Summary
Hier presenteren we een methode voor de isolatie van extracellulaire blaasjes (EV's) afgeleid van de bloedplaatjeslysaten (PL) en hun gebruik voor het coaten van titanium (Ti) implantaatoppervlakken. We beschrijven de drop casting coating methode, de EV's release profiel van de oppervlakken, en in vitro biocompatibiliteit van EV's gecoat Ti oppervlakken.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn biologische nanovesicles die een sleutelrol spelen in de celcommunicatie. Hun inhoud omvat actieve biomoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren, die een groot potentieel bieden in de regeneratieve geneeskunde. Meer recent hebben EV's afgeleid van Platelet Lysate (PL) een osteogene capaciteit getoond die vergelijkbaar is met PL. Bovendien worden biomaterialen vaak gebruikt in orthopedie of tandheelkundige restauratie. Hier bieden we een methode om Ti-oppervlakken te functionaliseren met PL-afgeleide EV's om hun osteogene eigenschappen te verbeteren.
EV's worden geïsoleerd van PL door grootte-uitsluitingschromatografie en daarna worden Ti-oppervlakken gefunctionaliseerd met PL-EV's door drop casting. Functionalisatie wordt bewezen door ev-afgifte en de biocompatibiliteit ervan door de lactaatdehydrogenase (LDH) release assay.
Introduction
EV's zijn membraanblaasjes (30-200 nm) die door elke cel worden uitgescheiden en spelen een sleutelrol in cel-naar-cel communicatie door hun lading af te leveren. Ze bevatten een verscheidenheid aan actieve biomoleculen die nucleïnezuren, groeifactoren of bioactieve lipiden kunnen bevatten1. Om deze redenen zijn EV's geëvalueerd op hun potentiële gebruik in therapeutica. Op het gebied van orthopedie en botregeneratie zijn EV's uit verschillende bronnen getest. Onder hen is aangetoond dat van bloedplaatjes afgeleide EV's een differentiatie-effect op stamcellen induceren met behoud van een laag cytotoxisch profiel2,3. Daarom is verder onderzoek nodig om de mogelijkheid te onderzoeken om EV's te combineren met biomaterialen om ze in de dagelijkse klinische praktijk te gebruiken.
Op titanium gebaseerde biomaterialen worden veel gebruikt als steigers voor botgenezende klinische interventies vanwege hun mechanische eigenschappen, hoge biocompatibiliteit en duurzaamheid op lange termijn4. Niettemin zijn Ti-implantaten een bio-inert materiaal en vertonen daarom een slecht vermogen om zich te hechten aan het omliggende botweefsel5. Om deze reden worden titaniummodificaties bestudeerd om hun prestaties te verbeteren door een meer functionele micro-omgeving op het oppervlak te bereiken4,6,7. In die zin kunnen EV's aan titanium worden verankerd door chemische8 of fysische interacties9,10. Geïmmobiliseerde EV's afgeleid van stamcellen of macrofagen verbeteren de bioactiviteit van Ti door cellulaire adhesie en proliferatie te bevorderen en zo een osteogeen effect te induceren8,9,10.
Dit artikel zal zich in detail richten op een drop casting-strategie voor het coaten van Ti-oppervlakken met PL-afgeleide EV's. Daarnaast zullen we het afgifteprofiel van EV's van het gecoate oppervlak in de loop van de tijd evalueren en de cellulaire biocompatibiliteit in vitro bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Platelet Lysate (PL) wordt verkregen zoals eerder beschreven in overeenstemming met institutionele richtlijnen3 met behulp van verse buffy jassen verstrekt door de IdISBa Biobank als uitgangsmateriaal. Het gebruik ervan voor het huidige project werd goedgekeurd door de Ethische Commissie (IB 1995/12 BIO).
1. EV's isoleren van PL
- Verwijdering van grotere lichamen
- Ontdooi PL bij kamertemperatuur.
- Centrifuge PL bij 1.500 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Gooi de pellet weg omdat deze celresten bevat.
- Verzamel het supernatant en voer twee opeenvolgende centrifugaties uit bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: De pellet komt overeen met grotere EV's zoals microvesicles en in dit geval wordt deze weggegooid. - Filtreer het supernatant eerst door een poreus membraan van 0,8 μm en vervolgens door een poreus membraan van 0,2 μm.
OPMERKING: Met deze stappen worden alle niet-gewenste EV's verwijderd. - Pool de gefilterde PL en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
- Chromatografie van maatuitsluiting
- Breng de kolom gekoppeld aan chromatografieapparatuur in evenwicht met het gewenste debiet met gefilterde PBS.
OPMERKING: Het gebruikte debiet is afhankelijk van de kolomkarakteristieken; in dit geval is het ingesteld op 0,5 ml / min. - Laad de verwerkte PL (5 ml) met een spuit op de apparatuur.
- Injecteer de PL in de kolom en begin met het verzamelen van 5 ml fracties in 15 ml buizen.
- Verzamel de verrijkte fracties van de EV's en bewaar ze bij -80 °C tot gebruik.
OPMERKING: Wanneer u het experiment voor de eerste keer uitvoert, karakteriseer dan alle fracties door eiwitkwantificering en immunodetectie om degene te bepalen die is verrijkt met EV's3,11. In dit experiment wordt de 9e fractie verzameld. - Was de chromatografische kolom met 30 ml 0,2% NaOH-oplossing en bewaar deze in 20% ethanoloplossing zodra deze in evenwicht is.
- Breng de kolom gekoppeld aan chromatografieapparatuur in evenwicht met het gewenste debiet met gefilterde PBS.
Figuur 1: Schematisch diagram van de isolatie van bloedplaatjeslysaat (PL) extracellulair blaasje (EV's). PL wordt eerst gecentrifugeerd bij 1.500 x g en vervolgens bij 10.000 x g om grotere lichamen te verwijderen. Het supernatant wordt gefilterd door filters van 0,8 en 0,2 μm. Verwerkte PL wordt op de kolom geladen en EV's worden gescheiden door grootte-uitsluitingschromatografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Karakterisering van EV's
OPMERKING: EV-karakterisering is noodzakelijk om functionele studies uit te voeren12. Elektronenmicroscopie of western blot-karakterisering zijn eerder gemeld13. Dit rapport zal zich richten op de essentiële karakteriseringstechnieken voor Ti oppervlakte functionalisatie.
- Nanoparticle Tracking Analyse (NTA)
- Verdun de EV's (1:1000) in 0,2 μm gefilterde PBS.
OPMERKING: Te geconcentreerde monsters of te verdunde monsters zullen buiten bereik zijn voor NTA-bepaling en aanpassing is vereist. - Laad 1 ml van de verdunde EV's met een spuit op de NTA-apparatuur en injecteer ze in de NTA-apparatuur.
- Volg het protocol van de fabrikant voor de bepaling van de deeltjesconcentratie en grootteverdeling.
- Verdun de EV's (1:1000) in 0,2 μm gefilterde PBS.
- Eiwitconcentratie
- Bepaal de concentratie met behulp van 1 μL van de EV-oplossing. Meet de absorptie met een spectrofotometer bij een golflengte van 280 nm.
OPMERKING: EV's moeten lage niveaus van eiwitten vertonen in vergelijking met het aantal deeltjes. - Volg de instructies van de fabrikant om de absorptiemeting te verkrijgen met behulp van de spectrofotometer.
- Bepaal de concentratie met behulp van 1 μL van de EV-oplossing. Meet de absorptie met een spectrofotometer bij een golflengte van 280 nm.
3. Titanium oppervlakte functionalisatie
OPMERKING: Bij deze methode worden bewerkte titaniumschijven, c.p. klasse IV, diameter van 6,2 mm en een hoogte van 2 mm gebruikt. De schijven kunnen worden gemanipuleerd met een Ti-pincet, maar het is belangrijk om geen krassen op het oppervlak te maken. Bovendien moet de bewerkte zijde gedurende het hele proces naar boven gericht zijn.
- Ti schijven wassen
OPMERKING: Het volume van de oplossingen die worden gebruikt voor ti-wassen moet voldoende zijn om Ti-schijven te bedekken. Plaats Ti-schijven in een glazen bekerglas en giet er oplossingen op. Verwijder vervolgens de oplossing door te decanteren.- Was Ti-implantaten met gedeïoniseerd (DI) water en gooi het water vervolgens weg.
- Was Ti-implantaten met ethanol 70% en decanteer vervolgens om de oplossing te verwijderen.
- Plaats de implantaten in DI-water en soniceer gedurende 5 minuten bij 50 °C. Gooi het water weg.
- Incubeer Ti implantaten in een 40% NaOH oplossing bij 50 °C gedurende 10 minuten met agitatie. Gooi de oplossing weg.
LET OP: NaOH-oplossing warmt op tijdens de bereiding. De oplossing is corrosief en moet in een zuurkast worden gebruikt. - Soniceer de implantaten in DI-water bij 50 °C gedurende 5 minuten en verwijder vervolgens het water.
- Voer verschillende wasbeurten uit met DI-water (ten minste 5) totdat het een neutrale pH bereikt. Controleer de pH met pH-indicatoren.
- Soniceer de implantaten in DI-water bij 50 °C gedurende 5 minuten en verwijder het water.
- Incubeer Ti-implantaten in een 50% HNO3-oplossing bij 50 °C gedurende 10 minuten met roeren. Verwijder de oplossing.
LET OP: HNO3 is een corrosieve en oxiderende stof en moet in een zuurkast worden gebruikt. - Soniceer de implantaten in DI-water bij 50 °C gedurende 5 minuten. Verwijder het water.
- Voer verschillende wasbeurten uit met DI-water (ten minste 5) totdat een neutrale pH is verkregen. Controleer de pH met pH-indicatoren.
- Soniceer de implantaten in DI-water bij 50 °C gedurende 5 minuten. Verwijder het water.
OPMERKING: Op dit punt kan het experiment worden gestopt door Ti-implantaten op te slaan in een 70% ethanoloplossing.
- Ti passivering
OPMERKING: Ti-passiveringsstappen worden uitgevoerd door Ti-schijven volledig te bedekken met de verschillende oplossingen in de onderstaande volgorde. Ti-schijven worden in een glazen beker geplaatst en oplossingen worden er voorzichtig op gegoten. Volumes die in alle wasstappen worden gebruikt, moeten de implantaten volledig bedekken en worden verwijderd via decanteren.- Incubeer de Ti-implantaten in een 30% HNO3-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder zacht roeren. Verwijder de oplossing.
- Voer verschillende wasbeurten uit met DI-water (ten minste 5) totdat het een neutrale pH bereikt. Controleer de pH met pH-indicatoren.
- Incubeer Ti-implantaten 's nachts bij kamertemperatuur in DI-water.
- Droog de implantaten af onder vacuümomstandigheden bij 40 °C gedurende 10 minuten.
- EV's drop casting
OPMERKING: Voor celfunctionele studies is het belangrijk om in een celkweekkast te werken.- Plaats de Ti-implantaten in een 96-putplaat, met de bewerkte kant naar boven gericht.
OPMERKING: Als de implantaten ondersteboven worden gedraaid, kan een naald worden gebruikt om ze terug te zetten. - Ontdooi de EV-oplossing en meng ze met agitatie. Gebruik een vortex om 3 s te pulseren.
- Deponeer de EV's op het Ti-oppervlak. In deze studie worden druppels van 40 μL EV-oplossing op de Ti geplaatst om maximaal 4 x 1011 EV's per implantaat te immobiliseren volgens de door NTA bepaalde concentratie.
- Plaats de platen met de Ti onder vacuümomstandigheden bij 37 °C totdat de druppels volledig droog zijn (~ 2 uur).
OPMERKING: Pas de tijd aan afhankelijk van het aantal implantaten en het water dat in de vacuümkamer aanwezig is.
- Plaats de Ti-implantaten in een 96-putplaat, met de bewerkte kant naar boven gericht.
Figuur 2: Schematisch diagram van Ti passivering en EV's functionalisatie door drop casting. Ti-implantaten worden eerst gepassiveerd door incubatie gedurende 30 minuten in een 30% HNO3-oplossing bij kamertemperatuur. Na verschillende wasbeurten met DI-water bereikt de pH neutraal. Vervolgens worden Ti-implantaten 's nachts bij kamertemperatuur geïncubeerd in DI-water. Daarna worden de implantaten afgedroogd onder vacuümomstandigheden bij 40 °C. Voor immobilisatie van EV's wordt 40 μL EV-oplossing op Ti-implantaten gedeponeerd. Vervolgens worden implantaten gedurende 2 uur in vacuüm geïncubeerd totdat EV's fysiek aan het oppervlak zijn gebonden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Ti oppervlaktekarakterisering
- Release studie
- Incubeer Ti-oppervlak met 200 μL gefilterd PBS bij 37 °C.
OPMERKING: PBS wordt gefilterd om interferenties met de NTA-meting te voorkomen. - Vervang de PBS op verschillende tijdstippen en bewaar bij -80 °C.
OPMERKING: In deze studie werden 2-, 6-, 10- en 14-dagentijdpunten geanalyseerd. - Analyseer opgeslagen PBS voor deeltjesstudies door NTA volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Deeltjesconcentratie in PBS op verschillende tijdstippen is een weergave van het afgifteprofiel van EV's in de loop van de tijd.
- Incubeer Ti-oppervlak met 200 μL gefilterd PBS bij 37 °C.
- Biocompatibiliteitsstudies
OPMERKING: Menselijke navelstreng-afgeleide mesenchymale stamcellen (hUC-MSC) worden verkregen uit de IdISBa Biobank in overeenstemming met institutionele richtlijnen.- Houd hUC-MSC in DMEM lage glucose aangevuld met 20% FBS tot gebruik. Verander het medium twee keer per week.
- Voor het zaaien van cellen, was de cellen tweemaal in kolven met 5 ml PBS.
- Trypsiniseren hUC-MSC door toevoeging van 1 ml trypsine-oplossing. Zorg ervoor dat het de monolaag van cellen volledig bedekt. Verwijder de trypsine-oplossing en plaats de celkweekkolf ongeveer 2 minuten op 37 °C. Bekijk celloslating onder de microscoop. Losgemaakte cellen zullen rond van vorm lijken en in suspensie zijn.
- Resuspend cellen in DMEM lage glucose met 1% EV's uitgeput FBS.
OPMERKING: Bereid media aangevuld met 1% FBS en ultracentrifugeer vervolgens bij 120.000 x g gedurende 18 uur om FBS-EV's te verwijderen. Het is belangrijk om EV's te verwijderen om interferenties met bloedplaatjes EV's te voorkomen. - Bepaal de celconcentratie door het aantal cellen met een Neubauer-kamer te tellen14.
- Breng hUC-MSC tot een concentratie van 50.000 cellen/ml.
- Zaai 200 μL van de celoplossing op de Ti-implantaten.
- Verzamel na 48 uur 50 μL media en voer de cytotoxische bepaling uit met behulp van lactaatdehydrogenase (LDH) activiteitskit, volgens het protocol van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methode die in dit artikel wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk om EV's gefunctionaliseerde titaniumschijven te verkrijgen. EV's zijn fysiek gebonden aan het oppervlak, wat een aanhoudende afgifte in de loop van de tijd mogelijk maakt. Het aantal vrijgegeven EV's kan worden gemeten door NTA op dag 2, 6, 10 en 14. De eerste metingen, op dag 2, laten zien dat er ongeveer 109 EV's worden uitgebracht, gevolgd door een aanhoudende release op dag 6 (~ 108 EV's); dag 10 (~107 EV's), en dag 14 (~107 EV's). Dit bevestigt een aanhoudende release, ondanks een afname van het aantal EV's dat in de loop van de tijd wordt uitgebracht.
Figuur 3: Accumulatieve EV-afgifte van Ti-gefunctionaliseerde oppervlakken. Deeltjes kwamen vrij in PBS op dag 2, 6, 10 en 14 bij 37 °C. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM met n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Bovendien blijkt uit biocompatibiliteitsstudies uitgevoerd op MSC dat na 48 uur celgroei op Ti- en Ti-EV's een verbetering in biocompatibiliteit werd waargenomen in Ti-EV's in vergelijking met de Ti-controlegroep, aangetoond door de lagere LDH-activiteitsniveaus van de Ti-EV-groep in vergelijking met de Ti-groep. Media werd verzameld na 48 uur celgroei op implantaten. Cellen die direct op weefselkweekplastic werden gekweekt, werden gebruikt als een negatieve controle met 0% LDH-activiteit, terwijl cellen behandeld met 1% Triton X-100 werden gebruikt als een positieve controle met 100% cytotoxiciteit.
Figuur 4: In vitro celbiocompatibiliteit van Ti-EV's. LDH-activiteit werd gemeten in kweekmedia 48 uur na celzaaien op de implantaten. Cellen gezaaid op weefselkweekplastic werden ingesteld als 0% van de toxiciteit, terwijl cellen gezaaid op weefselkweekplastic en behandeld met triton X-100 1% werden ingesteld als 100% van de toxiciteit. Een stippellijn wordt weergegeven op 30%, wat de maximale waarde is die wordt geaccepteerd voor cytotoxiciteit van medische hulpmiddelen volgens ISO-10993: 5. Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM, met n = 15 (drie onafhankelijke experimenten werden uitgevoerd). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is bedoeld om duidelijke instructies te geven voor de functionalisatie van EV's op Ti-oppervlakken. De gepresenteerde methode is gebaseerd op een drop casting-strategie, een physisorptietype van functionalisatie. Er bestaat een slechte bibliografie met betrekking tot de functionalisering van EV's op Ti-oppervlakken, hoewel er weinig studies zijn die verschillende voordelen aantonen door EV's op Ti10 te immobiliseren. Hoe dan ook, sommige van de onderzochte strategieën omvatten biochemische binding8, polymere beknelling9 of drop casting10. Hoewel het gebruik van chemische coatings door covalente bindingen een homogenere coating met een hogere mate van functionalisatie kan bereiken, kunnen chemische reacties de structuur en functionaliteit van de EV's schaden15. Druppelgieten is een eenvoudige en goedkope methode in vergelijking met polymere beknelling of biochemische binding.
Een belangrijk punt van het protocol dat kan worden aangepakt, is de EV-bron. In dit onderzoek worden EV's verkregen van PL. De drop casting-methode is echter aanpasbaar aan elk type EV, omdat deze is gebaseerd op fysieke interacties. Eerdere studies met andere methoden leveren positieve resultaten op na evaluatie van het gebruik van celgekweekte EV's zoals stamcellen8,10 of machropages9. Het is belangrijk, met betrekking tot het gebruik van EV's, om een volledige karakterisering ervan uit te voeren. De International Society of Extracellular Vesicles heeft tot doel de meeste van de belangrijkste EV-parameters te bepalen om reproduceerbaarheid in het veld te garanderen12. Andere studies hebben de methodologie voor EV-karakterisering al beschreven, dus in dit protocol hebben we de uitgevoerde protocollen voor elektronische microscopie en western blot-techniek niet gedetailleerd13.
Een cruciale stap voor Ti-functionalisatie door dropcasting is de tijd en omstandigheden die zijn toegestaan voor ev's physisorptie. In het protocol dat we presenteren, wordt incubatie onder vacuümomstandigheden uitgevoerd totdat druppels volledig droogte zijn. Meestal is 2 uur nodig om waterverdamping bij 37 °C en onder vacuümomstandigheden te garanderen. Het aantal implantaten dat wordt gefunctionaliseerd, kan echter de tijd verlengen die nodig is om de juiste hechting van EV's op Ti te garanderen. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen water overblijft voordat u doorgaat met karakterisering of functionele studies. Variaties in het protocol voor EV-functionalisatie op Ti zijn echter te vinden in de literatuur. Zo is een nachtelijke incubatie bij 4 °C zonder vacuümcondities al onderzocht10. In onze handen leidde het gebruik van deze methode echter tot slechte resultaten in vergelijking met de volledige droogte die we beschrijven.
Hoewel niet uitgevoerd in het huidige protocol, kan de functionalisatie van EV's worden geëvalueerd door middel van verschillende methodologieën, onder andere veranderingen in de bevochtigbaarheid van het oppervlak kunnen worden gekenmerkt door het meten van de watercontacthoek op het oppervlak; en veranderingen in de chemische aard van de coatings door Fourier-getransformeerde infrarood (FTIR) spectroscopie gekoppeld aan optische microscopie. Bovendien kunnen EV's worden gekleurd met specifieke kleurstoffen (zoals PKH26-kleurstof) en kunnen de gefunctionaliseerde oppervlakken in beeld worden gebracht door fluorescentiemicroscopie.
Over het algemeen kunnen verdere functionele tests worden uitgevoerd om de osteogene functionaliteit van EV-afzetting op Ti te onderzoeken. Aan de ene kant kunnen celadhesie- of groeitests uitgevoerd door confocale microscopie of enzymatische activiteit de eerste benadering zijn om de functionaliteit te testen10. In dit artikel hebben we de cytotoxiciteitstest beschreven als een van de eerste benaderingen van de effecten van implantaten op cellen. Aan de andere kant kunnen PCR-assays worden gebruikt om de genexpressie van osteogene markers in celkweek uitgevoerd op Ti-schijven8,9,10 te bepalen. Bovendien kan eiwitdetectie via western blot ook een osteogeen profiel suggereren, ondanks dat het een semi-kwantitatieve techniek is. Andere eiwitdetectietechnieken zoals detectiearrays of enzymatische kits kunnen ook goede benaderingen zijn voor de prestaties van functionaliteitsexperimenten9. Een aanvullende functionele test is de bepaling van calciumafzetting door calceïneblauwe kleuring16. Zodra de in vitro functionaliteit is bewezen, kunnen verdere experimenten worden uitgevoerd met behulp van dierlijke moldels8.
Kortom, oppervlaktefunctionalisatie maakt een verbeterd therapeutisch ontwerp van biomaterialen mogelijk. De combinatie van EV's met implanteerbare biomaterialen kan langdurige afgifte mogelijk maken die gepaard gaat met een verbetering van de biocompatibiliteit en osteogene eigenschappen van het biomateriaal. Het is belangrijk om verschillende benaderingen voor EV-binding te onderzoeken; drop casting is dus een interessant startpunt voor toekomstige studies die gericht zijn op het produceren van klinisch beschikbare orthopedische hulpmiddelen. Het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, is bedoeld om een eenvoudige en reproduceerbare gids te geven voor de prestaties van toekomstige experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), de Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), en PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), gefinancierd door de duurzame toerismebelasting van de Balearen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
