Summary
Nous présentons ici une méthode d’isolement des vésicules extracellulaires (VE) dérivées des lysats plaquettaires (PL) et leur utilisation pour le revêtement des surfaces implantaires en titane (Ti). Nous décrivons la méthode de revêtement par coulée goutte, le profil de libération des VE des surfaces et la biocompatibilité in vitro des surfaces Ti revêtues de VE.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanovésicules biologiques qui jouent un rôle clé dans la communication cellulaire. Leur contenu comprend des biomolécules actives telles que des protéines et des acides nucléiques, qui présentent un grand potentiel en médecine régénérative. Plus récemment, les VÉHICULES dérivés du lysat plaquettaire (PL) ont montré une capacité ostéogénique comparable à la PL. En outre, les biomatériaux sont fréquemment utilisés en orthopédie ou en restauration dentaire. Ici, nous fournissons une méthode pour fonctionnaliser les surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL afin d’améliorer leurs propriétés ostéogéniques.
Les VE sont isolés du PL par chromatographie d’exclusion de taille, puis les surfaces Ti sont fonctionnalisées avec des PL-EV par coulée goutte. La fonctionnalisation est prouvée par la libération des VE et sa biocompatibilité par le test de libération de lactate déshydrogénase (LDH).
Introduction
Les VE sont des vésicules membranaires (30-200 nm) sécrétées par n’importe quelle cellule et jouent un rôle clé dans la communication de cellule à cellule en livrant leur cargaison. Ils contiennent une variété de biomolécules actives qui peuvent inclure des acides nucléiques, des facteurs de croissance ou des lipides bioactifs1. Pour ces raisons, les VE ont été évalués pour leur utilisation potentielle dans les thérapies. En termes d’orthopédie et de régénération osseuse, des véhicules électriques de différentes sources ont été testés. Parmi eux, il a été démontré que les VE dérivés de plaquettes induisent un effet de différenciation sur les cellules souches tout en maintenant un faible profil cytotoxique2,3. Par conséquent, d’autres recherches sont nécessaires pour explorer la possibilité de combiner les VE avec des biomatériaux afin de les utiliser dans la pratique clinique quotidienne.
Les biomatériaux à base de titane sont largement utilisés comme échafaudages pour les interventions cliniques de guérison osseuse en raison de leurs propriétés mécaniques, de leur biocompatibilité élevée et de leur durabilité à long terme4. Néanmoins, les implants Ti sont un matériau bioinerte et, par conséquent, présentent une faible capacité de liaison avec le tissu osseux environnant5. Pour cette raison, des modifications du titane sont à l’étude afin d’améliorer leurs performances en réalisant un microenvironnement plus fonctionnel à sa surface4,6,7. En ce sens, les véhicules électriques peuvent être ancrés au titane par des interactions chimiques8 ou physiques9,10. Les VE immobilisés dérivés de cellules souches ou de macrophages améliorent la bioactivité du Ti en favorisant l’adhésion et la prolifération cellulaires, induisant ainsi un effet ostéogénique8,9,10.
Cet article se concentrera sur une stratégie de coulée goutte à goutte pour le revêtement des surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL en détail. De plus, nous évaluerons le profil de libération des VE de la surface revêtue au fil du temps et confirmerons sa biocompatibilité cellulaire in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le lysat plaquettaire (PL) est obtenu comme décrit précédemment conformément aux directives institutionnelles3 en utilisant des manteaux bouffants frais fournis par la biobanque IdISBa comme matériau de départ. Leur utilisation pour le projet actuel a été approuvée par son comité d’éthique (IB 1995/12 BIO).
1. Isolation des véhicules électriques du PL
- Enlèvement des corps plus grands
- Décongeler le PL à température ambiante.
- Centrifuger PL à 1 500 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez la pastille car elle contient des débris cellulaires.
- Recueillir le surnageant et effectuer deux centrifugations consécutives à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
REMARQUE: La pastille correspond à des véhicules électriques plus grands tels que des microvésicules, et dans ce cas, elle est jetée. - Filtrer le surnageant d’abord à travers une membrane poreuse de 0,8 μm, puis à travers une membrane poreuse de 0,2 μm.
REMARQUE: Ces étapes suppriment tous les véhicules électriques non souhaités. - Mettre en commun le PL filtré et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Chromatographie d’exclusion de taille
- Équilibrez la colonne couplée à l’équipement de chromatographie au débit souhaité avec du PBS filtré.
REMARQUE: Le débit utilisé dépend des caractéristiques de la colonne; dans ce cas, il est réglé sur 0,5 mL/min. - Chargez le PL traité (5 mL) avec une seringue sur l’équipement.
- Injectez le PL dans la colonne et commencez à collecter des fractions de 5 mL dans des tubes de 15 mL.
- Collectez les fractions enrichies des VE et stockez-les à -80 °C jusqu’à leur utilisation.
REMARQUE: Lorsque vous effectuez l’expérience pour la première fois, caractérisez toutes les fractions par quantification des protéines et immunodétection pour déterminer celle enrichie en VE3,11. Dans cette expérience, la 9ème fraction est collectée. - Laver la colonne chromatographique avec 30 mL de solution de NaOH à 0,2 % et la stocker dans une solution d’éthanol à 20 % une fois qu’elle atteint l’équilibre.
- Équilibrez la colonne couplée à l’équipement de chromatographie au débit souhaité avec du PBS filtré.
Figure 1 : Diagramme schématique de l’isolement des vésicules extracellulaires (VE) du lysat plaquettaire (PL). Le PL est d’abord centrifugé à 1 500 x g, puis à 10 000 x g pour éliminer les corps plus gros. Le surnageant est filtré à travers des filtres de 0,8 et 0,2 μm. Le PL traité est chargé sur la colonne et les VE sont séparés par chromatographie d’exclusion de taille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Caractérisation des véhicules électriques
REMARQUE : La caractérisation des véhicules électriques est nécessaire pour effectuer des études fonctionnelles12. La microscopie électronique ou la caractérisation par transfert de Western ont déjà été rapportées13. Ce rapport se concentrera sur les techniques de caractérisation essentielles pour la fonctionnalisation de surface Ti.
- Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
- Diluer les VE (1:1000) dans du PBS filtré de 0,2 μm.
REMARQUE: Les échantillons trop concentrés ou trop dilués seront hors de portée pour la détermination de la NTA, et un ajustement sera nécessaire. - Chargez 1 mL des véhicules électriques dilués avec une seringue dans l’équipement NTA et injectez-les dans l’équipement NTA.
- Suivez le protocole du fabricant pour la détermination de la concentration des particules et de la distribution granulométrique.
- Diluer les VE (1:1000) dans du PBS filtré de 0,2 μm.
- Concentration en protéines
- Déterminer la concentration à l’aide de 1 μL de la solution des VE. Mesurez l’absorbance avec un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 280 nm.
REMARQUE: Les VE doivent présenter de faibles niveaux de protéines par rapport au nombre de particules. - Suivez les instructions du fabricant pour obtenir la lecture de l’absorbance à l’aide du spectrophotomètre.
- Déterminer la concentration à l’aide de 1 μL de la solution des VE. Mesurez l’absorbance avec un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 280 nm.
3. Fonctionnalisation de la surface du titane
REMARQUE: Dans cette méthode, des disques en titane usinés, c.p. grade IV, 6,2 mm de diamètre et 2 mm de hauteur, sont utilisés. Les disques peuvent être manipulés avec une pince Ti, mais il est important de ne pas rayer la surface. De plus, le côté usiné doit être orienté vers le haut pendant tout le processus.
- Ti disques lavage
REMARQUE: Le volume de solutions utilisées pour le lavage Ti devrait être suffisant pour couvrir les disques Ti. Placez les disques Ti dans un bécher en verre et versez-y des solutions. Ensuite, retirez la solution par décantation.- Lavez les implants Ti avec de l’eau désionisée (DI), puis jetez l’eau.
- Lavez les implants Ti avec de l’éthanol à 70%, puis décantez pour retirer la solution.
- Placez les implants dans de l’eau DI et soniquez à 50 °C pendant 5 min. Jetez l’eau.
- Incuber des implants Ti dans une solution de NaOH à 40% à 50 °C pendant 10 min avec agitation. Jetez la solution.
ATTENTION: La solution de NaOH réchauffe pendant la préparation. La solution est corrosive et doit être utilisée à l’intérieur d’une hotte. - Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min, puis retirer l’eau.
- Effectuez plusieurs lavages avec de l’eau DI (au moins 5) jusqu’à ce qu’elle atteigne un pH neutre. Vérifiez le pH avec des indicateurs de pH.
- Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min et retirer l’eau.
- Incuber les implants Ti dans une solution HNO3 à 50% à 50 °C pendant 10 min avec agitation. Supprimez la solution.
ATTENTION: HNO3 est une substance corrosive et oxydante, et il doit être utilisé à l’intérieur d’une hotte. - Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min. Retirez l’eau.
- Effectuer plusieurs lavages à l’eau DI (au moins 5) jusqu’à l’obtention d’un pH neutre. Vérifiez le pH avec des indicateurs de pH.
- Sonicer les implants dans de l’eau DI à 50 °C pendant 5 min. Retirez l’eau.
REMARQUE: À ce stade, l’expérience peut être arrêtée en stockant les implants Ti dans une solution d’éthanol à 70%.
- Ti passivation
REMARQUE: Les étapes de passivation Ti sont effectuées en recouvrant complètement les disques Ti avec les différentes solutions dans l’ordre indiqué ci-dessous. Les disques Ti sont placés dans un bécher en verre et les solutions sont doucement versées dessus. Les volumes utilisés dans toutes les étapes de lavage doivent recouvrir complètement les implants et sont retirés par décantation.- Incuber les implants Ti dans une solution HNO3 à 30 % pendant 30 min à température ambiante sous une légère agitation. Supprimez la solution.
- Effectuez plusieurs lavages avec de l’eau DI (au moins 5) jusqu’à ce qu’elle atteigne un pH neutre. Vérifiez le pH avec des indicateurs de pH.
- Incuber les implants Ti pendant la nuit à température ambiante dans de l’eau DI.
- Sécher les implants sous vide à 40 °C pendant 10 min.
- Rejet de vériaux de VE
REMARQUE: Pour les études fonctionnelles cellulaires, il est important de travailler dans une armoire de culture cellulaire.- Placez les implants Ti dans une plaque de 96 puits, avec le côté usiné vers le haut.
REMARQUE: Si les implants sont retournés à l’envers, une aiguille peut être utilisée pour les remettre en place. - Décongelez la solution des véhicules électriques et mélangez-les avec de l’agitation. Utilisez un vortex pour pulser pendant 3 s.
- Déposez les véhicules électriques sur la surface ti. Dans cette étude, des gouttes de 40 μL de solution de VE sont placées sur le Ti pour immobiliser un maximum de 4 x 1011 VE par implant selon la concentration déterminée par NTA.
- Placer les plaques contenant le Ti sous vide à 37 °C jusqu’à ce que les gouttes soient complètement sèches (~2 h).
REMARQUE: Ajustez le temps en fonction du nombre d’implants et de l’eau présente dans la chambre à vide.
- Placez les implants Ti dans une plaque de 96 puits, avec le côté usiné vers le haut.
Figure 2 : Schéma de la passivation ti et de la fonctionnalisation des VE par coulée de gouttes. Les implants Ti sont d’abord passivés par incubation pendant 30 min dans une solution HNO3 à 30% à température ambiante. Après plusieurs lavages à l’eau DI, le pH atteint le neutre. Ensuite, les implants Ti sont incubés pendant la nuit à température ambiante dans de l’eau DI. Après cela, les implants sont séchés dans des conditions de vide à 40 ° C. Pour l’immobilisation des VE, 40 μL de solution de VE sont déposés sur les implants Ti. Ensuite, les implants sont incubés sous vide pendant 2 h jusqu’à ce que les véhicules électriques soient physiquement liés à la surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Caractérisation de la surface ti
- Étude de libération
- Incuber la surface ti avec 200 μL de PBS filtré à 37 °C.
REMARQUE: PBS est filtré pour éviter les interférences avec la mesure NTA. - Remplacez le PBS à différents points temporels et conservez-le à -80 °C.
REMARQUE : Dans cette étude, des périodes de 2, 6, 10 et 14 jours ont été analysées. - Analyser le PBS stocké pour les études de particules par NTA selon les instructions du fabricant.
REMARQUE: La concentration de particules dans le PBS à différents moments est une représentation du profil de libération des VE au fil du temps.
- Incuber la surface ti avec 200 μL de PBS filtré à 37 °C.
- Études de biocompatibilité
REMARQUE: Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical humain (hUC-MSC) sont obtenues à partir de la biobanque IdISBa conformément aux directives institutionnelles.- Maintenir hUC-MSC dans DMEM faible teneur en glucose complété par 20% FBS jusqu’à l’utilisation. Changez le support deux fois par semaine.
- Pour l’ensemencement cellulaire, lavez les cellules dans des flacons avec 5 mL de PBS deux fois.
- Trypsiniser hUC-MSC en ajoutant 1 mL de solution de trypsine. Assurez-vous qu’il recouvre complètement la monocouche de cellules. Retirer la solution de trypsine et placer la fiole de culture cellulaire à 37 °C pendant environ 2 min. Visualisez le détachement des cellules au microscope. Les cellules détachées apparaîtront de forme ronde et seront en suspension.
- Remettre en suspension des cellules dans le DMEM à faible teneur en glucose avec 1% de VE épuisé FBS.
REMARQUE: Préparez un média complété par 1% de FBS, puis une ultracentrifugeuse à 120 000 x g pendant 18 h pour éliminer les FBS-EV. Il est important d’enlever les VE pour éviter les interférences avec les VE plaquettaires. - Déterminer la concentration cellulaire en comptant le nombre de cellules avec une chambre de Neubauer14.
- Porter hUC-MSC à une concentration de 50 000 cellules/mL.
- Ensemencez 200 μL de la solution cellulaire sur les implants Ti.
- Après 48 h, prélever 50 μL de milieu et effectuer la détermination cytotoxique à l’aide du kit d’activité lactate déshydrogénase (LDH), conformément au protocole du fabricant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La méthode présentée dans cet article permet d’obtenir des disques de titane fonctionnalisés par VE. Les véhicules électriques sont physiquement liés à la surface, ce qui permet une libération prolongée au fil du temps. La quantité de VE libérés peut être mesurée par NTA les jours 2, 6, 10 et 14. Les premières mesures, le jour 2, montrent qu’environ 109 véhicules électriques sont libérés, suivis d’une libération prolongée le jour 6 (~ 108 véhicules électriques); jour 10 (~107 VE) et jour 14 (~107 VE). Cela confirme une libération prolongée, malgré une diminution de la quantité de véhicules électriques libérés au fil du temps.
Figure 3 : Libération accumulative EV de surfaces fonctionnalisées Ti. Les particules ont été libérées dans le PBS les jours 2, 6, 10 et 14 à 37 °C. Les données représentent la moyenne ± SEM avec n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
De plus, les études de biocompatibilité réalisées sur le MSC révèlent qu’après 48 h de croissance cellulaire sur les Ti et les Ti-EV, une amélioration de la biocompatibilité a été observée dans les Ti-VE par rapport au groupe témoin Ti, démontrée par les niveaux d’activité LDH plus faibles du groupe Ti-EV par rapport au groupe Ti. Les milieux ont été recueillis après 48 heures de croissance cellulaire sur implants. Les cellules cultivées directement sur du plastique de culture tissulaire ont été utilisées comme témoin négatif avec une activité de LDH de 0%, tandis que les cellules traitées avec 1% de Triton X-100 ont été utilisées comme témoin positif avec une cytotoxicité de 100%.
Figure 4 : Biocompatibilité cellulaire in vitro des Ti-VE. L’activité de la LDH a été mesurée dans des milieux de culture 48 h après l’ensemencement cellulaire sur les implants. Les cellules ensemencées sur du plastique de culture tissulaire ont été définies comme 0% de toxicité tandis que les cellules ensemencées sur du plastique de culture tissulaire et traitées avec du triton X-100 1% ont été définies comme 100% de toxicité. Une ligne pointillée est indiquée à 30%, ce qui est la valeur maximale acceptée pour la cytotoxicité des dispositifs médicaux selon ISO-10993:5. Les données représentent la moyenne ± SEM, avec n = 15 (trois expériences indépendantes ont été réalisées). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole vise à fournir des instructions claires pour la fonctionnalisation des véhicules électriques sur les surfaces Ti. La méthode présentée est basée sur une stratégie de coulée de goutte, qui est un type de fonctionnalisation de type physisorption. Il existe une mauvaise bibliographie concernant la fonctionnalisation des VE sur les surfaces Ti, bien qu’il existe peu d’études montrant des avantages différents en immobilisant les VE sur Ti10. Quoi qu’il en soit, certaines des stratégies explorées incluent la liaison biochimique8, le piégeage polymère9 ou la coulée de gouttes10. Bien que l’utilisation de revêtements chimiques par liaisons covalentes puisse permettre d’obtenir un revêtement plus homogène avec un degré de fonctionnalisation plus élevé, les réactions chimiques peuvent nuire à la structure et à la fonctionnalité des VE15. La coulée au goutte est une méthode facile et peu coûteuse par rapport au piégeage polymère ou à la liaison biochimique.
Un point important du protocole qui peut être abordé est la source EV. Dans cette étude, les véhicules électriques sont obtenus à partir de PL. Cependant, la méthode de coulée de goutte est adaptable à tout type de VE, car elle est basée sur des interactions physiques. Des études antérieures avec d’autres méthodes présentent des résultats positifs après avoir évalué l’utilisation de ves en culture cellulaire tels que les cellules souches8,10 ou les machropages9. Il est important, en ce qui concerne l’utilisation des véhicules électriques, d’effectuer une caractérisation complète de ceux-ci. L’International Society of Extracellular Vesicles vise à déterminer la plupart des principaux paramètres des VE afin d’assurer la reproductibilité sur le terrain12. D’autres études ont déjà décrit la méthodologie de caractérisation des VE, donc dans ce protocole, nous n’avons pas détaillé les protocoles de microscopie électronique et de technique de transfert western effectués13.
Une étape critique pour la fonctionnalisation du Ti par coulée de goutte est le temps et les conditions autorisés pour la physisorption des VE. Dans le protocole que nous présentons, l’incubation sous vide est effectuée jusqu’à ce que les gouttes soient complètement sèches. Habituellement, 2 h sont nécessaires pour assurer l’évaporation de l’eau à 37 °C et dans des conditions de vide. Cependant, le nombre d’implants fonctionnalisés peut augmenter le temps nécessaire pour assurer l’adhérence correcte des VE sur Ti. Il est important de s’assurer qu’il ne reste plus d’eau avant de procéder à la caractérisation ou aux études fonctionnelles. Cependant, des variations dans le protocole de fonctionnalisation des VE sur Ti peuvent être trouvées dans la littérature. Par exemple, une incubation nocturne à 4 °C sans conditions de vide a déjà été explorée10. Cependant, entre nos mains, l’utilisation de cette méthode a conduit à de mauvais résultats par rapport au sec complet que nous décrivons.
Bien qu’elle ne soit pas effectuée dans le présent protocole, la fonctionnalisation des VE pourrait être évaluée au moyen de différentes méthodologies, entre autres, les changements sur la mouillabilité de la surface pourraient être caractérisés par la mesure de l’angle de contact avec l’eau à la surface; et les changements dans la nature chimique des revêtements par spectroscopie infrarouge transformée de Fourier (FTIR) couplée à la microscopie optique. De plus, les VE peuvent être colorés avec des colorants spécifiques (tels que le colorant PKH26), et les surfaces fonctionnalisées peuvent être imagées par microscopie à fluorescence.
Dans l’ensemble, d’autres tests fonctionnels peuvent être effectués pour explorer la fonctionnalité ostéogénique des dépôts de VE sur Ti. D’une part, les essais d’adhésion ou de croissance cellulaire effectués par microscopie confocale ou activité enzymatique peuvent être la première approche pour tester la fonctionnalité10. Dans cet article, nous avons décrit le test de cytotoxicité comme l’une des premières approches des effets des implants sur les cellules. D’autre part, les tests PCR peuvent être utilisés pour déterminer l’expression génique des marqueurs ostéogéniques en culture cellulaire réalisée sur des disques Ti8,9,10. De plus, la détection de protéines par transfert western peut également suggérer un profil ostéogénique, bien qu’il s’agisse d’une technique semi-quantitative. D’autres techniques de détection de protéines telles que les réseaux de détection ou les kits enzymatiques pourraient également être de bonnes approches pour la performance des expériences de fonctionnalité9. Un test fonctionnel supplémentaire est la détermination du dépôt de calcium par coloration au bleu de calcéine16. Une fois la fonctionnalité in vitro prouvée, d’autres expériences ont pu être réalisées à l’aide de moules animaux8.
En conclusion, la fonctionnalisation de surface permet une meilleure conception thérapeutique des biomatériaux. La combinaison des VE avec des biomatériaux implantables peut permettre une libération prolongée associée à une amélioration de la biocompatibilité et des propriétés ostéogéniques du biomatériau. Il est important d’explorer différentes approches pour la liaison aux VE; ainsi, le moulage par goutte est un point de départ intéressant pour de futures études visant à produire des dispositifs orthopédiques cliniquement disponibles. Le protocole présenté dans ce manuscrit vise à donner un guide facile et reproductible pour les performances des expériences futures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), et PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financés par la taxe de tourisme durable des îles Baléares.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
References
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
