने के बाद इसे 20% इथेनॉल समाधान में संग्रहीत करें।
- फ़िल्टर किए गए पीबीएस के साथ वांछित प्रवाह दर पर क्रोमैटोग्राफी उपकरणके लिए युग्मित कॉलम को संतुलित करें।
चित्रा 1: प्लेटलेट लिसेट (पीएल) एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल (ईवी) अलगाव का योजनाबद्ध आरेख। पीएल को पहले 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, और फिर बड़े निकायों को हटाने के लिए 10,000 x g पर। supernatant 0.8 और 0.2 μm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। संसाधित पीएल कॉलम पर लोड किया जाता है, और ईवी आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
2. ईवी एस लक्षण वर्णन
नोट: कार्यात्मक अध्ययन करने के लिए ईवी एस लक्षण वर्णन आवश्यक है12. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या पश्चिमी धब्बा लक्षण वर्णन पहले रिपोर्ट किया गया है13. यह रिपोर्ट Ti सतह functionalization के लिए आवश्यक लक्षण वर्णन तकनीकों पर ध्यान केंद्रित करेगा।
- Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA)
- 0.2 μm फ़िल्टर्ड पीबीएस में EVs (1:1000) पतला.
नोट: बहुत केंद्रित नमूने या बहुत पतला नमूने NTA निर्धारण के लिए सीमा से बाहर हो जाएगा, और समायोजन की आवश्यकता होगी। - एनटीए उपकरण के लिए एक सिरिंज के साथ पतला ईवी के 1 मिलीलीटर लोड करें और उन्हें एनटीए उपकरण में इंजेक्ट करें।
- कण एकाग्रता और आकार वितरण निर्धारण के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें।
- 0.2 μm फ़िल्टर्ड पीबीएस में EVs (1:1000) पतला.
- प्रोटीन एकाग्रता
- EVs समाधान के 1 μL का उपयोग करके एकाग्रता निर्धारित करें। 280 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ अवशोषण को मापें।
नोट: ईवी को कणों की संख्या की तुलना में प्रोटीन के निम्न स्तर को प्रस्तुत करना चाहिए। - स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके अवशोषण पढ़ने को प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
- EVs समाधान के 1 μL का उपयोग करके एकाग्रता निर्धारित करें। 280 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ अवशोषण को मापें।
3. टाइटेनियम सतह functionalization
नोट: इस विधि में, machined टाइटेनियम डिस्क, c.p. ग्रेड IV, 6.2 मिमी व्यास, और 2 मिमी ऊंचाई, का उपयोग किया जाता है। डिस्क को टीआई चिमटी के साथ हेरफेर किया जा सकता है, लेकिन सतह को खरोंच नहीं करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, पूरी प्रक्रिया के दौरान मशीनीकृत पक्ष को ऊपर की ओर सामना करना चाहिए।
- Ti डिस्क धोने
नोट:: Ti धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों की मात्रा Ti डिस्क को कवर करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए. एक ग्लास बीकर में Ti डिस्क रखें और उन पर समाधान डालें। फिर, डिकेंटिंग करके समाधान को हटा दें।- विआयनीकृत (DI) पानी के साथ Ti प्रत्यारोपण धोएं, और फिर पानी को छोड़ दें।
- इथेनॉल 70% के साथ Ti प्रत्यारोपण को धोएं, और फिर समाधान को हटाने के लिए decant करें।
- DI पानी में प्रत्यारोपण जगह और 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर sonicate. पानी को छोड़ दें।
- आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एक 40% NaOH समाधान में Ti प्रत्यारोपण incubate। समाधान को छोड़ दें.
सावधानी: NaOH समाधान तैयारी के दौरान गर्म हो जाता है। समाधान संक्षारक है और एक धुएं हुड के अंदर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। - 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर DI पानी में प्रत्यारोपण sonicate, और फिर पानी को हटाने।
- डीआई पानी (कम से कम 5) के साथ कई धोने का प्रदर्शन करें जब तक कि यह तटस्थ पीएच तक नहीं पहुंच जाता। पीएच संकेतकों के साथ पीएच की जांच करें।
- 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर DI पानी में प्रत्यारोपण sonicate और पानी को हटाने.
- आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एक 50% HNO3 समाधान में Ti प्रत्यारोपण incubate। समाधान निकालें।
सावधानी: HNO3 एक संक्षारक और oxidizer पदार्थ है, और यह एक धुएं हुड के अंदर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। - 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर DI पानी में प्रत्यारोपण sonicate. पानी को हटा दें।
- तटस्थ पीएच प्राप्त होने तक डीआई पानी (कम से कम 5) के साथ कई वॉश करें। पीएच संकेतकों के साथ पीएच की जांच करें।
- 5 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर DI पानी में प्रत्यारोपण sonicate. पानी को हटा दें।
नोट: इस बिंदु पर, प्रयोग को 70% इथेनॉल समाधान में Ti प्रत्यारोपण को संग्रहीत करके रोका जा सकता है।
- Ti passivation
नोट:: Ti passivation चरणों को पूरी तरह से नीचे सूचीबद्ध क्रम में विभिन्न समाधानों के साथ Ti डिस्क को कवर करके किया जाता है। टीआई डिस्क को एक ग्लास बीकर में रखा जाता है और उन पर धीरे से समाधान डाला जाता है। सभी धोने के चरणों में उपयोग किए जाने वाले वॉल्यूम को प्रत्यारोपण को पूरी तरह से कवर करना चाहिए और डिकैंटिंग के माध्यम से हटा दिया जाता है।- कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 30% HNO3 समाधान में Ti प्रत्यारोपण incubate। समाधान निकालें।
- डीआई पानी (कम से कम 5) के साथ कई धोने का प्रदर्शन करें जब तक कि यह तटस्थ पीएच तक नहीं पहुंच जाता। पीएच संकेतकों के साथ पीएच की जांच करें।
- डीआई पानी में कमरे के तापमान पर रात भर टीआई प्रत्यारोपण इनक्यूबेट करें।
- 10 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम स्थितियों के तहत प्रत्यारोपण को सूखा दें।
- EVs ड्रॉप कास्टिंग
नोट: सेल कार्यात्मक अध्ययन के लिए, सेल संस्कृति कैबिनेट में काम करना महत्वपूर्ण है।- Ti प्रत्यारोपण को 96-अच्छी तरह से प्लेट में रखें, जिसमें मशीनीकृत पक्ष का सामना करना पड़ रहा है।
नोट: यदि प्रत्यारोपण को उल्टा-डाउन कर दिया जाता है, तो उन्हें वापस सेट करने के लिए एक सुई का उपयोग किया जा सकता है। - ईवी समाधान को पिघलाएं और उन्हें आंदोलन के साथ मिलाएं। 3 s के लिए नाड़ी करने के लिए एक भंवर का उपयोग करें।
- Ti सतह पर EVs जमा करें। इस अध्ययन में, ईवी समाधान के 40 μL की बूंदों को एनटीए द्वारा निर्धारित एकाग्रता के अनुसार प्रति प्रत्यारोपण अधिकतम 4 x 1011 ईवी को स्थिर करने के लिए टीआई पर रखा जाता है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम परिस्थितियों के तहत टीआई युक्त प्लेटों को रखें जब तक कि बूंदें पूरी तरह से सूखी न हों (~ 2 ज)।
नोट: प्रत्यारोपण की संख्या और वैक्यूम कक्ष में मौजूद पानी के आधार पर समय को समायोजित करें।
- Ti प्रत्यारोपण को 96-अच्छी तरह से प्लेट में रखें, जिसमें मशीनीकृत पक्ष का सामना करना पड़ रहा है।
चित्रा 2: ड्रॉप कास्टिंग द्वारा Ti passivation और EVs functionalization के योजनाबद्ध आरेख. Ti प्रत्यारोपण कमरे के तापमान पर एक 30% HNO3 समाधान में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेशन द्वारा पहले passivated कर रहे हैं। डीआई पानी के साथ कई धोने के बाद, पीएच तटस्थ तक पहुंचता है। फिर, टीआई प्रत्यारोपण को डीआई पानी में कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट किया जाता है। उसके बाद, प्रत्यारोपण को 40 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम स्थितियों के तहत सुखाया जाता है। ईवी स्थिरीकरण के लिए, ईवी समाधान के 40 μL को Ti प्रत्यारोपण पर जमा किया जाता है। इसके बाद, प्रत्यारोपण को 2 घंटे के लिए वैक्यूम पर इनक्यूबेट किया जाता है जब तक कि ईवी शारीरिक रूप से सतह से बंधे न हों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. Ti सतह लक्षण वर्णन
- रिलीज अध्ययन
- 37 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर किए गए पीबीएस के 200 μL के साथ Ti सतह को इनक्यूबेट करें।
नोट:: PBS NTA माप के साथ interferences से बचने के लिए फ़िल्टर किया गया है। - PBS को अलग-अलग समय बिंदुओं पर बदलें और -80 °C पर स्टोर करें।
नोट: इस अध्ययन में, 2-, 6-, 10-, और 14-दिनों के समय बिंदुओं का विश्लेषण किया गया था। - निर्माता के निर्देशों के अनुसार एनटीए द्वारा कण अध्ययन के लिए संग्रहीत पीबीएस का विश्लेषण करें।
नोट: अलग-अलग समय पर पीबीएस में कण एकाग्रता समय के साथ ईवी रिलीज प्रोफ़ाइल का प्रतिनिधित्व है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर किए गए पीबीएस के 200 μL के साथ Ti सतह को इनक्यूबेट करें।
- जैव संगतता अध्ययन
नोट: मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचयूसी-एमएससी) संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में IdISBA Biobank से प्राप्त किए जाते हैं।- डीएमईएम में एचयूसी-एमएससी बनाए रखें कम ग्लूकोज उपयोग तक 20% एफबीएस के साथ पूरक। प्रति सप्ताह दो बार माध्यम बदलें।
- सेल सीडिंग के लिए, फ्लास्क में कोशिकाओं को पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं।
- ट्रिप्सिन समाधान के 1 एमएल जोड़कर एचयूसी-एमएससी को ट्रिप्सिनाइज़ करें। सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से कोशिकाओं के मोनोलेयर को कवर करता है। ट्रिप्सिन समाधान निकालें और सेल संस्कृति फ्लास्क को लगभग 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। माइक्रोस्कोप के नीचे सेल टुकड़ी देखें। अलग कोशिकाएं आकार में गोल दिखाई देंगी और निलंबन में होंगी।
- DMEM में 1% EVs के साथ कम ग्लूकोज में resuspend कोशिकाओं FBS समाप्त.
नोट: 1% FBS के साथ पूरक मीडिया तैयार करें, और फिर FBS-EVs को हटाने के लिए 18 ज के लिए 120,000 x g पर ultracentrifuge। प्लेटलेट ईवी के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए ईवी को हटाना महत्वपूर्ण है। - एक Neubauer chamber14 के साथ कोशिकाओं की संख्या की गिनती करके सेल एकाग्रता निर्धारित करें।
- HUC-MSC को 50,000 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में लाएं।
- बीज 200 μL टीआई प्रत्यारोपण पर सेल समाधान के.
- 48 घंटे के बाद, मीडिया के 50 μL एकत्र करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) गतिविधि किट का उपयोग करके साइटोटॉक्सिक निर्धारण करें।
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Representative Results
इस लेख में प्रस्तुत विधि EVs functionalized टाइटेनियम डिस्क प्राप्त करने की अनुमति देता है। ईवी शारीरिक रूप से सतह से बंधे होते हैं, जो समय के साथ निरंतर रिलीज की अनुमति देता है। जारी किए गए ईवी की मात्रा को दिन 2, 6, 10 और 14 पर एनटीए द्वारा मापा जा सकता है। पहले माप, दिन 2 पर, दिखाते हैं कि लगभग 109 ईवी जारी किए जाते हैं, इसके बाद दिन 6 (~ 108 ईवी) पर एक निरंतर रिलीज होती है; दिन 10 (~ 107 ईवी), और दिन 14 (~ 107 ईवी)। यह समय के साथ जारी ईवी की मात्रा में कमी दिखाने के बावजूद एक निरंतर रिलीज की पुष्टि करता है।
चित्रा 3: Ti functionalized सतहों की Accumulative EV रिलीज. कणों को पीबीएस में 2, 6, 10 और 14 दिनों में 37 डिग्री सेल्सियस पर जारी किया गया था। डेटा n = 3 के साथ SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
इसके अलावा, एमएससी पर किए गए बायोकॉम्पैटिबिलिटी अध्ययनों से पता चलता है कि टीआई और टीआई-ईवी पर सेल विकास के 48 घंटे के बाद, टीआई नियंत्रण समूह की तुलना में टीआई-ईवी में बायोकॉम्पैटिबिलिटी में सुधार देखा गया था, जो टीआई समूह की तुलना में टीआई-ईवी समूह के निचले एलडीएच गतिविधि स्तरों द्वारा दिखाया गया था। प्रत्यारोपण पर सेल वृद्धि के 48 घंटे के बाद मीडिया एकत्र किया गया था। ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर सीधे उगाई गई कोशिकाओं को 0% एलडीएच गतिविधि के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था, जबकि 1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ इलाज की गई कोशिकाओं को 100% साइटोटॉक्सिसिटी के साथ सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था।
चित्रा 4: Ti-EVs के इन विट्रो सेल biocompatibility. एलडीएच गतिविधि को प्रत्यारोपण पर सेल सीडिंग के बाद संस्कृति मीडिया 48 घंटे में मापा गया था। ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर सीडेड कोशिकाओं को विषाक्तता के 0% के रूप में सेट किया गया था, जबकि कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर बीज दिया गया था और ट्राइटन एक्स -100 के साथ इलाज किया गया था 1% विषाक्तता के 100% के रूप में सेट किया गया था। एक धराशायी रेखा को 30% पर दिखाया गया है, जो आईएसओ -10993: 5 के अनुसार चिकित्सा उपकरणों की साइटोटॉक्सिसिटी के लिए स्वीकार किया गया अधिकतम मूल्य है। डेटा एन = 15 (तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया था) के साथ एसईएम ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य Ti सतहों पर EVs functionalization के लिए स्पष्ट निर्देश प्रदान करना है। प्रस्तुत विधि एक ड्रॉप कास्टिंग रणनीति पर आधारित है, जो कार्यात्मकता का एक भौतिक शोषण प्रकार है। खराब ग्रंथ सूची टीआई सतहों पर ईवी कार्यात्मकता के बारे में मौजूद है, हालांकि कुछ अध्ययन हैं जो Ti10 पर ईवी को स्थिर करके विभिन्न लाभ दिखाते हैं। वैसे भी, कुछ रणनीतियों का पता लगाया जैव रासायनिक बाध्यकारी 8, बहुलक फंसाना 9 या ड्रॉप कास्टिंग 10 शामिल हैं। यद्यपि सहसंयोजक बांड के माध्यम से रासायनिक कोटिंग्स का उपयोग कार्यात्मकता के उच्च ग्रेड के साथ एक अधिक सजातीय कोटिंग प्राप्त कर सकता है, रासायनिक प्रतिक्रियाएं ईवी संरचना और कार्यक्षमता को नुकसान पहुंचा सकती हैं। ड्रॉप कास्टिंग बहुलक फंसाने या जैव रासायनिक बंधन की तुलना में एक आसान और कम लागत वाली विधि है।
प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण बिंदु जिसे संबोधित किया जा सकता है वह ईवी स्रोत है। इस अध्ययन में, ईवी पीएल से प्राप्त किए जाते हैं। हालांकि, ड्रॉप कास्टिंग विधि किसी भी प्रकार के ईवी के अनुकूल है, क्योंकि यह शारीरिक बातचीत पर आधारित है। अन्य तरीकों के साथ पिछले अध्ययन सेल सुसंस्कृत ईवी के उपयोग का मूल्यांकन करने के बाद सकारात्मक परिणाम पेश करते हैं जैसे कि स्टेम सेल8,10 या माक्रोपेज 9। यह महत्वपूर्ण है, ईवी के उपयोग के बारे में, उनमें से एक पूर्ण लक्षण वर्णन करने के लिए। इंटरनेशनल सोसाइटी ऑफ एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का उद्देश्य फील्ड 12 में पुनरुत्पादन को सुनिश्चित करने के लिए अधिकांश मुख्य ईवी पैरामीटर निर्धारित करना है। अन्य अध्ययनों ने पहले से ही ईवी एस लक्षण वर्णन के लिए पद्धति का वर्णन किया है, इस प्रकार इस प्रोटोकॉल में हमने इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी और पश्चिमी धब्बा तकनीक प्रोटोकॉल का विवरण नहीं दिया है।
ड्रॉप कास्टिंग द्वारा Ti functionalization के लिए एक महत्वपूर्ण कदम समय और शर्तों EVs physisorption के लिए अनुमति दी है. हमारे द्वारा प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, वैक्यूम परिस्थितियों में इनक्यूबेशन तब तक किया जाता है जब तक कि बूंदें पूरी तरह से सूखा न हो जाएं। आमतौर पर, 37 डिग्री सेल्सियस पर और वैक्यूम परिस्थितियों में पानी के वाष्पीकरण को सुनिश्चित करने के लिए 2 घंटे की आवश्यकता होती है। हालांकि, कार्यात्मक होने वाले प्रत्यारोपण की संख्या टीआई पर ईवी के सही आसंजन को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक समय को बढ़ा सकती है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि लक्षण वर्णन या कार्यात्मक अध्ययन के लिए आगे बढ़ने से पहले कोई पानी नहीं छोड़ा गया है। हालांकि, Ti पर EVs functionalization के लिए प्रोटोकॉल में भिन्नता साहित्य में पाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, वैक्यूम स्थितियों के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रात भर इनक्यूबेशन पहले से ही पता लगाया गया है10। हालांकि, हमारे हाथों में, इस विधि के उपयोग ने हमारे द्वारा वर्णित पूर्ण शुष्क की तुलना में खराब परिणाम दिए।
हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रदर्शन नहीं किया गया है, ईवी कार्यात्मकता का मूल्यांकन विभिन्न तरीकों के माध्यम से किया जा सकता है, दूसरों के बीच, सतह पर परिवर्तन सतह पर पानी के संपर्क कोण को मापने की विशेषता हो सकती है; और फूरियर-रूपांतरित इन्फ्रारेड (FTIR) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के लिए युग्मित कोटिंग्स की रासायनिक प्रकृति में परिवर्तन। इसके अलावा, ईवी को विशिष्ट रंजक (जैसे पीकेएच 26 डाई) के साथ दाग दिया जा सकता है, और कार्यात्मक सतहों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, टीआई पर ईवी के जमाव की ओस्टियोजेनिक कार्यक्षमता का पता लगाने के लिए आगे कार्यात्मक परीक्षण किए जा सकते हैं। एक तरफ, confocal माइक्रोस्कोपी या एंजाइमेटिक गतिविधि के माध्यम से किए गए सेल आसंजन या विकास assays कार्यक्षमता 10 का परीक्षण करने के लिए पहला दृष्टिकोण हो सकता है। इस पेपर में, हमने साइटोटॉक्सिसिटी परख को कोशिकाओं पर प्रत्यारोपण के प्रभावों के पहले दृष्टिकोणों में से एक के रूप में वर्णित किया है। दूसरी ओर, पीसीआर assays का उपयोग Ti discs8,9,10 पर किए गए सेल कल्चर में ऑस्टियोजेनिक मार्करों की जीन अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा के माध्यम से प्रोटीन का पता लगाना एक अर्ध मात्रात्मक तकनीक होने के बावजूद एक ओस्टियोजेनिक प्रोफ़ाइल का भी सुझाव दे सकता है। अन्य प्रोटीन का पता लगाने की तकनीक जैसे कि पता लगाने की सरणियों या एंजाइमेटिक किट भी कार्यक्षमता प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए अच्छे दृष्टिकोण हो सकते हैं9। एक अतिरिक्त कार्यात्मक परख Calcein ब्लू स्टेनिंग 16 के माध्यम से कैल्शियम जमाव का निर्धारण है. एक बार इन विट्रो कार्यक्षमता साबित हो जाने के बाद, पशु moldels8 का उपयोग करके आगे के प्रयोग किए जा सकते हैं।
अंत में, सतह functionalization biomaterials के एक बेहतर चिकित्सीय डिजाइन की अनुमति देता है। प्रत्यारोपण योग्य biomaterials के साथ EVs का संयोजन biocompatibility और biomaterial के osteogenic गुणों में सुधार से जुड़े निरंतर रिलीज की अनुमति दे सकता है। ईवी बाइंडिंग के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का पता लगाना महत्वपूर्ण है; इस प्रकार, ड्रॉप कास्टिंग भविष्य के अध्ययनों के लिए एक दिलचस्प प्रारंभिक बिंदु है जिसका उद्देश्य नैदानिक रूप से उपलब्ध आर्थोपेडिकल उपकरणों का उत्पादन करना है। इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य भविष्य के प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए एक आसान और पुन: प्रस्तुत करने योग्य मार्गदर्शिका देना है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को Instituto de Salud कार्लोस III, Ministerio de Economía y Competitividad द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो ESF यूरोपीय सामाजिक कोष और ERDF यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (MS16/00124) द्वारा सह-वित्त पोषित था; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), और PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), बैलेरिक द्वीप समूह के टिकाऊ पर्यटन कर द्वारा वित्त पोषित।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
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